红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

光动力治疗(pdt)是以非手术的形式治疗癌症的一种特殊方式。光动力疗法在光照条件下利用光敏剂吸收光子，达到激发态，通过隙间穿越，将能量传递给三线态氧，并将三线态氧转化为具有细胞毒性的单线态氧，或者在特定的光照下，利用组织中水分子产生超氧阴离子和羟基自由基进而不可逆地杀伤癌细胞，达到治疗癌症的目的。相比于化疗和放疗，光动力疗法无创伤、无毒副作用、可重复治疗。近年来，pdt法虽然已经引起人们的广泛关注，但是在实际应用中，光的穿透性弱，治疗效果并不理想，因此设计一种性能优良的光敏剂对于光动力疗法而言尤为重要。

二维纳米材料是一类具有优异物理化学性质的层状结构纳米材料，应用广泛。但单一的二维纳米材料本身存在缺陷或不足，如石墨烯的疏水性、黑磷纳米片的不稳定性、二硫化物的强烈光热转化效应、氮化碳的光谱响应范围等，限制了二维纳米材料更广泛的应用，因此需要对二维纳米材料进行合理的功能化修饰或改性。

活性氧是具有化学生物学反应活性的含氧分子。细胞内活性氧物种含量的急剧增多可以引起蛋白质、氨基酸氧化、dna损伤等，从而诱导细胞发生凋亡和/或坏死，因而局部调控活性氧的生成可用于消毒/杀菌及肿瘤防治等公共卫生领域。具有类石墨烯结构的二维纳米材料石墨相氮化碳（g-c3n4），在波长小于459nm紫外/可见光下具有高效的光催化活性，可以产生大量活性氧，但是这种波长的紫外/可见光组织穿透深度有限，限制了氮化碳作为光敏剂在恶性肿瘤的pdt方面的应用。长波长红光或近红外光对人体皮肤、皮下组织具有较强的衍射穿透力和良好的生物安全性，因此开发具有长波长响应性的新型、高效、低毒的产生细胞和肿瘤杀伤活性氧功能的纳米材料有重要意义。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料及其制备方法和应用。本发明首先合成二维纳米材料石墨相氮化碳g-c3n4纳米片，然后用浓硝酸氧化的富勒烯c60对g-c3n4纳米片进行掺杂和功能化修饰，最后在体系中引入少量吲哚花菁素染料ir-806染料分子。染料敏化后的g-c3n4@c60@ir-806在808nm光照下能产生大量活性氧。本发明进一步记载了长波长光照条件下调控活性氧产生的能力和机制，并在细胞和动物模型上验证了红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料在808nm光照下的肿瘤细胞毒和肿瘤生长抑制效果。

技术方案：红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料的制备方法，首先将三聚氰胺加热后研磨得淡黄色粉末，将淡黄色粉末分散于硝酸溶液中，经水热合成法制备g-c3n4纳米片；另将富勒烯c60超按质量体积比1:3（mg/ml）的比例超声分散于68wt.%的浓硝酸中，于130~150℃油浴锅中回流3~5h，3000-8000rpm收集沉淀并用去离子水洗涤至中性得功能化富勒烯c60，然后将1份g-c3n4纳米片、0.5~1份功能化富勒烯c60分散于1份水中得g-c3n4@c60复合物；最后在上述复合物中加入质量比为1.0%~3.0%的5mg/ml吲哚花菁素染料ir-806水溶液并搅拌，离心后重悬分散于水中得g-c3n4@c60@ir-806复合材料；进一步加入体积比10%的10mg/ml羧基聚乙二醇mpeg-cooh溶液，室温下搅拌反应完成peg功能化，得红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料。

上述三聚氰胺加热研磨的具体步骤为，置于马弗炉中以3℃/min的速率从室温升至600℃，保持2h，得淡黄色固体，淡黄色固体置于玛瑙研钵中研磨至少30min，得淡黄色粉末。

上述水热合成方法为：淡黄色粉末按质量体积比1:100（g/ml）分散于5.0mol/l的硝酸溶液中，130℃油浴锅中冷凝回流24h，离心水洗至中性即得g-c3n4；将g-c3n4在水溶液中超声剥离处理至少16h，先3000rpm离心30min，再将上层溶液8000rpm离心15min后收集沉淀，即得g-c3n4纳米片。

上述g-c3n4纳米片与功能化富勒烯c60质量比为2:1或1:1；搅拌12h，得g-c3n4@c60复合物。

上述制备g-c3n4@c60复合物前，用呋喃除去未与g-c3n4纳米片结合的游离富勒烯c60。

依质量比加入1.0%~3.0%的5mg/ml吲哚花菁素染料ir-806水溶液，避光搅拌12h，8000rpm离心15min后重悬分散于水中，获得g-c3n4@c60（2:1）@ir-806和g-c3n4@c60（1:1）@ir-806三元复合材料，避光储存。

