达格列净新的医药用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及达格列净的新医药用途，具体涉及达格列净在制备预防和/或治疗治肥胖及其相关代谢综合征药物中的用途。

背景技术：

骨骼肌是机体最大的能量代谢器官，线粒体是能量代谢的场所。肥胖及2型糖尿病患者骨骼肌线粒体功能障碍，因此，改善骨骼肌线粒体功能是改善患者预后的关键。

肥胖严重威胁人类健康，正日益成为人们关注的公共卫生问题。骨骼肌是机体最大的能量代谢器官，而线粒体在能量代谢过程中具有至关重要的作用。2002年kelly等首先提出，2型糖尿病患者存在骨骼肌线粒体损伤。2009年zorano等提出，线粒体损伤是胰岛素抵抗发生的桥梁。由于线粒体损伤与胰岛素关系密切，而胰岛素抵抗又是肥胖及2型糖尿病的共同病例特征，因此，骨骼肌线粒体在肥胖中的地位至关重要。

线粒体具有独立的环状，编码线粒体呼吸所需的22种转运rna和13种蛋白质。而核编码线粒体转录因子a(tfam)在线粒体基因转录、翻译和转运的过程中起关键作用。它通过直接与线粒体基因组以及线粒体转录特异性因子tfb1m和tfb2m相互作用调控mtdna转录。同时，核呼吸因子1和2(nrf-1和nrf-2)通过调控tfam的表达诱导tfam依赖的mtdna复制和转录，促进线粒体的生物发生。而nrf-1和nrf-2的激活以及tfam的诱导均受过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-α(pgc-1α)的调控。pgc-1α是一种转录共激活因子，它通过与多种转录因子相互作用，调控线粒体发生过程，其活性受磷酸化和脱乙酰基作用的调节。研究表明，上调pgc-1α的表达可以改善胰岛素敏感性，并且pgc-1α导致的代谢缺陷是可挽救的。因此，pgc-1α是增加胰岛素敏感性以及线粒体发生异常的重要靶标。另外，研究表明，amp依赖的蛋白激酶(ampk)通过磷酸化作用，直接激活pgc-1α的表达，因此，ampk被称为能量代谢的“开关”。

肥胖导致骨骼肌线粒体功能障碍的机制有很多，包括炎症、氧化应激以及细胞凋亡等。首先，脂质的积累会导致细胞肥大，激活核因子κb(nfκb)，进而激活炎症信号通路。活化的巨噬细胞分泌大量促炎性因子，如tnf-α。而tnf-α经过一系列信号通路传导，进一步激活nfκb，进而增加tnf-α和其他促炎性因子(如il-1和il-6)的产生。而炎症反应会增加活性氧(ros)的释放增加。过量的ros可导致线粒体功能障碍。因此，有效调控骨骼肌线粒体的生成以及炎症反应通路是改善肥胖及2型糖尿病导致的骨骼肌线粒体功能障碍的关键。

目前临床应用的降糖药物噻唑烷二酮类和二甲双胍均具有改善骨骼肌线粒体功能障碍的作用。由于糖尿病常伴有多种并发症，而这些药物对机体各靶器官的保护作用有限，因此，对新型改善骨骼肌线粒体功能的药物探索仍是近来研究的热点。噻唑烷二酮类药物通过改善线粒体功能，进而改善胰岛素抵抗而发挥降糖功效。但因其增加心血管事件发生风险，已退出了一线降糖药物的舞台。二甲双胍为临床一线降糖药物，研究表明，其除具有降糖作用外，对线粒体功能具有保护作用，但其对其他靶器官的保护作用有限。而糖尿病常并发糖尿病肾病，糖尿病心血管疾病以及糖尿病脑血管病。因此，寻找改善线粒体功能，进而改善全身代谢的药物仍未止步。

