红细胞冻存液及快速冻存方法与流程

本申请属于低温医学技术领域，具体涉及红细胞冻存技术。

背景技术：

目前，红细胞冻存过程中常用的低温保护剂主要分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中渗透性保护剂包括甘油、dmso等，非渗透性保护剂包括海藻糖、葡聚糖等。例如，rowe的低浓度甘油保护剂包含28％甘油、3％甘露醇、0.65％氯化钠(a.w.rowe,e.eyster,a.kellner,liquidnitrogenpreservationofredbloodcellsfortransfusion:alowglycerol—rapidfreezeprocedure,cryobiology.5(1968)119–128)；meryman的高浓度甘油保护剂包含6.2m57％甘油、0.14m3％乳酸钠、5mm0.03％氯化钾、5mm0.2％磷酸钠(h.t.meryman,m.hornblower,amethodforfreezingandwashingredbloodcellsusingahighglycerolconcentration,transfusion.12(1972)145–156)；c.pellerin-mendes的葡聚糖保护剂包含30％葡聚糖、0.605％nah2po4、0.715％na2hpo4，海藻糖保护剂包含1m海藻糖、0.605％nah2po4、0.715％na2hpo4(c.pellerin-mendes,l.million,m.marchand-arvier,p.labrude,c.vigneron,invitrostudyoftheprotectiveeffectoftrehaloseanddextranduringfreezingofhumanredbloodcellsinliquidnitrogen,cryobiology.35(1997)173–186)。

临床上常用的红细胞冻存方法主要包括4℃下的短期保存和-80℃高浓度甘油下的慢速冻存。前者的保质期短且容易受到污染；后者的甘油浓度高达40％，需要繁琐的甘油化和去甘油化过程，会耗费大量的时间和精力，极有可能耽误使用。此外，在-196℃下使用低浓度甘油的快速冷冻法虽然将甘油浓度降低至20％以下，但是仍需要繁琐的去甘油化过程。

因此，本领域迫切需要开发简单、高效、相对安全的红细胞冻存方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的红细胞冻存液以及红细胞冻存混合溶液，以解决现有红细胞冻存技术繁琐、耗时等问题。同时，本发明还提供了与上述冻存液相适应的红细胞冻存方法和去甘油化洗涤方法。

本发明利用渗透性保护剂(如甘油等)和非渗透性保护剂(如海藻糖等)配制成红细胞冻存液。在该冻存液悬浮红细胞时，非渗透性保护剂可以使红细胞轻微脱水，从而降低快速冷冻过程中的胞内冰的发生率；而渗透性保护剂可以通过防止过量的细胞体积减少和致命的溶液浓度，从而避免溶质损伤。

在一个方面，本发明提供了一种红细胞冻存液，所述红细胞冻存液含有渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中在将红细胞冻存液与红细胞悬浮液混合获得的冻存混合溶液中，渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v(以重量体积百分比计)，非渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v。

在一个方面，本发明提供了一种红细胞冻存混合溶液，所述冻存混合溶液通过将红细胞冻存液与红细胞悬浮液混合获得，所述红细胞冻存液含有渗透性保护剂和非渗透性保护剂，其中在冻存混合溶液中渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v，非渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v。

在另一个方面，本发明提供了一种红细胞(快速)冻存方法，所述方法包括以下步骤：

将红细胞配置成红细胞悬浮液，将红细胞悬浮液与上述红细胞冻存液混合获得红细胞冻存混合溶液，在室温下静置后冻存于冻存容器中，

其中红细胞冻存液含有渗透性保护剂和非渗透性保护剂，

其中在冻存混合溶液中渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v，非渗透性保护剂的浓度为2.5％w/v至15％w/v。