在质量体积比为1:1的g-c3n4@c60（1:1）@ir-806三元复合材料溶液中加入体积比10%的10mg/ml羧基聚乙二醇mpeg-cooh溶液，室温搅拌12h，离心水洗3次得g-c3n4@c60（1:1）@ir-806三元peg修饰复合材料。

上述制备方法制得的红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料。

上述红外染料敏化氮化碳三元异质结纳米材料在制备抑制恶性肿瘤生长药物中的应用。

有益效果：本发明以g-c3n4纳米片为基底、近红外染料分子ir-806作为天线效应分子，c60作为电子接受体，并经peg修饰，制备的g-c3n4@c60@ir-806-peg修饰的三元纳米复合物性能稳定，生物兼容和安全性好。能在较长波长808nm光照下，可以利用氧气（o2）生成单线态氧（¹o2），同时裂解组织中水分子产生羟基自由基和超氧阴离子，克服了氮化碳的光谱响应范围较窄、穿透性和安全性差等缺点。该三元复合材料经光照调控生成的活性氧能有效促进恶性肿瘤细胞凋亡，抑制实体移植瘤的生长，可作为一种优良的近红外光敏剂。

附图说明

图1为g-c3n4@c60@ir-806三元复合纳米材料的合成及应用示意图（实施例1和实施例2）；

图2为g-c3n4@c60@ir-806三元复合材料实物图（实施例1和实施例2）；从左至右依次为g-c3n4，g-c3n4@c60（2:1），g-c3n4@c60（1:1），g-c3n4@c60（2:1）@2%ir-806，g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806；

图3为g-c3n4@c60@ir-806透射电子显微镜表征结果（实施例1和实施例2）。其中，（a，b）g-c3n4；（c）g-c3n4@c60（2:1）；（d）g-c3n4@c60（1:1）；（e）g-c3n4@c60（2:1）@2%ir-806；（f）g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806。从图3可以看出，g-c3n4纳米片大小约为100nm，加入相当于g-c3n4质量50%和100%羧基化c60后可以得到g-c3n4@c60（2:1）和g-c3n4@c60（1:1）。c60的掺入并没有对g-c3n4的形貌造成明显影响，除去多余的c60后，纳米材料在两种不同比例的g-c3n4@c60材料中分别加入2%ir-806染料可得g-c3n4@c60（2:1）@2%ir-806和g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806，加入染料后g-c3n4纳米片并未发生明显的堆叠。合成的g-c3n4@c60@ir-806具有良好的分散性。

图4为不同材料的吸收光谱图。可以看出，单一g-c3n4纳米片在700nm后光谱范围内吸收极弱，羧基化c60分子在350-1000nm范围内都有较好吸收。在掺杂了c60后，g-c3n4@c60（2:1）和g-c3n4@c60（1:1）在700nm以后的吸收随着c60的掺杂量的增加而逐渐升高，但升高幅度较小，继续用少量的ir-806分子（g-c3n4纳米片质量的2%）对g-c3n4@c60进行敏化后，所得g-c3n4@c60@ir-806在近红外区的吸收明显升高，并在806nm处表现出了ir-806染料的特征吸收峰。良好的近红外区域的吸收为g-c3n4@c60@ir-806在808nm光照下产生活性氧奠定了基础（实施例1和实施例2）。

图5为g-c3n4@c60@ir-806三元复合物红外光谱表征结果（实施例1和实施例2）。羧基化后的c60分子在1550-1700cm^-1处出现了-cooh的两个吸收峰。同样，含有g-c3n4纳米片的材料均在1200-1700cm^-1范围内代表碳氮杂化环的伸缩振动峰，810cm^-1处出现一个明显的代表氮化碳纳米片上的三嗪结构单元的面外弯曲振动峰。染料敏化后，由于ir-806结构含有大量碳碳双键，g-c3n4@c60@ir-806材料主要位于1500-1675cm^-1碳碳双键的伸缩振动峰逐渐增强，证明了染料分子的存在。

图6为g-c3n4@c60@ir-806的热稳定性（实施例1和实施例2）；

图7为g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg在808nm（1wcm^-2）光热效果（实施例2）；

