涉及施用胡萝卜素具体地番茄红素用于改善微生物组及其全身性作用的方法与流程

近年来，人们对消化道(gut)微生物群(microbiota，即定殖在特定位置的整个微生物群体)产生了浓厚的兴趣。消化道微生物群与许多人类疾病相关，所述人类疾病的范围从腔内疾病(luminaldisease)诸如炎性肠病(ibd)和肠易激综合征(ibs)，过敏、代谢疾病诸如肥胖和糖尿病，至神经发育疾患。越来越多的证据表明，消化道微生物群在维持消化道和人类整体健康方面发挥着重要作用。

益生元是可以通过帮助人体的天然消化道微生物区系(microflora)生长和/或通过增加其代谢活性对人体产生有益作用的非微生物物质。益生元的概念最早由gibson和roberfroid在1995年提出。益生元的关键方面是它不可被宿主消化，并且它通过对原生有益微生物的积极影响给个体带来健康益处。益生元或益生菌的施用或使用旨在影响消化道环境，即由数万亿共生微生物主导的微生物群，以有益于人类健康。益生元是膳食物质(主要由非淀粉多糖和寡糖组成)。大多数益生元用作，例如饼干、谷类食物、巧克力、涂抹酱和乳制品中的食物成分。通常已知的益生元是：低聚果糖、菊粉、低聚半乳糖、乳果糖和母乳寡糖(worldgastroenterologyorganisationglobalguidelines,probioticsandprebiotics,2017)。

益生元通常与益生菌微生物联合使用。益生菌是活的微生物，可以被制成许多不同类型的产品，包括食物、药物和膳食补充剂。乳杆菌属(lactobacillus)和双歧杆菌(bifidobacterium)的物种最常用作益生菌，但酵母酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和一些大肠杆菌(e.coli)和芽孢杆菌属(bacillus)物种也用作益生菌。数千年来已经用于通过发酵保存食物的乳酸菌(lab)，包括乳杆菌属的物种，可以通过充当食物发酵的剂以及此外潜在地赋予健康益处来提供双重功能。

已经表明益生元和益生菌具有许多健康益处。将益生菌和益生元组合的任何组合物都被称为合生元(symbiotic)。

类胡萝卜素是必需的微量营养素，不能由人类合成，并且必须从食物中获得。番茄红素是番茄、西瓜和一些其他水果的红色色素，是一种主要的类胡萝卜素。目前关于番茄红素对健康的广泛有益作用的共识是，它强大的抗氧化特性可以保护脂蛋白和其他脂质结构免受它们的氧化损伤，这种损伤通常发生在许多病理状况中。

尽管多种益生元组合物是本领域已知的，但是仍然存在对支持有益健康的细菌的生长的有效益生元组合物的需求。本发明旨在解决此需求。

概述

越来越多的证据表明，消化道微生物组在门水平的生态失调可以改变细菌基因及其代谢途径的表现，这继而可能促进许多状况包括肥胖的发病机制的发展。拟杆菌属(bacteroides)的增加与肥胖的发展有关。在我们的研究中，我们观察到用类胡萝卜素持续干预导致拟杆菌门(bacteroidetes)的丰度显著减少。此外，我们观察到放线菌门(actinobacteria)，特别是双歧杆菌(bifidobacteria)的增加。双歧杆菌被认为对其宿主产生积极的健康益处。

因此，我们已经令人惊讶地发现，类胡萝卜素可以对消化道微生物组提供益生元作用。因此，我们提供了用于增加消化道中有益健康的细菌群体的方法、用于预防性和治疗性治疗消化道微生物组的方法、用于治疗性治疗消化道微生物组的组合物以及用作对体内其他器官具有全身性健康有益作用的益生元的类胡萝卜素。

附图

将在以下非限制性附图中进一步说明本发明。

图1.补充7mg和两种30mg番茄红素制剂一个月后消化道微生物组的变化：

第2组-可可脂中的7mg番茄红素。

第3组-可可脂中的30mg番茄红素。

第4组-向日葵油中的30mg番茄红素。

跨组检测到放线菌门的增加和拟杆菌门的减少，在第2组和第4组中厚壁菌门(firmicutes)的相对丰度成比例增加。

图2.持续摄入黑巧克力、其具有7mg番茄红素的制剂和对照番茄红素胶囊一个月后消化道微生物组的变化。

第1组-10g黑巧克力与7mg番茄红素。

第2组-可可脂中的7mg番茄红素，为胶囊形式的对照。

第5组-10g黑巧克力对照。

详细描述

现将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面。除非清楚指示相反情况，否则如此定义的每个方面可以与任何其他一个方面或更多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个特征或更多个特征组合。

本文描述的研究揭示了番茄红素对人类消化道微生物群的有益作用。令人惊讶地，我们发现施用番茄红素产生显著的益生元作用。消化道微生物群谱的积极变化伴随着参与者体内不同参数的全身性改善。该临床研究的结果呈现在实施例中。