新型口服降糖药达格列净(dapagliflozin，dapa)是钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sglt-2)抑制剂的一种，其问世以来因具有独立于降糖功效外的诸多优势，成为近来研究的热点。研究表明，达格列净具有明确的心血管获益及保护肾脏的功效，可明显改善糖尿病患者预后。不仅如此，研究表明，达格列净可明显减少糖尿病合并脂肪肝小鼠的活性氧产生，改善肝脏功能。同时，在对高脂喂养的大鼠的研究中发现，达格列净通过降低炎症反应以及细胞凋亡可明显改善大鼠的脑功能。基于上述研究，达格列净在临床的应用领域逐渐扩大，受益人群逐渐增多。尽管如此，达格列净在骨骼肌线粒体中的作用研究，目前国内外均无报道。

技术实现要素：

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供达格列净在制备用于改善骨骼肌线粒体功能药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

达格列净在制备用于改善骨骼肌线粒体功能药物中的用途。

进一步地，达格列净可能通过骨骼肌ampk磷酸化水平，调控骨骼肌线粒体功能

进一步地，达格列净在制备预防和/或治疗治肥胖及其相关代谢综合征药物中的用途。

进一步地，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

进一步地，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

一种用于改善骨骼肌线粒体功能药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的达格列净和药学上可接受的辅料或载体。

一种预防和/或治疗治肥胖及其相关代谢综合征药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的达格列净和药学上可接受的辅料或载体。

所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂。

所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)、海藻酸(与总重量比为2－5％)、微晶纤维素(与总重量比为5－15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2－6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2－6％)。

所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10－1％，一般用量为0.25－0.75％，最佳用量为0.5－0.7％。

所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10－30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。

所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2－6％，与总重量比)。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明通过实验研究证明(1)达格列净上调肥胖小鼠骨骼肌线粒体发生调控蛋白(pgc-1α和pfam)的表达；(2)达格列净使骨骼肌线粒体氧化磷酸化相关蛋白(cox5)表达上调；(3)达格列净降低了肥胖小鼠骨骼肌炎症因子(mcp-1和il-6)的表达；(4)高脂环境下，达格列净增加了小鼠成肌细胞系c2c12细胞的耗氧能力。本发明研究结果表明达格列净可能通过骨骼肌ampk磷酸化水平，调控骨骼肌线粒体功能。

本发明拟利用高脂喂养野生型c57小鼠，建立肥胖小鼠模型，比较达格列净治疗后，小鼠骨骼肌线粒体功能的改变；利用小鼠成肌细胞系c2c12作为研究对象，给予棕榈酸刺激模拟体内高脂环境，在细胞水平探索达格列净作用于骨骼肌细胞线粒体的作用机制。本发明提供了达格列净的新医药用途，将有可能更新对达格列净在治疗代谢性疾病的认识，为临床改善骨骼肌线粒体功能及和肥胖及其代谢综合征预防和治疗研发新策略提供新的依据。

附图说明

图1是达格列净(dapa)在改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能的作用的研究技术路线示意图。

图2是达格列净在改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能作用机制的研究技术路线示意图。

图3是dapa促进骨骼肌ampk磷酸化增加，其中a为westernblot检测结果；b是a的统计图，n＝3，*p<0.05，***p<0.001；wt：野生型；nd：正常喂养；hfd：高脂喂养；dapa：dapagliflozin,达格列净。

图4是dapa促进骨骼肌线粒体的发生，其中a为westernblot检测结果；b和c是a的统计图，n＝3，*p<0.05，***p<0.001；wt：野生型；nd：正常喂养；hfd：高脂喂养；dapa:dapagliflozin，达格列净。

图5是dapa增加骨骼肌线粒体cox5表达，scalebar＝20μm；wt：野生型；nd：正常喂养；hfd：高脂喂养；dapagliflozin：达格列净。

图6是he染色小鼠骨骼肌，scalebar＝20μm；其中a为he染色结果；b为肌纤维平均直径；c为肌纤维直径分布情况，n＝3；wt：野生型；nd：正常喂养；hfd：高脂喂养；dapa：dapagliflozin，达格列净。