图6和图7反应了材料的热稳定性和光热效应。用同步热分析仪对g-c3n4，g-c3n4@c60（1:1）和g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806进行了热力学稳定性的表征，当温度超过600℃之后，g-c3n4迅速分解，试样质量迅速下降，而掺杂了c60和近红外染料分子后，表征结果中并未显示出明显的热力学性质的改变，同样是在温度超过600℃之后，g-c3n4@c60（1:1）和g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806的质量发生迅速下降。为避免材料的光热转化效率太强，测试了不同浓度的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg在808nm（1wcm^-2）光照下的光热效应。表明在1wcm^-2的光强度下，200μgml^-1的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg仅比纯水溶液的温度多升高了2.0℃，表明即使在强光的照射下，g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg的光热效果也不明显（实施例2）。

图8为纳米材料在808nm（0.15wcm^-2）光照下产生活性氧的能力。g-c3n4纳米片基本不能利用808nm光，虽然c60掺入稍许提高了g-c3n4在近红外的吸收，但作用不明显。当用染料分子ir-806对g-c3n4@c60进行敏化后，由于ir-806分子的天线效应，g-c3n4@c60@ir-806能够很好地吸收808nm光，并在808nm光照下产生大量活性氧。对于不同c60含量的g-c3n4@c60@ir-806，c60含量较多的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806具有更好的产生活性氧的能力（实施例2）。

图9为利用电子自旋共振波谱仪（esr）对g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806在808nm（0.15wcm^-2）光照下产生活性氧的物种进行了鉴定（实施例2）。所合成的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806在808nm（0.15wcm^-2）光照下可以同时利用氧气分子产生单线态氧（图9c），并利用水分子产生羟基自由基（图9b）和超氧阴离子（图9a）。同时具有ⅰ型和ⅱ型光动力治疗剂的性质。

图10为g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg的血液相容性（实施例2）；

图11为g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg的细胞生物相容性和808nm光照下的细胞杀伤实验（a：三元纳米材料在无特定光照下的无毒性作用浓度；b：三元纳米材料在特定光照下的细胞杀伤作用）；

由图10和图11（实施例2）可以看出，在材料浓度为0-1000μgml^-1的范围内，并没有观察到红细胞发生溶血现象，peg功能化的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806具有良好的血液相容性。材料浓度为200μgml^-1时，24小时共培养后细胞存活率仍保持在80%以上，说明具有良好的生物兼容性。在此浓度和808nm（0.15wcm^-2）光照下，起始的短时间光照就会导致约40%的肿瘤细胞死亡。随着光照时间的延长，孔板中残留细胞存活率逐渐降低。

图12解释了mcf-7细胞内g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg在808nm光照下的死亡与产生的活性氧有关（实施例2）。（a）cell+dcfh-da，（b）cell+dcfh-da+light，（c）cell+g-c3n4-peg+dcfh-da，（d）cell+g-c3n4-peg+dcfh-da+light，（e）cell+g-c3n4@c60（1:1）-peg+dcfh-da，（f）cell+g-c3n4@c60（1:1）-peg+dcfh-da+light，（g）cell+g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg+dcfh-da，（h）cell+g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806-peg+dcfh-da+light。标尺为100μm；单纯的g-c3n4纳米片不能利用808nm光产生活性氧，对g-c3n4进行c60掺杂后，由于g-c3n4在近红外区域的吸收有提高，所以g-c3n4@c60（1:1）能产生少量活性氧，当染料分子作为天线效应分子加入后，g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806可以在808nm（0.15wcm^-2）光照下产生大量活性氧，mcf-7细胞内可以观察到明亮的dcf的绿色荧光。

图13为各组裸鼠的（a）体重变化曲线及（b）肿瘤生长曲线图（*p<0.05）；

图14为治疗结束后各组裸鼠的代表性肿瘤实物图；从左至右依次为control，pbs+light，g-c3n4，g-c3n4+light，g-c3n4@c60，g-c3n4@c60+light，g-c3n4@c60@ir-806，g-c3n4@c60@ir-806+light；

从图13和图14（实施例1和实施例2）可以看出整个干预过程，各组裸鼠的体重未发生明显变化，而肿瘤体积均随着时间点延长而逐渐增加。从肿瘤生长曲线中可以发现control组肿瘤体积增长最快，pbs+light组也基本没有受到抑制，表明光照对肿瘤没有损伤作用，g-c3n4组和g-c3n4+light组的生长趋势基本一致，表明g-c3n4在808nm光照下没有抑制效果，g-c3n4@c60组和g-c3n4@c60@ir-806组的肿瘤生长趋势也基本与g-c3n4组类似，证明了peg功能化后的g-c3n4，g-c3n4@c60和g-c3n4@c60@ir-806都具有良好的相容性，g-c3n4@c60+light的肿瘤大小较g-c3n4@c60组有所减小，但是效果不明显，g-c3n4@c60@ir-806组对肿瘤的生长抑制作用最明显。