因此，在一方面，我们提供了类胡萝卜素化合物在促进受试者的胃肠道中放线菌(例如双歧杆菌)的生长和/或增加其丰度中的用途。

在另一方面，我们提供了类胡萝卜素化合物在制备用于促进受试者的胃肠道中放线菌(例如双歧杆菌)的生长和/或增加其丰度的医学或功能性食品、功能性饮料、营养制品或药物产品中的用途。

在另一方面，我们提供了一种用于促进受试者的胃肠道中放线菌(例如双歧杆菌)的生长和/或增加其丰度的方法，该方法包括施用类胡萝卜素。

因此，在一方面，我们提供了类胡萝卜素化合物在减少受试者的胃肠道中拟杆菌门成员的生长和/或减少其丰度中的用途。

在另一方面，我们提供了类胡萝卜素化合物在制备用于减少受试者的胃肠道中拟杆菌门成员的生长和/或减少其丰度的医学或功能性食品、功能性饮料、营养制品或药物产品中的用途。

在另一方面，我们提供了一种用于减少受试者的胃肠道中拟杆菌门成员的生长和/或减少其丰度的方法，该方法包括施用类胡萝卜素。

在另一方面，我们提供了一种用于预防或治疗受试者的胃肠状况的方法，该方法包括施用类胡萝卜素。

在另一方面，我们提供了一种用于预防或治疗受试者中的状况的方法，所述状况能够依赖于胃肠健康状态或与胃肠健康状态相关，该方法包括施用类胡萝卜素。在一种实施方案中，所述状况是生态失调的结果，即微生物组失衡的结果。

在另一方面，我们提供了一种用于刺激受试者中有益双歧杆菌微生物区系的方法。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和一种或更多种益生菌的组合物。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和任选地一种或更多种益生菌的组合物，所述组合物用于在治疗生态失调、胃肠疾病和/或用于促进受试者的胃肠道中放线菌(例如双歧杆菌)的生长或增加其丰度中使用。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和任选地一种或更多种益生菌的组合物，所述组合物用于治疗能够依赖于胃肠健康状态或与胃肠健康状态相关的疾病。

本文提供的方法和用途给予全身性健康有益作用。

类胡萝卜素化合物是包含长多烯链的四萜类。类胡萝卜素化合物包括叶黄素类(xanthophylls)诸如叶黄素(lutein)和玉米黄质，以及胡萝卜素诸如β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素和番茄红素化合物。

在本文阐述的多个方面的一种实施方案中，类胡萝卜素是叶黄素类。在一种实施方案中，叶黄素类选自由以下组成的组：α-隐黄质(α-cryptoxantin)、β-隐黄质、金盏花红素(adonirubin)、金盏花黄素(adonixanthin)、别黄素(alloxanthin)、amarouciaxanthina、环氧玉米黄质、虾青素、金黄质、眉藻黄素(caloxanthin)、鸡油菌素(cantaxanthin)、辣椒红素(capsanthin)、辣椒红素-5-6-环氧化物、辣椒玉红素(capsorubin)、隐藻黄素(crocoxanthin)、硅甲藻黄素(diadinoxanthin)、硅藻黄素(diatoxanthin)、海胆烯酮(echinenone)、岩藻黄素(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异岩藻黄素(iso-fucoxanthin)、异岩藻黄醇(iso-fucoxanthinol)、叶黄素、黄体黄质(luteoxanthin)、橘黄质(mutatoxanthin)、新黄质(neoxanthin)、nostoxanthin、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)及其组合。

在一种实施方案中，类胡萝卜素是胡萝卜素。在另一种实施方案中，胡萝卜素选自由以下组成的组：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素、链孢红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素及其组合。

在一种实施方案中，以上描述的胡萝卜素和叶黄素类是指其全反式形式。在另一种实施方案中，用于在本发明的方面中使用的叶黄素类和胡萝卜素包括含有一个或更多个顺式双键的衍生物。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物是番茄红素化合物。番茄红素化合物可以包括番茄红素、l-ho-3',4'-二脱氢番茄红素、3,1'-(ho)2-γ-胡萝卜素、1,1'-(ho)2-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素、1,1'-(ho)2-3,4-二脱氢番茄红素。

在一些实施方案中，类胡萝卜素化合物是番茄红素化合物，诸如番茄红素。番茄红素是结构i的开链不饱和c40类胡萝卜素(化学文摘社(chemicalabstractsservice)登记号502-65-8,c40h56)。

结构i

番茄红素天然存在于植物诸如番茄、番石榴、玫瑰果、西瓜和粉红葡萄柚中，并且例如，可以使用任何这样的来源的番茄红素。

用于如本文描述使用的番茄红素可以包含一种或更多种不同的异构体。例如，番茄红素可以包括顺式番茄红素异构体、反式番茄红素异构体以及顺式异构体和反式异构体的混合物。番茄红素可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％(z)-异构体、(全-e)-异构体或顺式异构体，诸如5-顺式异构体或9-顺式异构体或13-顺式异构体，它们相对于反式异构体具有改善的生物可利用度。反式异构体可能在体内或在储存和加工期间异构化成顺式形式。