图7是dapa在骨骼肌中的抗炎作用，其中a为westernblot检测结果；b和c是a的统计图，n＝3，**p<0.01，***p<0.001；wt：野生型；nd：正常喂养；hfd：高脂喂；dapa：dapagliflozin，达格列净。

图8a-8c是检测c2c12细胞线粒体耗氧能力，wt：野生型；pa：棕榈酸；dapa：dapagliflozin，达格列净。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例。

一、达格列净(dapa)在改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能的作用的研究(技术路线如图1所示)。

1.从在体水平明确，dapa改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能的作用。

采用高脂喂养的方法，建立肥胖小鼠模型。明确dapa改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能的作用。

将8周龄小鼠(野生型c57小鼠)分成4组，1组和2组进行正常饮食喂养(脂肪提供热量占总热量的10％，researchdietd12450b)，3组和4组高脂饮食喂养(脂肪提供热量占总热量的45％，researchdietd12451)。持续喂养16周，在给予1组和3组5mg/kg/ddapa喂养2周，对全部小鼠进行以下指标测量。

1)体重测定：每次测量空腹血糖同时进行测量。

2)体脂水平：采用体脂仪检测小鼠体脂水平。

3)代谢指标测定：采用8通道小动物代谢笼收集上述4组小鼠的水和食物消耗量、固体和液体排泄物质量、氧气/二氧化碳消耗量、热量消耗、睡眠时间、环境温度湿度、体温和心率等代谢指标。

4)血脂水平测定：小鼠禁食6h，颈动脉取血，收集血清，采用elisa检测试剂盒分别检测血清甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白。

5)血糖水平测定：用快速血糖仪测定小鼠鼠尾静脉血的血糖值。空腹血糖测定：小鼠禁食6h检测。葡萄糖耐量试验：以2g/kg剂量向小鼠腹腔注射总体积0.1ml的葡萄糖水溶液，测定注射后即刻、15min、30min、60min及120min鼠尾静脉血的血糖水平。

6)胰岛素测定：测定血清胰岛素水平，并计算homa-ir评价胰岛素抵抗：用血糖仪测定空腹血糖水平，用elisa试剂盒测定血清胰岛素水平，根据公式homa-ir＝空腹血糖(mmol/l)×空腹胰岛素(mu/l)/22.5，计算homa-ir。

7)采用realtimepcr方法检测炎症因子和线粒体发生因子表达情况：dapa喂养2周后，处死小鼠，分离小鼠胫骨前肌。提取组织rna，检测mcp-1、il-6、pgc-1α及pfam表达。

8)采用免疫组化方法检测线粒体氧化磷酸化相关因子cox3表达情况。

2.利用小鼠成肌细胞系c2c12，采用棕榈酸刺激模拟在体高脂环境，明确dapa对骨骼肌细胞线粒体的作用。

1)棕榈酸浓度选择：使用棕榈酸模拟肥胖体内高脂环境。使用不同浓度的棕榈酸(0.1μm，0.2μm，0.3μm，0.4μm，0.5μm)刺激c2c12细胞，观察c2c12细胞生长及分化情况，通过westernblot检测il-6、mcp-1、p-ampk和pgc-1α等的表达，选择棕榈酸最佳作用浓度。

2)利用westernblot和realtimepcr的方法从蛋白水平和转录水平检测dapa对c2c12细胞炎症因子(il-6、mcp-1)，线粒体发生(pgc-1α和pfam)以及ampk磷酸化的作用情况。