图15为各组裸鼠肿瘤组织切片的tunel荧光染色及h&e染色图（实施例1和实施例2）。（a）control，（b）pbs+light，（c）g-c3n4，（d）g-c3n4+light，（e）g-c3n4@c60，（f）g-c3n4@c60+light，（g）g-c3n4@c60@ir-806，（h）g-c3n4@c60@ir-806+light。标尺100μm；肿瘤组织的tunel染色结果中，仅在g-c3n4@c60@ir-806+light组中可以观察到蓝色荧光（dapi）的细胞核周围有明亮的绿色荧光，表明g-c3n4@c60@ir-806在808nm光照下，产生的活性氧对细胞造成损伤，细胞内产生了大量的dna碎片。在其余各组中，在g-c3n4@c60+light组的细胞和周围可以观察到稍许绿色荧光，表明g-c3n4@c60有一定利用808nm光产生活性氧的能力，但是效果并不强。同样在肿瘤组织的h&e染色切片中，g-c3n4@c60@ir-806+light组肿瘤切片中可以明显观察到组织中细胞结构发生破坏，g-c3n4@c60+light组仅可以造成少量细胞结构破坏。

图16为各组裸鼠主要脏器组织切片的h&e染色图（实施例1和实施例2）。（a）control，（b）pbs+light，（c）g-c3n4，（d）g-c3n4+light，（e）g-c3n4@c60，（f）g-c3n4@c60+light，（g）g-c3n4@c60@ir-806，（h）g-c3n4@c60@ir-806+light。标尺100μm；表明g-c3n4基的纳米材料对心、肝、脾、肺、肾等组织器官没有明显的器官毒性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

将2g三聚氰胺加入带盖瓷坩埚并置于马弗炉中，以3℃/min速率从室温升至600℃，保持2个小时后自然冷却至室温。将所得淡黄色固体置于玛瑙研钵中研磨30min，取1g分散于100ml浓度为5mol/l硝酸溶液中，130℃油浴锅中冷凝回流24小时，离心，水洗至中性后分散于约50ml水中，得到石墨相g-c3n4。将所得g-c3n4水溶液超声处理16h以上，先3000r/min离心30min除去较大块的g-c3n4，再将上层溶液转移至新的离心管中，8000r/min离心15min后收集沉淀，即为g-c3n4纳米片。重复上述过程，可对所得g-c3n4纳米片进行定量。

将50mg富勒烯c60超声分散于150ml68wt.%的浓硝酸中，于140℃油浴锅中回流4h，将所得的棕黑色产物离心水洗至中性后，得羧基化富勒烯，分散于水中避光保存。

取10mg的g-c3n4分散于10ml水中，取5mg的羧基化c60加入，搅拌12h后，用呋喃除去未与g-c3n4纳米片作用的c60，得到g-c3n4@c60（2:1），分散于水中避光保存备用。

向g-c3n4@c60（2:1）溶液中加入40μl，5mg·ml^-1的ir-806水溶液，避光搅拌过夜，离心后重悬分散于水中，避光储存备用，可得g-c3n4@c60（2:1）@2%ir-806三元复合材料。

实施例2

将2g三聚氰胺加入带盖瓷坩埚并置于马弗炉中，以3℃/min速率从室温升至600℃，保持2小时后自然冷却至室温。将所得淡黄色固体置于玛瑙研钵中研磨30min，取1g分散于100ml浓度为5mol/l硝酸溶液中，130℃油浴锅中冷凝回流24小时，离心，水洗至中性后分散于一定体积的水中，得到石墨相g-c3n4。将所得g-c3n4水溶液超声处理16h以上，先3000r/min离心30min除去较大块的g-c3n4，再将上层溶液转移至新的离心管中，8000r/min离心15min后收集沉淀，即为g-c3n4纳米片。重复上述过程，可对所得g-c3n4纳米片进行定量。

将50mg富勒烯c60超声分散于150ml68wt.%的浓硝酸中，于140℃油浴锅中回流4h，将所得的棕黑色产物离心水洗至中性后，得羧基化富勒烯，分散于水中避光保存。

取10mg的g-c3n4分散于10ml水中，取10mg羧基化c60加入，搅拌12h后，用呋喃除去未与g-c3n4纳米片作用的c60，得到g-c3n4@c60（1:1），分散于水中避光保存备用。

向g-c3n4@c60（1:1）溶液中加入40μl，5mg·ml^-1的ir-806水溶液，避光搅拌过夜，离心后重悬分散于水中，避光储存备用，可得g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806三元复合材料。

将10mg的g-c3n4@c60（1:1）@2%ir-806分散于10ml水中，加入1ml浓度为10mgml^-1的mpeg-cooh溶液，室温下搅拌12h，离心水洗3次，即得g-c3n4@c60@ir-806-peg材料。

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