类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以是天然的，即从天然来源获得，例如从富含类胡萝卜素的水果、蔬菜或其他植物，诸如番茄或甜瓜，或从真菌、藻类或细菌中提取。在一种情况下，类胡萝卜素化合物可以是或包含油树脂，特别地番茄油树脂。

从植物中提取、浓缩和/或纯化类胡萝卜素的一系列方法是本领域已知的。例如，可以采用使用乙醇、dmso、乙酸乙酯、己烷、丙酮、大豆油或其他植物油或非植物油的溶剂提取。

用于如本文描述使用的类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以是合成的，即通过人工手段，例如通过化学合成产生。用于化学合成番茄红素和其他类胡萝卜素的一系列方法是本领域已知的。例如，可以采用基于用于类胡萝卜素合成的标准维蒂希烯化反应(wittingolefinationreaction)方案的三阶段化学合成，其中产生在二氯甲烷(dcm)中的ci5甲磺酸鏻(phosphoniummethanesulfonate)有机溶液和在甲苯中的ci0二醛有机溶液，并且将这两种有机溶液与甲醇钠溶液逐渐混合并经历缩合反应以形成粗制番茄红素。然后可以使用常规技术纯化粗制番茄红素，例如通过将冰乙酸和去离子水添加到混合物中，剧烈搅拌，允许水相和有机相分离，并且萃取含有dcm和粗制番茄红素以及水的有机相。将甲醇添加至有机相中，并且经由减压蒸馏去除dcm。然后将粗制甲醇番茄红素溶液加热和冷却为结晶浆液，过滤并用甲醇洗涤。然后可以将番茄红素晶体重结晶并在加热的氮气下干燥。合成的类胡萝卜素，诸如番茄红素，也可从商业供应商(例如basfcorp,njusa)获得。

相对于天然类胡萝卜素化合物，合成的类胡萝卜素化合物，诸如番茄红素，可以包含比例增加的顺式异构体。例如，合成的番茄红素可以是最多25％的5-顺式异构体、1％的9-顺式异构体、1％的13-顺式异构体和3％的其他顺式异构体，而由番茄产生的番茄红素可以是3％-5％的5-顺式异构体、0％-1％的9-顺式异构体、1％的13-顺式异构体和<1％的其他顺式异构体。因为顺式番茄红素相对于反式番茄红素具有增加的生物可利用度，所以在一些实施方案中合成的番茄红素是优选的。

如以上描述的类胡萝卜素衍生物可以通过类似于以上描述的合成的化学合成或通过对从植物材料中提取的天然类胡萝卜素进行化学修饰来产生。

在本文阐述的多个方面的一种实施方案中，双歧杆菌选自以下之一：青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、链状双歧杆菌(bifidobacteriumcatenulatum)、假小链双歧杆菌(bifidobacteriumpseudocatenulatum)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、角双歧杆菌(bifidobacteriumangulatum)、bifidobacteriumkashiwanohense、齿双歧杆菌(bifidobacteriumdentum)和粪便双歧杆菌(bifidobacteriumstercoris)。

在一种实施方案中，受试者患有具有30kg/m²<bmi<35kg/m²的中度肥胖。

在一种实施方案中，胃肠状况选自由以下组成的组：炎性肠综合征、便秘、腹泻、结肠炎、克罗恩氏病、结肠癌、功能性肠病、肠易激综合征。依赖于消化道健康或与消化道健康相关的状况可以选自代谢综合征、肥胖、心脑血管疾病、神经退行性病症、精神病和皮肤病症。

在特定病症或状况的治疗中有效/有活性的类胡萝卜素化合物的量将取决于病症或状况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，体外或体内测定可以任选性地用于帮助鉴定最佳剂量范围。待在组合物中采用的精确剂量也将取决于施用途径和疾病或病症的严重程度，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。应考虑因素如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄速率、宿主的状况、药物组合、反应敏感性和疾病的严重程度。如本文使用的，术语“有效量”意指当被施用至受试者时，在施用条件下有效实现期望的治疗性或预防性作用的类胡萝卜素化合物的量。如本文使用的受试者是动物，例如哺乳动物，例如人类、犬、猫或马，或非哺乳动物物种，诸如鸟类或鱼类。

可以与一种或更多种益生菌一起施用。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和一种或更多种益生菌的组合物。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和任选地一种或更多种益生菌的组合物，所述组合物用于在治疗胃肠疾病和/或用于促进受试者的胃肠道中双歧杆菌的生长或增加其丰度中使用。

通常，量是按组合物的重量计至少约0.0001％的类胡萝卜素化合物。当意图用于口服施用时，该量可以在按组合物的重量计约0.0001％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含按组合物的重量计约0.0004％至约50％的本发明的活性剂。

制备本发明的一些组合物，使得胃肠外剂量单位包含按重量计约0.0001％％至约2％的类胡萝卜素化合物。

对于通过注射施用，组合物可以包含通常约0.1mg/kg至约250mg/kg动物体重，优选地约0.1mg/kg和约20mg/kg动物体重之间，并且更优选地约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。在一种实施方案中，组合物以约1mg/kg至30mg/kg，例如约5mg/kg至25mg/kg、约10mg/kg至20mg/kg、约1mg/kg至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药方案可以从例如每周一次至每2周一次、每3周一次或每4周一次变化。

