用于细胞保存的保护剂的制作方法

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于细胞保存的保护剂。

背景技术：

：免疫治疗(immunotherapy)主要是利用自身免疫系统的强化或是外加赋予免疫能力来预防及治疗疾病的方式。免疫治疗是利用免疫系统达成对疾病高专一性、高效率以及持久性的治疗系统。人外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)是免疫治疗的重要原料，pbmb可以在体外被诱导分化为多种免疫细胞，例如细胞因子诱导杀伤细胞(cik)、树突状细胞(dc)、自然杀伤细胞(nk)以及自然杀伤性t淋巴细胞(nkt)。这些免疫细胞在抗感染、抗肿瘤方面有重要作用。免疫细胞化学的抗肿瘤能力会随着人年龄的增长而减弱，因此将免疫细胞分离并在体外低温保存是保留种子细胞的有效方法。pbmc的低温保存也成为免疫治疗的重要环节。目前，细胞的保存主要是通过缓慢降温的方式将细胞置于-156℃的气相液氮或-196℃的液氮中，以暂停细胞的代谢活动，将细胞的特性保存起来。在降温过程中细胞内外介质会形成冰晶，将对细胞造成致命损伤。为避免损伤的发生，降温前需将细胞悬浮于低温保护剂中。目前最常用的低温保护剂是10％二甲基亚砜(dmso)并配合80％-90％的胎牛血清(fbs)或人血清(has)。dmso是一种小分子量有机物，极易溶于水或其它有机溶剂，容易穿透细胞膜。dmso溶于水后可使水的冰点降低15-20℃，并抑制冰晶生长。因此dmso可减少细胞在降温过程中受到损伤。但dmso亦具有一定的生物毒性，高浓度的dmso或细胞在dmso中悬浮时间过长会导致蛋白质等生物大分子变性。更严重的是，国内外已有病例报道指出细胞回输液中残留的dmso会引起患者头晕、呕吐、腹泻、胃痉挛等副作用。因此，寻找dmso的替代物，以降低dmso的使用浓度成为细胞低温保存保护剂的优化方向之一。fbs或has中的蛋白可与细胞膜结合，使细胞免受冰晶损伤，同时维持细胞渗透压为细胞提供保护。但是使用fbs或has也会有加大的风险。fbs中通常会携带动物源性病毒。例如，欧洲、澳洲、美洲都曾发生过疯牛病，上述产地来源的fbs则很可能会受到污染，携带有疯牛病病毒。若使用fbs作为冻存保护剂，也会将细胞污染，进而在回输时将病毒传播给患者。此外，pbmc冻存也存在一些通病，例如保存期限较短、细胞复苏后活率不高、扩增能力受损等。因此，目前用于细胞保存的保护剂仍有待解决。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了用于细胞保存的保护剂，所述保护剂不仅可以在低温保存下避免细胞损伤，复苏后的细胞具有较高的活率及较强的扩增能力；而且还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率；细胞毒性低，具有广泛的应用前景。本发明提出了一种用于细胞保存的保护剂。根据本发明的实施例，所述保护剂包括：dmso、小分子醇和酰胺。针对传统pbmc低温保存保护剂中的dmso，发明人发现采用小分子醇和酰胺替代部分dmso，不仅可以避免pbmc在低温保存条件下造成细胞损伤，而且降低了dmso浓度，以降低细胞毒性，保证使用安全。针对传统pbmc低温保存保护剂中的fbs或has，发明人发现采用小分子醇和酰胺替代fbs或has，还可以避免细胞污染、降低病毒感染的风险。另外，采用上述配方的保护液还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率；细胞毒性低，具有广泛的应用前景。根据本发明的实施例，上述用于细胞保存的保护剂还可以具有下列附加技术特征：根据本发明的实施例，所述dmso含量小于10质量％。采用1，2-丙二醇和甲酰胺替代部分dmso，使得保护剂中dmso含量所述dmso含量小于10质量％时，不仅可以进一步避免pbmc在低温保存条件下造成细胞损伤，而且进一步降低了细胞毒性，保证使用安全。根据本发明的实施例，所述小分子醇选自1,2-丙二醇、d-甘露醇和山梨糖醇的至少之一。由此，可以进一步避免pbmc在低温保存条件下造成细胞损伤，降低细胞毒性。根据本发明的实施例，所述酰胺选自甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺和己酰胺的至少之一。由此，可以进一步避免pbmc在低温保存条件下造成细胞损伤，降低细胞毒性。根据本发明的实施例，所述保护剂进一步包括下列至少之一：乙酸盐、n-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽和糖醛酸。乙酸盐可以调节细胞的渗透压，减缓细胞在低温环境下的水分流失。n-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽和糖醛酸不仅能起到低温保护作用，还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率。根据本发明的实施例，所述乙酸盐选自三甲铵乙内酯、十二烷基乙酸盐、十四烷基乙酸盐和十六烷基乙酸盐的至少之一。