在一些实施方案中，渗透性保护剂包括甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇等。

在一些实施方案中，非渗透性保护剂包括海藻糖、蔗糖、葡聚糖、羟乙基淀粉等。

在一些实施方案中，红细胞冻存液和/或红细胞冻存混合溶液还包含氯化钠。

在一些实施方案中，红细胞冻存液和/或红细胞冻存混合溶液中的氯化钠浓度为0.9％w/v。

在一些实施方案中，红细胞冻存液由渗透性保护剂、非渗透性保护剂、氯化钠和水组成。

在一些实施方案中，红细胞冻存液由甘油、海藻糖、氯化钠和水组成。

在一些实施方案中，红细胞冻存液含有5％w/v至30％w/v的渗透性保护剂和5％w/v至30％w/v的非渗透性保护剂。

在一些实施方案中，红细胞冻存液由5％w/v至30％w/v的渗透性保护剂、5％w/v至30％w/v的非渗透性保护剂、0.9％w/v氯化钠和水组成。

在一些实施方案中，红细胞冻存液由5％w/v至30％w/v的甘油、5％w/v至30％w/v的海藻糖、0.9％w/v氯化钠和水组成。

在一些实施方案中，红细胞是人红细胞。

在一些实施方案中，通过将全血离心去血浆来获得红细胞。

在一些实施方案中，使用0.9％w/v氯化钠溶液将红细胞配制成红细胞悬浮液。

在一些实施方案中，红细胞冻存液与红细胞悬浮液等体积。

在一些实施方案中，添加红细胞冻存液之前的红细胞悬浮液中的红细胞压积为10％至40％，例如10％、20％、30％和40％。

在一些实施方案中，添加红细胞冻存液之后的红细胞冻存混合溶液中的红细胞压积为5％至20％，例如5％、10％、15％和20％。

在一些实施方案中，在室温下静置的时间为5至15分钟。

在一些实施方案中，冻存容器中的降温速率达到500℃/min以上，例如500～3000℃/min。

在一些实施方案中，在液氮中进行冻存(液氮温度通常为-196℃)。

在另一个方面，本发明还提供了一种通过上述红细胞冻存方法冻存的红细胞的去甘油化洗涤方法，所述方法包括：

(1)将冻存的红细胞在水浴锅中复温，融化后离心去除上清液，

(2)加入红细胞洗涤液，充分混匀后离心去除上清液，

其中红细胞洗涤液为生理盐水，即0.9％w/v氯化钠溶液。

在一些实施方案中，水浴复温的温度为37至45℃，优选37℃。

在一些实施方案中，其中步骤(2)重复2至3次。

在一些实施方案中，每次加入的红细胞洗涤液与复温后的红细胞悬浮液等体积。

本发明提供的红细胞冻存液和冻存方法具有以下优点：

1.红细胞冻存液的成分简单，仅包含一种渗透性保护剂(如甘油)和一种非渗透性保护剂(如海藻糖)。本发明的红细胞冻存液可以达到目前高浓度甘油慢速冷冻保存方法的保存效果(冻后存活率达95％以上)，而甘油浓度大大降低至20％以下，使得添加冻存液和去除冻存液的时间大大缩短，整个冻存及复温洗涤过程所需的时间不到30分钟，实现了高效、快速的冻存及复温洗涤过程。

2.本发明中冻存的红细胞的去甘油化洗涤过程使用的洗涤液为0.9％氯化钠溶液，没有额外添加复杂的物质，方便易得，可以是市售的生理盐水溶液，也可以是根据配方自行配制的氯化钠溶液(渗透压要求在280-310mmol/l范围内)。每次洗涤也无需放置很长时间，洗涤2至3次即可获得符合标准的红细胞盐水悬浮液。洗涤时间大大缩短，同时洗涤回收率可达85％以上。

实施例

下面结合实施例进一步阐述本发明。

实施例

使用12％甘油(gly)+20％海藻糖(tre)的红细胞冻存液进行快速冻存，具体的实验方法及实验结果如下：

实验方法

1.红细胞冻存液的配制：红细胞冻存液的配方为12％甘油、20％海藻糖、0.9％氯化钠和水。配置1000ml冻存液的方法为：添加120g甘油，添加200g海藻糖，添加9g氯化钠，加纯水定容至1000ml，混匀。

2.红细胞预处理：取适量去白红细胞(在4℃冰箱内保存少于15天)，加入0.9％w/vnacl溶液离心去除上清液(重复3次)，得到压积约为80％的红细胞溶液。加入适量0.9％w/vnacl溶液以获得25ml的压积约为40％的红细胞悬浮液，置于4℃冰箱中备用。

3.添加冻存液：将上述预处理好的25ml红细胞悬浮液加入冻存管中，再加入等体积的上述冻存液，混匀，在室温下静置5分钟。

4.冻存红细胞：将上述冻存管垂直放入液氮中，冷冻30分钟后迅速取出。

5.去甘油化洗涤过程：将取出的冻存管置于37℃水浴锅中复温，取50ml复温后的红细胞悬浮液，以3000g离心5分钟，去除上清液后缓慢加入100ml的0.9％w/v氯化钠溶液，充分混匀(即第一次洗涤)。离心去除上清液后重复以上操作(即第二次和第三次洗涤)。经三次洗涤后，去除上清液后根据需要加入适量生理盐水配置成所需红细胞盐水悬浮液。

上述方法的整个过程在30分钟以内。

实验结果

1.红细胞的冷冻回收率：取6组冷冻复温后的25ml红细胞悬浮液，用分光光度计检测离心后上清液在415nm处的吸光度a。另取一组只添加了生理盐水但并未冷冻的组作为阳性对照组(表示0％溶血)，检测其在415nm处的吸光度a0；再取一组添加了纯水且反复冻融3次的组作为阴性对照组(表示100％溶血)，检测其在415nm处的吸光度a1。通过下式计算红细胞的冷冻回收率：

表1.红细胞在6％gly+10％tre下快速冻存的冷冻回收率

2.红细胞冻存后每次洗涤时的红细胞溶血率：取6组冷冻复温后的25ml红细胞悬浮液，每次洗涤添加等体积的25ml的0.9％氯化钠溶液，混匀静置离心后用分光光度计检测上清液在415nm处的吸光度a，由于稀释了2倍，所以还需乘以稀释倍数n＝2。a0和a1与上述阳性对照组的吸光度a0以及阴性对照组的吸光度a1相同。三次洗涤后的溶血率等于三次洗涤溶血率之和。通过下式计算红细胞冻存后每次洗涤时的红细胞溶血率：

表2.红细胞在6％gly+10％tre下快速冻存后每次洗涤的红细胞溶血率

3.红细胞冻存后的低温保存回收率

低温保存回收率＝冷冻回收率-洗涤溶血率

表3.红细胞在6％gly+10％tre下的低温保存回收率

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