3)采用葡萄糖摄取试剂盒(比色法)检测，比较各组c2c12细胞葡萄糖的摄取能力。

4)电镜下观察dapa对c2c12细胞线粒体数量和结构的改变情况。

二、达格列净在改善肥胖小鼠骨骼肌线粒体功能作用机制的研究(技术路线如图2所述示)。

采用c2c12细胞作为研究对象，探索dapa改善骨骼肌细胞线粒体功能的作用机制。在棕榈酸刺激的c2c12细胞中，同时给予dapa和ampk抑制剂(compoundc)，以ampk激动剂(aicar)作为阳性对照，利用westernblot检测ampk磷酸化水平、pgc-1α、pfam、mcp-1和il-6表达的变化，以及各组细胞葡萄糖摄取情况，明确dapa是否通过作用于ampk通路调控骨骼肌细胞线粒体功能。如果compoundc不能阻断dapa在c2c12细胞线粒体的作用，对各组细胞送检蛋白芯片，筛查dapa可能的作用通路。最后，通过筛查出的蛋白阻断剂作用，明确dapa在c2c12细胞线粒体的作用的机制。

三、结果。

1.达格列净(dapagliflozin,dapa)增加肥胖小鼠骨骼肌中ampk磷酸化水平。

口服给予高脂喂养16w的c57小鼠(highfatdiet，hfd)dapa2周，分别提取正常饮食喂养的对照组小鼠(wt+nd)，高脂喂养对照组(wt+hfd)以及dapa高脂喂养(hfd+dapa)组骨骼肌组织蛋白进行westernblot检测。结果显示，hfd+dapa组ampk磷酸化水平明显高于wt+hfd组，如图3所示，表明dapa对骨骼肌的能量代谢可能具有调控作用。

2.dapa使调控线粒体发生蛋白表达增加。

为了明确dapa是否可以影响骨骼肌细胞线粒体的发生，对wt+nd组，wt+hfd组以及hfd+dapa组小鼠骨骼肌进行pgc-1α和pfam检测。westernblot结果显示，hfd+dapa组pgc-1α和pfam表达水平均明显高于wt+hfd组，如图4所示，实验结果表明dapa对骨骼肌线粒体的发生具有促进作用。

3.dapa增加线粒体氧化磷酸化相关蛋白表达。

进一步对wt+nd组，wt+hfd组以及hfd+dapa组小鼠骨骼肌进行免疫组织化学染色，检测线粒体氧化磷酸化相关蛋白cox5的表达。结果显示，hfd+dapa组cox5表达水平明显高于wt+hfd组，如图5所示，表明dapa增加骨骼肌线粒体氧化磷酸化水平。

4.dapa在肥胖小鼠骨骼肌结构的影响。

通过对wt+nd组，wt+hfd组以及hfd+dapa组小鼠骨骼肌进行he染色，并对肌纤维直径进行测量。结果发现，hfd+dapa组与wt+hfd组骨骼肌直径无明显差异，如图6所示，表明dapa对小鼠骨骼肌结构无明显改善作用。

5.dapa在肥胖小鼠骨骼肌中具有抗炎作用。

对wt+nd组，wt+hfd组以及hfd+dapa组小鼠骨骼肌进行炎症因子mcp-1和il-6进行检测。westernblot结果显示，与wt+hfd组比较，hfd+dapa组mcp-1和il-6的表达水平均明显降低，如图7所示，表明dapa在肥胖小鼠骨骼肌中具有抗炎作用。

6.dapa增加小鼠骨骼肌细胞耗氧能力。

采用棕榈酸(palmiticacid，pa)刺激小鼠成肌细胞系c2c12细胞，模拟体内高脂环境，通过seahouse检测野生型c2c12细胞(wt)组，棕榈酸刺激c2c12细胞(pa)组以及c2c12细胞同时给予pa和dapa(pa+dapa)组线粒体耗氧能力。结果显示，pa组耗氧能力明显低于wt组，而pa+dapa组耗氧能力明显高于pa组，如图8a-8c所示，表明dapa可改善高脂刺激损伤的骨骼肌细胞线粒体的耗氧能力。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除