对于口服施用，类胡萝卜素(例如番茄红素)的量是每天1-60mg，例如每天约5mg、7mg、10mg、20mg、30mg、40mg。施用可以持续至少4周。

组合物可以是食品补充组合物的药物组合物。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物作为包含可接受载体的组合物的一部分提供。

组合物可以通过任何常规途径施用，包括但不限于口服、局部、胃肠外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、滑膜内、硬膜外、玻璃体内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、经皮、经粘膜、通过吸入或局部，特别地耳、鼻、眼或皮肤或通过吸入。在一种实施方案中，施用是口服。

肠胃外施用包括，例如，静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、滑膜内施用、硬膜外施用、鼻内施用、直肠施用、膀胱内施用、皮内施用、局部施用或皮下施用。优选地，组合物被肠胃外施用。

可接受的载体或媒介物可以是颗粒，使得组合物呈例如片剂或粉末形式。术语“载体”是指与类胡萝卜素化合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这样的药学载体可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体硅、尿素等。此外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。水是一种载体。盐溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂诸如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。

组合物可以呈液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可以用于通过注射、输注(例如iv输注)或皮下进行递送。

当意图用于口服施用时，组合物可以呈固体或液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文认为是固体或液体的形式中。液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当意图用于口服施用时，组合物可以包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或更多种。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或更多种。

作为用于口服施用的固体组合物，组合物可以被配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等形式。这样的固体组合物通常包含一种或更多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下中的一种或更多种：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，诸如藻酸、藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；和着色剂。当组合物呈胶囊(例如，明胶胶囊)形式时，它除了以上类型的物质之外还可以包含液体载体诸如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。

组合物可以被配制成在施用时或施用后的任何预定时间或时间段基本上立即释放类胡萝卜素化合物。在一个实例中，通过适当选择多种制剂参数和成分，包括例如多种类型的控制释放组合物和包衣，来获得控制释放。因此，类胡萝卜素化合物与适当的赋形剂一起配制成药物组合物，该药物组合物在施用后以受控方式释放治疗剂。实例包括单个或多个单位的片剂或胶囊组合物、油性溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子络合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

组合物可以采取一种或更多种剂量单位的形式。

在一种实施方案中，类胡萝卜素化合物的施用是联合疗法的一部分。类胡萝卜素化合物可以与其他疗法共施用或在另一时间给予。

在另一种实施方案中，受试者可以先前已经接受了另一种疗法。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和一种或更多种益生菌的组合物。组合物可以是根据以上实施方案的药物组合物。在一种实施方案中，类胡萝卜素是番茄红素。在一种实施方案中，一种或更多种益生菌选自由以下组成的组：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、肠膜状明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)、acidophilus、acidophilusbifidus、acidophiluslactobacillus、嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、食淀粉乳杆菌(l.amylovorus)、短乳杆菌(l.brevis)、l.caseiimmunitas、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、德氏乳杆菌(l.delbrueckii)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、鸡乳杆菌(l.gallinarum)、瑞士乳杆菌(l.helveticus)、约氏乳杆菌(l.johnsonii)、约氏乳杆菌lc-1、乳酸乳杆菌(l.lactis)、植物乳杆菌(l.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、唾液乳杆菌(l.salivarius)、芽孢乳杆菌(l.sporogenes)、乳酸杆菌(lactobacillus)、lactobacille、乳酸杆菌(lactobacilli)、保加利亚乳酸杆菌(lactobacillibulgaricus)、植物乳酸杆菌(lactobacilliplantarum)、鼠李糖乳酸杆菌(lactobacillirhamnosus)、唾液乳酸杆菌(lactobacillisalivarium)、嗜酸乳杆菌、食淀粉乳杆菌(lactobacillusamylovorus)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(lactobacilluscaseisp.rhamnosus)、卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、鸡乳杆菌(lactobacillusgallinarum)、格氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、乳杆菌gg(lactobacillusgg)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、乳酸乳杆菌(lactobacilluslactis)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳杆菌gg(lactobacillusrhamnosusgg)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、清酒乳杆菌(lactobacillussakei)、芽孢乳杆菌(lactobacillussporogenes)、lactobacilo、lactospores、lc-1、益生菌(probiotics)、probiotiques、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、肠球菌(enteroccousfaecium)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、和婴儿双歧杆菌(bifidobacteriuminfantis)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)或长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)。

在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和一种或更多种益生菌的试剂盒。在另一方面，我们提供了一种包含类胡萝卜素和任选地一种或更多种益生细菌的试剂盒，所述试剂盒用于在治疗胃肠道疾病或与胃肠道相关的疾病和/或用于促进受试者的胃肠道中放线菌(例如双歧杆菌)的生长或增加其丰度中使用。

除非本文另有定义，否则与本公开内容关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管前述公开内容提供了包含在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，但是提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将会理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，本发明的范围应当从附于本公开内容的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。

