一种牙髓间充质干细胞冻存液及冻存方法与流程

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞冻存液及冻存方法。

背景技术：

牙髓间充质干细胞(dpscs)是一种具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。同时，dpscs在适当条件下能被诱导分化为骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、肌组织、角膜等多种组织细胞，并能够被诱导为具有类胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞，能够作为以后多种疾病临床转化研究中的种子细胞。目前，已有多个国家建立牙髓干细胞库以供临床治疗或科学研究需要。

在牙髓间充质干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存，细胞冻存是将37℃培养的细胞，添加营养成分及防冻保护剂dmso，通过逐渐降温的方式将细胞长期超低温冻存于液氮中的过程。冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险，需要在降温前加入冻存液作为保护剂。

目前，细胞的冻存除了采用二甲基亚砜(dmso)对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存。目前的这些冻存液在细胞的冻存过程中还是会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增殖率较低，影响干细胞的临床利用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓间充质干细胞冻存液采用无血清培养基，并且不添加dmso，保证冻存的牙髓间充质干的活性，复苏后的细胞存活率高。

本发明的目的之二在于提供一种牙髓间充质干细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种牙髓间充质干细胞冻存液，包括组分a和组分b，所述组分a为无血清培养基，所述组分b由以下原料组成：钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e、1,8-桉叶素、甘油。

进一步地，所述组分b中的各原料在冻存液中的浓度为：钛酸纳米管6.5-9.2μg/ml、5-磷酸腺苷二钠7.8-8.5μg/ml、维生素e1.5-4.5μg/ml、1,8-桉叶素10.2-14.5mg/ml、甘油25-30mg/ml。

进一步地，所述无血清培养基为dmem/f12培养基。

进一步地，所述钛酸纳米管的直径为4-10nm，长度为100-500nm，比表面积为200-300m²/g。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液冻存。

进一步地，上述牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)将待冻存的牙髓间充质干细胞采用组分a的无血清培养基重悬，吹打均匀，降温至4-6℃；

(2)向步骤(1)的混合物中加入组分b，放入-80℃的冷冻环境中，24h后转移至液氮中保存，即完成。

进一步地，步骤(1)中重悬后细胞密度为2-4×10⁶个/ml。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，包括组分a和组分b两部分，其中组分a为无血清培养基，不添加动物血清，避免了动物血清可能引起的外源性污染。组分b中添加钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e、1,8-桉叶素、甘油，其中1,8-桉叶素和甘油协同作用，保护细胞在接近冰点时细胞内的水分不会结晶，避免细胞内的结构损伤，同时避免了使用dmso对细胞带来的不良影响。添加的钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e，一方面使细胞在液氮中冻存过程中保持一定活性，避免细胞的凋亡；另一方面，在结束冻存后有助于细胞快速复苏，恢复活性。上述成分协同作用保证冻存的牙髓间充质干的活性，复苏后的细胞存活率高。

本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，采用本发明的冻存液，无需复杂的程序性降温，操作简单。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1至3中冻存的牙髓间充质干细胞通过以下方法制备得到：

(1)取儿童换牙过程中自然脱落的乳牙用浓度为80％的医用酒精消毒后，用含有抗生素的生理盐水清洗，破碎后取牙髓组织；

(2)将取出的牙髓剪成约1mm×1mm×1mm块状，用0.25％的i型胶原酶和0.4％的分解酶在37℃水浴进行消化作用1h，轻轻吹打离散单细胞团块，将形成的单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网后，以1000r/min的离心速度离心5min，弃上清，用含15％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，于37℃、5％co2及饱和湿度条件培养，每3天更换1次培养基；

(3)等细胞生长达80％汇合度时，用0.25％的胰酶消化，100r/min离心5min，弃上清液，用含10％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，以1.5×10⁵个/ml细胞浓度种于t75培养瓶中进行传代培养，取p3-p5代细胞进行冻存。

实施例1

一种牙髓间充质干细胞冻存液，由组分a和组分b组成，组分a为无血清培养基dmem/f12培养基，组分b由以下原料组成：钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e、1,8-桉叶素、甘油，各原料在冻存液中的浓度为：钛酸纳米管6.5μg/ml、5-磷酸腺苷二钠7.8μg/ml、维生素e1.5μg/ml、1,8-桉叶素10.2mg/ml、甘油25mg/ml；

