一种牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法与流程

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法。

背景技术：

牛多杀性巴氏杆菌病是由牛多杀性巴氏杆菌感染牛引起的传染病。目前我国流行的牛多杀性巴氏杆菌病主要分为两种，一种是由牛多杀性巴氏杆菌荚膜a型菌引起的牛纤维素性化脓性肺炎，另一种是由牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型菌引起的牛出血性败血症。其中，牛出血性败血症是以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛出血为特征的传染病，致死率极高。该病常年可发生，在气温变化大、阴湿寒冷时更易发病。在我国已有几十年的流行历史，目前仍在多地呈散发或地方性流行。

使用疫苗进行免疫接种是预防牛多杀性巴氏杆菌病的主要措施。我国现有的牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗(简称b型菌单苗)能预防牛巴氏杆菌荚膜b型菌引起的牛出血性败血症。b型菌单苗系用免疫原性良好的荚膜b型多杀性巴氏杆菌c45-2株、c46-2株、c47-2株，根据需要可任选1-3株接种适应培养基培养，将培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶制成；该疫苗采用肌肉或皮下注射，针对体重为100kg以下的牛，注射剂量为4ml，针对体重为100kg以上的牛，注射剂量为6ml。但在现有生产工艺条件下，牛多杀性巴氏杆菌培养活菌数较低，培养后菌液未进行纯化直接进行配苗，产品效价不好，且在临床运用中，有相关文章报道和客户实际反馈，b型菌单苗注射牛后，存在一定的毒副反应，严重情况下能导致牛大遍死亡，给养殖户和企业带来灭顶之灾，因此b型菌单苗的安全性有待进一步的提高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法。

经研究，本发明采用以下技术方案：

1、一种牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，有效成分包括抗原和佐剂，所述抗原由牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c45-2株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c47-2株组成；所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c45-2株的保藏编号为cvcc44502，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c47-2株的保藏编号为cvcc44702，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c45-2株的有效含量为灭活前30-100亿/ml；所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c47-2株的有效含量为灭活前30-100亿/ml；所述疫苗中内毒素含量为4000-67000ug/ml。

优选的，所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c45-2株的有效灭活前80-100亿/ml；所述牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c47-2株的有效含量为灭活前80-100亿/ml。

优选的，所述疫苗中内毒素含量为4847ug/ml。

2、牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

一级种子制备：将各株冻干菌种按1-2％分别接种至含有0.1％裂解全血和4％健康马血清的马丁肉汤培养基中，36.5-37.5℃，摇培10-16小时，然后将培养物划线于含有0.5％裂解全血和4％健康马血清的改良马丁琼脂平板上，36.5-37.5℃培养10-16小时，挑选光滑典型菌落，接种于鲜血斜面，37℃培养24小时，得一级种子；

二级种子制备：将各株一级种子按照1-2％接种量接种于含有0.1％裂解全血及4％健康马血清的马丁肉汤培养基中，36.5-37.5℃，摇培10-16小时，得二级种子；

菌液培养：接种前，调节培养基温度至35-37℃，调节罐内ph至7.2～7.5，并通气搅拌；将各株二级种子菌液混合，按培养基总量的1％～2％接种，并添加0.1％的裂解全血；培养过程中逐渐增大通气量，使溶氧不低于40％，温度控制在36.5～37.5，ph控制在6.8～7.6，每两个小时补充营养物质，补充营养物质的量为菌液总量的1～2％，培养8～10小时，得发酵菌液；

其中，温度低于标准，菌体生长缓慢，发酵培养时间延长，高于标准会导致菌体衰老快，达不到收获要求；菌体最适合ph在6.8-7.6之间，离开这个范围将导致菌体死亡；

纯化及灭活：用0.2m碱处理碟片式离心机，然后将发酵菌液离心，离心结束后将菌泥转入灭菌的生理盐水中，加入稀释后的甲醛，搅拌保温保压灭活24小时；

配苗分装：向灭活后的菌液中加入氢氧化铝胶(即佐剂)，充分混合后加入硫柳汞和苯酚，所述灭活后的菌液与氢氧化铝胶的体积比为5:1，所述硫柳汞的终浓度为0.005％，所述苯酚的终浓度为0.2％，充分震荡摇匀，无菌检验合格后分装，即可。