本说明书中提及的所有文件通过引用以其整体并入本文。

在本文中使用的“和/或”被认为是两个指定的特征或组分中的每一个与或不与另一个一起的具体公开内容。例如“a和/或b”被认为是(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开内容，如同每一个在本文中单独列出一样。除非上下文另有指示，否则上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

在以下实施例中进一步描述本发明。

实施例

材料和方法

研究设计。被招募参与研究的志愿者总数是30名(15名男性和15名女性受试者)40-67岁的白人。将他们随机化并分成五个大小相等的组。组i接受按照专有方案制备的10g黑巧克力与7mg番茄红素的每日剂量，该专有方案确保番茄红素最大程度嵌入巧克力的脂质部分l-tug，以及在巧克力晶体的另一最佳番茄红素涂层上和可可-lycosomedcl的形成。组ii接受每天一粒用中度饱和脂肪酸制备的7mgga番茄红素gal-smfa的胶囊；组iii-每天一粒30mggal-smfa的胶囊；组iv-每天一粒用多不饱和脂肪酸制备的30mgga番茄红素gal-pufa胶囊；组v-每天10mg对照黑巧克力。

三个gal(gal＝配方番茄红素)组在不知情的情况下接受番茄红素胶囊，另外两个组在不知情的情况下接受dc(黑巧克力)产品。

入选标准是：

-签署知情同意的能力；

-轻度至中度吸烟者(≤每天10支)，

-中度肥胖，具有30kg/m²和35kg/m²之间的体重指数，

-具有升高的炎性氧化损伤血清标志物，iod≥40μm/ml，以及氧化应激，ldl-px，elisa×10³≥200，

-在招募前的最后3个月和研究持续时间期间，未参与其他饮食试验，

-在研究持续时间内遵守研究方案的意愿和能力。

排除标准：

-不愿意签署知情同意，

-在研究持续时间内不能遵守方案，

-研究前3个月内有心肌梗死史，射血分数(ef)<45％，

-会影响安全性考虑的重大医学状况(例如，lft显著升高、肝炎、严重皮炎、未控制的糖尿病(uncontrolleddiabetes)、癌症、严重gi疾病、纤维肌痛、肾衰竭、近期cva(脑血管意外)、胰腺炎、呼吸系统疾病、癫痫等)，

-强迫性酒精滥用(>每周10次饮用)，

-或经常暴露于其他滥用物质，

-参与其他营养或药物研究，

-静息心率>100次/分钟或<50次/分钟，

-结核病、hiv或乙型肝炎测试呈阳性，

-不能耐受静脉切开术，

-研究前4周内食用特殊膳食(例如液体蛋白、生食膳食)，

-番茄不耐受。

产品。用于试验的所有产品都由lycotecltd.(cambridge,unitedkingdom)开发和制造。产品被特别地设计为改善中年人、50岁或以上或患有诸如代谢综合征、脂肪肝等的状况的人的番茄红素生物可利用度。它包含磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱用作在脂蛋白细胞内重组装期间掺入番茄红素的主要支架元件，该过程对番茄红素运输是重要的，但在以上个体中受损。

在本研究中，针对两种不同的营养制品应用，存在两种gal制剂。第一种是与smfa的共混物，以促进中小乳糜微粒的形成，该乳糜微粒将通过门静脉输送，用于肝靶向递送番茄红素。第二种是与pufa的共混物，以促进较大乳糜微粒的形成，该乳糜微粒将通过胸导管输送，用于绕过肝的全身血液循环。所有gal产品都制备为明胶胶囊。

对于对照dc和dcl，使用green&black的70％黑巧克力。它由trinitario可可豆制成，并且包含：42％脂肪，其中饱和脂肪是25％；碳水化合物36.5％，其中糖类是28.5％；纤维10％，蛋白质9.1％，盐0.13％。每10g小条(bar)包含1.5mg儿茶素、6.6mg表儿茶素、1.9mg二聚体-b2、7.5mg咖啡因、75mg可可碱、75μg苯乙胺、55μg血清素、<0.1μg白藜芦醇。胶囊和巧克力产品二者均建议在主餐后每天服用一次。

施用时间段是1个月。

方法。

bmi、脉搏率和bp。

体重指数bmi、患者体重及其身高的测量在早上进行，并且bmi以kg/m²计算。休息15min后，在呈坐姿的患者的左臂上记录脉搏率、收缩和舒张血压(sbp和dbp)三次。测量之间的时间大于2分钟。计算每个参数的平均结果。所有的身体和血管参数在上午8am和10am之间记录。

组织氧合。患者的鱼际隆起和前臂肌肉用作评估氧饱和度sto2或氧合血红蛋白和氧合肌红蛋白的组合水平的组织靶。通过连续波长近红外光谱nirs用宽间隙二阶导数对sto2进行评估(inspectra,hutchinsontechnology,mn,usa)。在不同的时间点获取测量。以仰卧位休息15min后开始记录，然后闭塞肱动脉。然后，通过将臂带快速充气至比收缩bp高50mmhg而诱发的停滞性缺血期间继续记录。缺血持续3min，并且之后记录时间再持续5min，直到sto2稳定。然后按照先前描述的[costesf.等人，1999、marseglial.等人，2015]，以％o2/分钟计算闭塞后期间稳定时间的记录信号的充血曲线下面积auc。