其中钛酸纳米管的直径为4-10nm，长度为100-500nm，比表面积为200-300m²/g。

一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)将p3代牙髓间充质干细胞采用组分a的无血清培养基重悬，重悬后细胞密度为2×10⁶个/ml，吹打均匀，降温至4℃；

(2)向步骤(1)的混合物中加入组分b，分装于冻存管中，放入-80℃的冷冻环境中，24h后转移至液氮中保存，即完成。

实施例2

一种牙髓间充质干细胞冻存液，由组分a和组分b组成，组分a为无血清培养基dmem/f12培养基，组分b由以下原料组成：钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e、1,8-桉叶素、甘油，各原料在冻存液中的浓度为：钛酸纳米管8.5μg/ml、5-磷酸腺苷二钠8.0μg/ml、维生素e3.8μg/ml、1,8-桉叶素12.9mg/ml、甘油28mg/ml；

其中钛酸纳米管的直径为4-10nm，长度为100-500nm，比表面积为200-300m²/g。

一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)将p4代牙髓间充质干细胞采用组分a的无血清培养基重悬，重悬后细胞密度为3×10⁶个/ml，吹打均匀，降温至6℃；

(2)向步骤(1)的混合物中加入组分b，分装于冻存管中，放入-80℃的冷冻环境中，24h后转移至液氮中保存，即完成。

实施例3

一种牙髓间充质干细胞冻存液，由组分a和组分b组成，组分a为无血清培养基dmem/f12培养基，组分b由以下原料组成：钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e、1,8-桉叶素、甘油，各原料在冻存液中的浓度为：钛酸纳米管9.2μg/ml、5-磷酸腺苷二钠8.5μg/ml、维生素e4.5μg/ml、1,8-桉叶素14.5mg/ml、甘油30mg/ml；

其中钛酸纳米管的直径为4-10nm，长度为100-500nm，比表面积为200-300m²/g。

一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)将p5代牙髓间充质干细胞采用组分a的无血清培养基重悬，重悬后细胞密度为4×10⁶个/ml，吹打均匀，降温至4-6℃；

(2)向步骤(1)的混合物中加入组分b，分装于冻存管中，放入-80℃的冷冻环境中，24h后转移至液氮中保存，即完成。

对比例1

对比例1提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去钛酸纳米管，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去将钛酸纳米管替换为纳米二氧化钛，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去5-磷酸腺苷二钠，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：将5-磷酸腺苷二钠替换为三磷酸腺苷，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去维生素e，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去1,8-桉叶素，其余均和实施例1相同。

对比例7

对比例7提供一种牙髓间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去1,8-桉叶素，将甘油的用量调整为35.2mg/ml，其余均和实施例1相同。

实施例1至3、对比例1至7中的细胞在液氮中分别冻存1个月、3个月、6个月、12个月后取出进行复苏，每次取三管，在37℃的水浴中迅速复苏，用台盼兰染色进行细胞计数(重复三次计数)，计算细胞存活率，每组均在冻存前用台盼兰染色进行细胞计数(重复三次计数)，计算冻存前细胞存活率，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出各实验组在冻存前细胞存活率相差不大的情况下，随着冻存时间的延长，细胞存活率呈降低趋势。在冻存时间相同的情况下，实施例1至3中的细胞存活率高于对比例1至7。

对比例1至5中分别省去钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e中的一种，或者将其替换为其他成分，如将钛酸纳米管替换为纳米二氧化钛、将5-磷酸腺苷二钠替换为三磷酸腺苷，冻存后经复苏细胞的存活率低于实施例1至3，说明本发明添加的钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素e三种成分在冻存液中协同作用，一方面使细胞在液氮中冻存过程中保持一定活性，避免细胞的凋亡；另一方面，在结束冻存后有助于细胞快速复苏，恢复活性，从而提高细胞的存活率。

对比例6至7中分别省去1,8-桉叶素或省去1,8-桉叶素后增加甘油的用量，细胞冻存后经复苏的细胞存活率均明显降低，说明本发明冻存液中1,8-桉叶素和甘油协同作用，保护细胞在接近冰点时细胞内的水分不会结晶，避免细胞内的结构损伤，提高细胞的存活率，同时避免了使用dmso对细胞带来的不良影响。

综上，本发明提供的冻存液中通过成分间的协同作用，有效降低冻存过程中对细胞造成的损伤，并且有助于保持细胞活性，避免细胞凋亡，在不使用dmso的情况下使骨髓间充质干细胞在长时间的冻存后仍能保持较高的存活率，为其临床应用提供保障。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

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