由此，可以调节细胞的渗透压，减缓细胞在低温环境下的水分流失。根据本发明的实施例，所述糖醛酸选自半乳糖醛酸、d-葡萄糖醛酸和d-甘露糖醛酸的至少之一。由此，不仅能起到低温保护作用，还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率。根据本发明的实施例，所述保护剂进一步包括溶剂，所述溶剂选自氯化钠和水的至少之一。由此，以便于溶解其他组成，形成均一混合液。根据本发明的实施例，所述保护剂还包括医用级别的高分子聚合物，所述高分子聚合物选自多元醇或多元糖类聚合物。由此，可以进一步降低低温保存下的细胞损伤程度，提高复苏后的细胞的活率及扩增能力；而且还有助于在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，维持细胞活率。同时，进一步降低细胞毒性。根据本发明的实施例，所述高分子聚合物选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖聚合物、聚乙烯醇、α-纤维素和甲基纤维素的至少之一。由此，可以进一步降低低温保存下的细胞损伤程度，提高复苏后的细胞的活率及扩增能力；而且还有助于在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，维持细胞活率。同时，进一步降低细胞毒性。根据本发明的实施例，所述保护剂不含动物血清、血浆或细胞培养基。由此，可以避免病毒感染，并维持细胞原始状态。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的细胞活率检测分析示意图；图2显示了根据本发明一个实施例的细胞扩增检测结果示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中使用到的试剂和设备如表1所示。表1试剂和设备名称生产厂家二甲基亚砜(dmso)sigma1，2-丙二醇生工甲酰胺sigma三甲铵乙内酯sigma谷胱甘肽sigma半乳糖醛酸sigma聚乙二醇sigma聚乙烯吡咯烷酮sigma聚蔗糖sigman-乙酰半胱氨酸sigma氯化钠注射液利尔康淋巴细胞分离液天津灏洋免疫细胞扩增试剂盒深圳佳科生物低温离心机thermo全自动血液分析仪迈瑞luna荧光计数仪--流式细胞仪bd实施例1采集志愿者100ml外周血，1500g离心10min，吸取上层血浆，弃去。加入适量氯化钠注射液稀释后，将血液缓慢加铺于淋巴细胞分离液上层，然后800g离心15min。最后吸取白膜层，即得到pbmc。使用全自动血液分析仪测得本次制备获得pbmc数量约为1.53×10^8。将细胞悬液平均分成a、b两组，离心，弃去上清液，得到pbmc沉淀。向a组细胞沉淀加入约7ml的由10％dmso和90％has组成的低温保护剂，向b组细胞沉淀加入7ml表2所示低温保护剂，轻轻将细胞沉淀吹散，在室温下静置约5min后，将两组细胞悬液分装于2ml规格的低温冻存管中，每管约1ml细胞悬液。表2保护剂成分浓度成分dmso4质量％聚蔗糖1，2-丙二醇3质量％三甲胺乙内酯甲酰胺3质量％n-乙酰半胱氨酸聚乙二醇3mg/ml谷胱甘肽聚乙烯吡咯烷酮3mg/ml半乳糖醛酸将冻存管贴上标签，置于异丙醇程序降温盒中，暂存于-80℃冰箱中过夜，第二天将细胞冻存管转至中保存，存储时间约一个月。一个月后，从液氮中取出两组细胞的低温冻存管，将其置于37℃水浴中，使细胞冻存液完全融化。将分装的细胞冻存液置于15ml离心管中，同组细胞转移至同一离心管中。加入5ml左右的氯化钠注射液，将细胞轻轻吹散，然后400g离心5min，保留第一次清洗的上清液用于无菌检测。再重复清洗一次细胞后将细胞悬浮于5ml的氯化钠注射液中。两组细胞各取100μl细胞悬液置于pe管中，分别用于测量细胞活率并记录数据。按照所购买的免疫细胞扩增试剂盒建议的操作流程对细胞进行诱导扩增，培养约14天，并在第14天对扩增后的细胞计数。培养结束后，对细胞进行流式检测，检测其中cd3+cd56+的比例。测试结果：(1)无菌检测结果：表3a组无菌检测结果表4：b组无菌检测结果上表中ftm代表硫乙醇酸盐流体培养基检测法，tsb代表胰酪大豆胨液体培养基检测法。结果阴性记录为“-”，结果阳性记录为“+”。从检测结果可以看出，使用本发明的低温冻存保护液，无细菌污染产生。(2)细胞活率a组使用经典低温冻存保护剂10％dmso和90％has，b组使用本发明描述的低温冻存保护剂，将细胞复苏后测量活率。结果如图1所示，a组活率平均值约为86％，b组活率平均值为97％。结果表明本发明中的低温冻存保护剂的效果由于经典的低温保护剂配方。(3)细胞扩增如图2所示，在两组细胞接种数量相同的情况下，经过相同的培养天数后，a组细胞扩增倍数约为23，b组细胞扩增倍数约为29，由此可以看出b组的扩增能力更强。因此，本发明的低温保护剂的低温保护效果优于经典的低温保护剂，能够使细胞的扩增能力免受低温损伤。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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