样品收集。在上午，在医院里，通过静脉切开术从夜晚禁食后的患者的手臂静脉收集血液。通过离心将血清与剩余的凝结物质分离，然后将等分试样储存在标有编码的管中进行不知情分析，并且储存在-80℃直至使用。

对于从面部皮肤表面收集的样品和耵聍样品，要求所有研究参与者在采样前24小时内避免面部和耳朵的卫生操作，采样在上午与血液样品收集并行进行。简言之，使用聚酯拭子从面部皮肤表面(鼻的两侧)收集样品。在该程序期间，采集两个样品(每侧一个拭子)。将每个收集的样品放在显微镜载玻片的表面上。将第二个显微镜载玻片压在第一个载玻片的表面上。该程序提供一对相同的涂片。对所有具有收集的样品的载玻片进行编码，以便为不知情分析提供样品匿名性，并且储存在-20℃，直至进一步分析。

粪便样品在去医院的前一天上午或晚上收集。他们在其家里方便的时候自行进行这种收集。为该目的，参与者使用由试验团队提供的特殊工具包和样品容器。将收集的样品贴上标签，并且储存在-80℃，直至其分析。

消化道微生物组分析。

dna提取

经由以13,000g离心10min使1ml每个发酵终点(在24h时)沉淀，并且使用powersoil试剂盒方案(mobiolaboratories)从沉淀中提取gdna。在fastprep-24tm匀浆器(mp)中，以6.5m/s的速度在3个15s的循环中进行fastprep珠磨步骤。dna数量和质量使用nanodrop1000(thermoscientific)测量。

16srrna基因文库制备

体外发酵样品的粪便微生物群组成使用基于标签编码的16srrna基因miseq(illumina,ca,usa)高通量测序确定。16srrna基因的v3区使用与nexteraindex试剂盒(illumina)相容的引物扩增，所述引物为nxt_338_f:5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagacwcctacgggwggcagcag-3’(seqidno.1)和nxt_518_r:5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagattaccgcggctgctgg-3’(seqidno.2)[等人1997]。pcr反应和文库制备如[kristensen等人2016]中描述进行。

高通量测序和数据处理

将包含成对末端读段以及对应质量评分的原始数据集合并并且使用在uparse管线(pipeline)中实现的fastq_mergepairs和fastq_filter脚本进行修剪(trimmed)。将最小重叠长度设置为10个碱基对(bp)。合并读段的最小长度是150bp，最大期望误差e是2.0，并且质量评分的第一截断位置是n≤4。使用uparse管线进行从嵌合读段中清除数据集并构建从头操作分类单位(otu)[edgar2013]。greengenes(13.8)16srrna基因集合用作参考数据库[mcdonald等人2012]。微生物生态学定量洞察(quantitativeinsightintomicrobialecology(qiime)开源软件[caporaso等人2010](1.7.0和1.8.0)用于后续分析步骤。基于使用10个二次抽样otu表计算的10unifrac距离度量，用折刀法β多样性工作流(jackknifedbetadiversityworkflow)生成主坐标分析(pcoa)图。将每个折刀法子集采用的序列数设置为最贫乏样品内序列数的90％，因此菊粉和乳果糖16srrna文库实验有10,000个读段/样品，并且hmo16srrna文库/实验有87000个读段/样品。相似性分析(anosim)用于使用加权和未加权(lozupone&knight2005)unifrac距离度量评估组差异，该度量基于稀疏化(10,000个读段/样品)otu表生成。计算登记的属的相对分布，统一化并且汇总在属水平otu表中。使用α稀疏化工作流，计算稀疏化otu表(10,000个读段/样品)的α多样性测量值，表示为观察到的物种值(序列相似性97％)。α多样性的差异使用基于t检验的方法确定，该方法采用在比较α多样性工作流中实现的非参数(montecarlo)方法(999种排列)。anova确定otu与给定类别的定量(相对丰度)关联的显著性，p值经错误发现率(fdr)校正。这些基于被稀疏化至相等的读段数(10,000个读段/样品)的1000个二次抽样的out表来计算。

生物化学。葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度胆固醇、低密度胆固醇、c反应蛋白使用商购可得的分析试剂盒根据制造商的说明(byosystems,r&dsystems)确定。

番茄红素定量分析。所有血清样品中的番茄红素浓度通过经修改的高效液相色谱以一式两份测量。简言之，将400μl血清与400μl乙醇混合，并且用2ml己烷提取两次。将合并的己烷层在真空中蒸发至干燥(scanspeed32离心机)，并且将残留物在样品溶液(无水乙醇-二氯甲烷，5:1，v/v)中重构至100μl的体积。将样本再次离心(以10,000g，15分钟)，并且将澄清的上清液转移至hplc小瓶中。将5微升提取物注入acquityhsst375x2.1mm1.8μm柱(waters，usa)(前面有acquityhsst31.8μmvanguard预柱(waters，usa))中，并且在45℃用流动相(乙腈–0.08％磷酸溶液-叔丁基甲基醚，70:5:25，v/v/v)以0.5ml/min的流速等度洗脱。番茄红素的峰通过光电二极管阵列检测器(waters,usa)在474nm处检测。峰面积使用empower3软件(waters,ma)测量。血清样品中的番茄红素浓度通过参考分析标准品(来自番茄的番茄红素，l9879，sigma,usa)计算。

