干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法与流程

本发明属于生物材料冻存
技术领域：
，尤其涉及一种临床可用的干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法。
背景技术：
：间充质干细胞广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，也可从胎儿脐血中分离得到，此外还存在于胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。间充质干细胞具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，间充质干细胞不仅能够向多种组织和细胞分化，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定。1995年间充质干细胞首次应用于临床应用，2012年osiris公司申报间充质干细胞作为药品上市得到加拿大fda的批准，间充质干细胞的临床应用达到一个历史性高度。间充质干细胞目前已顶替胎盘干细胞而成为生物医学研究中首选的种子细胞，并被广泛应用于各种疾病的基础及临床研究。10至20年后，干细胞将会成为一种基本的医疗技术，帮助人们解决现在无法克服的疾病。目前干细胞治疗疾病的途径大多采用静脉输注，这种产品属于药品中的注射剂。作为药物开发干细胞制剂是干细胞产品最终能够真正受用于人类的最好的方式。因此，很多大型生物公司已着手将干细胞开发为干细胞制剂，对于药品来说需要考虑产品的稳定性及有效性，因为干细胞属于生物活性物质，对于开发药物来说，如何将干细胞进行稳定的储存是转化的关键的工艺。实验室中干细胞的冻存手段大多采用二甲基亚砜、牛血清、培养液等按照一定比例混合后进行细胞的冻存，但是牛血清为动物来源物质，不可应用于临床产品中。也有公司采用其他产品进行开发，如授权号为cn103070161b的专利《一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法》中采用药物，人自体血清，dmem-lg培养基等成分组成，人自体血清存在较大的差异，可在临床产品中使用，但作为产品存在质量的不一致性，这在后期的应用会对人体造成很大的风险。目前也有一些冻存液的开发致力于临床应用，如授权号为cn101990888b的发明专利《干细胞冻存液及干细胞的冻存方法》中提供了一种干细胞冻存液及其冻存方法，授权号为cn201010246409.3的专利《一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液》，但是这种冻存液中的主要成分是人ab血清或者血浆，这种人源非产品成分的使用存在获取有限，且不是临床可用的产品，如在干细胞制剂及临床中使用，存在来源不可控，质量标准不明确，产品稳定性不可控的风险。授权号为cn201110419684.5的发明专利《一种间充质干细胞冻存液及其制备方法》中制备的干细胞冻存液取得了较好的细胞冻存效果，细胞活力可达到90%以上，但是细胞冻存液中没有提及细胞的分散程度，细胞的分散程度可影响产品临床应用的安全性。从以上的分析中可以看出，虽然现在已有相关的细胞冻存液，但是这些冻存液在应用于干细胞临床的过程中，还存在一定的问题。技术实现要素：针对现有技术中干细胞冻存液在临床应用中存在的上述缺陷和不足，本发明提供了一种可用于临床的干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法，通过本发明的技术方案，可以为临床提供质量稳定，标准明确的干细胞冻存液。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：本发明第一方面，提供一种干细胞冻存液，包含以下组分：人血白蛋白注射液、低分子肝素钙、复方氨基酸注射液、复方电解质注射液、右旋糖苷-葡萄糖注射液和抗氧化剂。优选地，所述人血白蛋白注射液的体积份数为10-30。更优选地，所述人血白蛋白注射液的体积份数为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，所述复方氨基酸注射液的体积份数为10-30。更优选地所述复方氨基酸注射液的体积份数为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，所述复方电解质注射液的体积份数为20-50。更优选地，所述复方电解质注射液的体积份数为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、42、45、48或50。优选地，所述右旋糖苷-葡萄糖注射液体积份数为20-50。更优选地，所述右旋糖苷-葡萄糖注射液体积份数为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、42、45、48或50。优选地，所述低分子肝素钙的浓度为2000-10000iu/ml，所述低分子肝素钙的体积份数为2-5份。更优选地，所述低分子肝素钙的体积份数为2、3、4或5份。优选地，所述干细胞冻存液含包括抗氧化剂，所述抗氧化剂的体积份数为1-5。更优选地，所述抗氧化剂的体积份数为1、2、3、4或5。优选地，所述抗氧化剂为维生素c注射液。优选地，所述干细胞冻存液还包括dmso，所述dmso的体积份数为2-10。更优选地，所述dmso的体积份数为2、3、4、5、6、7、8、9或10。本发明第二方面，提供一种干细胞冻存及复苏方法，包括以下步骤：1）配制干细胞冻存液，按照以下比例进行冻存液的配制：按照体积份数，取人血白蛋白注射液10-20份、浓度为2000-10000iu/ml的低分子肝素钙2份、复方氨基酸注射液15份、复方电解质注射液35份、右旋糖苷-葡萄糖注射液25份、维生素c注射液3份混合均匀，获得干细胞冻存液；2）冻存：取干细胞3组，置于冻存管中，第一组为1e6/支，第二组为5e6/支，第三组为1e7/支，每组各管加入1ml步骤1）中所述干细胞冻存液，缓慢吹打混匀，采用程序降温盒降温至-80度，-80度下静置24h，转入液氮罐中冻存；3）复苏：从液氮罐拿出步骤2）中冻存的干细胞，迅速置于37度水浴锅中，快速振动，1分钟内完成复苏，获得复苏的干细胞。优选地，步骤1）中，所述干细胞冻存液还包括dmso，所述dmso的体积份数为2-10。优选地，所述干细胞为间充质干细胞。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用的成分均为临床应用的药品及美国药典批准的药用辅料，且均为可静脉输注的产品，这些产品均具有明确的产品质量标准，因此对于人体的使用是安全有效的。本发明的冻存液加入了预防间充质干细胞聚集成团的成分，提高了间充质干细胞临床应用的安全性。本发明中加入了抗氧化剂、营养成分及调节渗透压的产品，能够减少干细胞在冷冻过程中所受到的损伤，显著提高干细胞的存活率及功能。附图说明图1a为实施例1中密度为1e6的干细胞冻存复苏后培养0h的细胞分散度显微图；图1b为实施例1中密度为5e6的干细胞冻存复苏后培养0h的细胞分散度显微图；图1c为实施例1中密度为1e7的干细胞冻存复苏后培养0h的细胞分散度显微图；图2a为实施例1中密度为1e6的干细胞冻存复苏后培养1h的细胞分散度显微图；图2b为实施例1中密度为5e6的干细胞冻存复苏后培养1h的细胞分散度显微图；图2c为实施例1中密度为1e7的干细胞冻存复苏后培养1h的细胞分散度显微图；图3a为实施例1中密度为1e6的干细胞冻存复苏后培养24h的细胞分散度显微图；图3b为实施例1中密度为5e6的干细胞冻存复苏后培养24h的细胞分散度显微图；图3c为实施例1中密度为1e7的干细胞冻存复苏后培养24h的细胞分散度显微图；图4a为实施例1中密度为1e6的干细胞冻存复苏后培养48h的细胞分散度显微图；图4b为实施例1中密度为5e6的干细胞冻存复苏后培养48h的细胞分散度显微图；图4c为实施例1中密度为1e7的干细胞冻存复苏后培养48h的细胞分散度显微图；图5为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd90的结果；图6为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd105的结果；图7为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd73的结果；图8为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd34的结果；图9为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd45的结果；图10为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd14的结果；图11为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测hla-dr的结果；图12为实施例2中干细胞冻存9个月复苏检测cd19的结果；图13为实施例2中干细胞冻存9个月复苏后进行成脂分化的结果；图14为实施例2中干细胞冻存9个月复苏后进行成骨分化的结果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本
发明内容做进一步详细说明。实施例1本实施例提供一种干细胞冻存液，按照体积份数，包含人血白蛋白注射液10份、浓度为2000-10000iu/ml的低分子肝素钙2份、复方氨基酸注射液15份、复方电解质注射液35份、右旋糖苷-葡萄糖注射液25份和维生素c注射液3份。本实施例进一步提供了一种干细胞冻存液及冻存方法，包括以下步骤：1）配置干细胞冻存液，按照以下比例进行冻存液的配制：按照体积份数，取人血白蛋白注射液10份、浓度为2000-10000iu/ml的低分子肝素钙2份、复方氨基酸注射液15份、复方电解质注射液35份、右旋糖苷-葡萄糖注射液25份、维生素c注射液3份；混合均匀，获得干细胞冻存液；2）冻存：取干细胞3组，置于冻存管中，第一组为1e6/支，第二组为5e6/支，第三组为1e7/支，每组各管加入1ml步骤1）中所述干细胞冻存液，缓慢吹打混匀，采用程序降温盒降温至-80度，-80度下静置24h，转入液氮罐中冻存；3）复苏：从液氮罐拿出步骤2）中冻存的干细胞，迅速置于37度水浴锅中，快速振动，1分钟内完成复苏，获得复苏的干细胞。采用台盼蓝染色进行计数，计算活率，每组结果取平均值如表1所述。细胞分散度如图1a-2c所示。复苏后细胞按照8000个/cm2接种后，加入培养液培养，细胞形态如图3a-4c所示。所制备的干细胞冻存液为淡黄色，储存温度为2-8度。本实施例所述干细胞为间充质干细胞。表1不同密度细胞冻存复苏后的活率组别1e6/ml5e6/ml1e7/ml细胞活率98%97.3%96.9%实施例2本实施例提供一种干细胞冻存液，按照体积份数，包含人血白蛋白注射液20份、浓度为2000-10000iu/ml的低分子肝素钙2份、复方氨基酸注射液15份、复方电解质注射液35份、右旋糖苷-葡萄糖注射液25份和维生素c注射液3份。本实施例进一步提供了一种干细胞冻存液及冻存方法，包括以下步骤：1）配置干细胞冻存液，按照以下比例进行冻存液的配制：按照体积份数，取人血白蛋白注射液10份、浓度为2000-10000iu/ml的低分子肝素钙2份、复方氨基酸注射液15份、复方电解质注射液35份、右旋糖苷-葡萄糖注射液25份、维生素c注射液3份、dmso10份，混合均匀，获得干细胞冻存液；2）冻存：取脐带间充质干细胞10管，每管5e6/ml，各管加入1ml所述干细胞冻存液，缓慢吹打混匀，采用程序降温盒降温至-80度后转入液氮罐；3）复苏：将步骤2）所述的冻存的干细胞冻存0天，1月，3个月，6个月，9个月后复苏，从液氮罐拿出冻存的干细胞迅速置于37度水浴锅中，快速振动，1分钟内完成复苏，采用台盼蓝染色进行计数，计算活率，每组结果取平均值如表2所述。9个月复苏后细胞进行间充质干细胞表面标志检测，结果如图5-12所示。细胞按照8000个/cm2接种后，加入诱导培养液培养，进行成骨成脂诱导。结果如图13-14所示。表2细胞冻存不同时间后复苏后活率组别0d1个月3个月6个月9个月细胞活率98.2%97.3%96.9%96.5%96%当前第1页1 2 3 

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