炎性氧化损伤(iod)。将血清样品在0.05mpbs乙酸盐缓冲液(ph5.6)中孵育过夜，以模拟中性粒细胞脱粒后溶酶体释放期间发生的氧化损伤的类型。次日上午，使用三氯乙酸停止反应。然后使用来自caymanchemical(mc,usa)的试剂和试剂盒通过比色法测量最终产物诸如丙二醛(mda)和其他可能的硫代巴比妥酸反应物质(tbars)的浓度。

ldl-px和脂蛋白o2。如先前描述的[petyaev]，测量血清ldl过氧化物酶蛋白(包括具有超氧化物歧化酶活性的igg)的活性。由血脂/脂蛋白携带的血浆氧通过催化测定术(catalymetry)测量。

统计学。对于正态分布的参数的评估，使用shapiro-wilk方法。然后，将学生t检验应用于配对样品和非配对样品两者。在参数不是正态分布的情况下，使用曼-惠特尼检验和kruskal-wallis检验。anova和ancova用于事后分析(statistica9套装，statsoft；inc.)。认为双尾参数之间的统计显著性是p<0.05。

结果

研究群体的一般特征

参与者的基线特征呈现于表1中。除了他们的bmi增加之外，所有其他测量参数，从心血管至血液生物化学，都在正常范围内。

表1.

消化道微生物组

补充30mg配方番茄红素一个月后消化道微生物组变化的结果呈现于图1和图2中。

在补充ga番茄红素4周后，我们已经检测到干预参与者的消化道微生物群落的变化。在所有干预组中，门水平的相对丰度以放线菌门相对丰度增加的趋势而变化，组iv为4.5％-7.12％(p＝0.51)，组iii为1.12％-3.22％,p＝0.04(fdr校正)，组ii为2.52％-2.85％,p＝0.8。

在所有组中拟杆菌门成员的相对丰度减少，尽管并非统计学上显著的，组iv为4.92％-2.72％，p＝0.52；组iii为12.4％至7.2％，p＝0.8fdr；组ii为31.26％至21.05％，p＝0.43。

在第iv组中变形菌门(proteobacteria)减少(组iv为1.7％-0.15％，p＝0.28)，而其在组iii中增加至0.9％-10％，fdrp＝0.5，在组ii中变形菌门相对丰度保持不变，为0.95％和0.92％，p＝0.95。

来自干预组的消化道微生物群的门组成示于图1中。

组iii和组iv的30mg番茄红素对比组ii的7mg番茄红素，剂量增加也反映为放线菌门的相对丰度增加(组iv为+2.6，iii组为+2.1％，组ii为+0.33％)。

第0周和第4周在物种水平otu的相对丰度示于表1中。

当观察代表拟杆菌门的otu时，变得清楚的是，在gal干预期间，所有gal干预组(组ii、组iii、组iv)中的几种拟杆菌物种的相对丰度减少，但是该影响是otu特有的，因为拟杆菌门的一些成员也增加。

属于普雷沃氏菌科(prevotellaceae)的科的otu，以及粪普雷沃氏菌(prevotellastercorea)、普雷沃氏属(prevotella)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、prevotellacopri、拟杆菌门-椭圆形拟杆菌(bacteroidesovatus)的otu、paraprevotella的out。

dc组v黑巧克力使放线菌门的相对丰度减少4.4％-3.4％，p＝0.7，拟杆菌门在相对丰度方面没有变化，为6.4％-6.3％(p＝0.9)，变形菌门为6.6％-2.4％，p＝0.5。

dc和番茄红素组i：在干预4周后，放线菌门也增加(1.89％至3.3％，p＝0.2)，另一方面拟杆菌门从23.4％稍微增加至25.8％，p＝0.8，厚壁菌门减少(71.7％-67.8％，p＝0.8)，变形菌门从0.49％减少至0.24％，p＝0.5(图2)。

当观察放线菌门和在物种otu水平的变化时，观察到长双歧杆菌和青春双歧杆菌增加，并且在所有gal干预中观察到另一种双歧杆菌物种。

在物种otu水平，组i显示出未分配的otu拟杆菌门显著减少(0.075至0.018，p＝0.3)，青春双歧杆菌增加10倍0.006％-0.06％，p＝0.1。

观察厚壁菌门的成员，在所有干预组中都检测到链球菌属otu的增加。

受益于番茄红素摄入(无论是以胶囊形式还是以巧克力基质)的主要门丰度是放线菌门，并且特别是具有益生有益健康作用的青春双歧杆菌。

血液和组织参数

无论是以胶囊形式还是以巧克力基质摄入番茄红素产品一个月，都会导致其在血清和耳部皮肤排泄物二者中的浓度显著增加(表2)。

表2.补充ga番茄红素一个月后血液和组织参数的变化。

^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.001

补充gal-msfa导致氧化损伤和炎症的标志物的剂量依赖性显著降低。到月底，7mg番茄红素能够将iod和ldl-px降低49μmmda和200elisa单位，而30mg将这些参数相应地降低69和285。30mggal-msfa抑制iod的效果是相同剂量但在gal-pufa制剂中的番茄红素的3倍。这可以潜在地指示这种血液标志物的肝来源的可能性。两种番茄红素制剂对ldl-px的作用相似(表2)。

具有或没有番茄红素的dc具有与7mg番茄红素相似的对iod的抑制的作用。虽然这两种巧克力产品均能降低ldl-px，但它们的效果低于番茄红素本身。

施用gal制剂或番茄红素与dc的复合物，导致由肝组装和产生的空腹脂蛋白谱的显著变化。gal-msfa以剂量依赖的方式降低ldl浓度和甘油三酯二者。这种30mg剂量的番茄红素的肝靶向制剂能够将第一参数降低17mg/dl，并且将第二参数降低18mg/dl。补充gal-pufa导致ldl降低13mg/dl，并且甘油三酯仅降低3mg/dl。具有黑巧克力的l-tug复合物中的番茄红素也能够降低ldl，然而，摄入对照dc引起的变化并不显著(表2)。试验结束时，hdl、葡萄糖以及肝酶alt和ast的血清浓度不存在变化(结果未示出)。

所有组中的分子氧代谢都存在显著改善。在补充gal-msfa的组中，o2浓度及其通过血液脂蛋白的运输增加18％-19％。在接受gal-pufa的组中，这一增加是较低的，增加了12％。在接受对照dc的组中，脂蛋白o2的增加最高，增加了44％。血浆氧运输的这些变化转化为对外周组织氧合的益处，但在dc对照组中没有。所有番茄红素产品的摄入导致显著加强骨骼肌中的组织氧合。gal-msfa的施用证明该参数变化的剂量依赖性作用。然而，gal-pufa制剂中的30mg番茄红素比相同剂量但在gal-msfa制剂中的番茄红素多25％的有效性(表2)。

代谢综合征和衰老的发展伴随着持续的、通常处于亚临床水平的炎性和氧化损伤过程，这可能导致肝代谢、血管功能的变化、体重增加和亚临床全身组织缺氧的发展。在我们的研究中，我们观察到补充番茄红素，特别是针对中年人的有效生物可利用度而配制的番茄红素，具有抗氧化、抗炎和降脂作用，这与更早的报告一致[petyaev,2012]。血液标志物的这些变化伴随或可能导致外周组织sto2的改善。对该参数的主要贡献者是骨骼肌呼吸，尽管皮肤氧合也是其中的一部分。

食物中存在许多不可完全消化的分子；因此，它们可以到达结肠及其微生物群。类胡萝卜素和番茄红素特别地属于这些类型的可部分消化的分子。在我们的研究中，我们观察到中度肥胖的中年人连续一个月定期摄入无论是以胶囊形式还是以黑巧克力基质的7mg或30mg的ga番茄红素，都会导致消化道微生物群谱的显著变化，并且特别是青春双歧杆菌群体的增加。双歧杆菌益生菌是最著名的益生菌之一，其不仅在消化道环境中，而且在全身也具有宽范围的有益健康的特性。这涉及其控制细菌和病毒病原体、刺激局部肠道和全身免疫系统、改善脂质代谢和体重管理的能力[servin,2004，和amyo’callaghan]。双歧杆菌的损失可能是与衰老相关的重要因素[arboleya,2016]。因此，观察到的炎性标志物、血脂的变化以及年龄相关的组织氧合和其他参数的变化不仅可能是体内番茄红素积累的结果，还可能是消化道中青春双歧杆菌群体恢复的结果。

有趣的是，观察到的番茄红素对消化道细菌、炎症和氧化的血液标志物、由肝产生的脂质和由皮肤产生的脂质(皮脂)以及外周组织氧合的作用都是剂量依赖性的。这指示番茄红素的这种可能的直接和并行参与独立地影响体内的这些不同靶，或者存在将消化道细菌，并且特别是青春双歧杆菌群体，与番茄红素可以控制的血液、肝和其他组织紧密连接的“桥梁”，信号传导和/或代谢。

无论番茄红素分子直接影响青春双歧杆菌的生长，还是它是经由体内组织(包括其肠和结肠)的亚临床炎症和氧合的全身变化的间接作用。消化道组织的新陈代谢和生理学的改善可以导致其更好地控制微生物群并且促进有益健康的细菌的生长。

无论番茄红素的益生元作用的性质是直接还是间接的，据我们所知，这是关于摄入类胡萝卜素具有这种新特性的首次报告。据我们所知，尽管益生菌靶不同，这还是证明黑巧克力具有类似影响的首次研究。

总之，观察到的番茄红素补充的全身性作用，包括消化道、血液、肝脂质代谢的改善，可能不仅是由于类胡萝卜素和黑巧克力本身的特性，而且也是由于它们作为双歧杆菌的有效益生元的能力。

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