优选的，所述菌液培养中，培养基的成分包括牛肉浸粉，蛋白胨，氯化钠和酵母浸粉，所述牛肉浸粉，蛋白胨，氯化钠和酵母浸粉的质量比为12:12:5:12，所述培养基的ph值为7.2～7.6。其中，培养基中还包括雨林五号胨和雨林一号盐，加入的质量比为10:2.5。培养基为由山东雨林生物技术有限公司提供的牛出败专用培养基，用时称量21g/l，溶解于注射用水，调节ph7.6，高压灭菌，降温至37℃，待用。

优选的，所述菌液培养中，补充的营养物质为50％葡萄糖溶液。

优选的，所述碟片式离心机的进液量为100～150l/小时，并将离心机设置为800～1200s排渣一次。

优选的，所述离心结束后，菌泥用灭菌生理盐水按照原菌液量复原，甲醛的加入量为终浓度的0.2％。

3、牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2～3ml。

优选的，所述牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2ml。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗中，牛杀性巴氏杆菌荚膜b型c45-2株的有效含量为为灭活前80-100亿/ml；牛多杀性巴氏杆菌荚膜b型c47-2株的有效含量为为灭活前80-100亿/ml；疫苗中内毒素含量为4000-67000ug/ml；活菌数高且内毒素低，可大大提高牛免疫的效果，同时降低对动物的毒副作用；

2)本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，在培养过程中，选择合适的时间添加适量的补料用以添加其生长过程中的营养物质，以及将ph控制在适合生长的范围内，达到高密度培养效果，使得在更短的培养时间内，收获更多的抗原，活菌数大幅增加；同时，对发酵后的菌液采用阿法拉伐离心机进行离心，去除菌液中内毒素，从而大大提高产品的质量；

3)本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫犊牛的剂量为2～3ml，远小于现有的注射剂量(4～6ml)，降低了疫苗的使用和包装成本，且副作用大大降低，在牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗领域具有推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的菌液在培养过程中的生长曲线；

图2为本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的菌液在纯化前后的对比图；

图3为本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的菌液在培养过程中od值随时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例中牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)一级种子制备：将各株冻干菌种按1％分别接种至含有0.1％裂解全血和4％健康马血清的马丁肉汤培养基中，在37℃条件下，150rpm摇床培养12小时，然后将培养物划线于含有0.5％裂解全血和4％健康马血清的改良马丁琼脂平板上，在37℃条件下，培养12小时，挑选5个以上的光滑典型菌落，接种于鲜血斜面若干只，在37℃条件下，培养24小时，得一级种子；

2)二级种子制备：将各株一级种子按照1％接种量接种于含有0.1％裂解全血及4％健康马血清的马丁肉汤培养基中，在37℃条件下，摇床培养12小时，镜检及纯粹检验合格后作为二级种子；

3)菌液培养：选用山东雨林生物技术有限公司牛出败专用培养基，配制完成后加入适量的消泡剂，116℃灭菌30min，降温后保压待用；

接种前，调节培养基温度至35～37℃，调节罐内ph至7.2～7.5，并通气搅拌；将各株二级种子菌液混合，按培养基总量的1％接种，并添加0.1％的裂解全血；培养过程中逐渐增大通气量，使溶氧不低于40％，温度控制在36.5～37.5℃，ph控制在6.8～7.6，每两个小时补充一次浓度为50％的葡萄糖溶液，补料量为菌液总量的2％，培养8h左右进行无菌取样做镜检，培养10h后停止发酵并降温，收获前无菌取样做纯粹检验以及活菌计数，得发酵菌液；

4)纯化及灭活：用0.2m碱处理阿法拉伐碟片式离心机，处理完后用无菌的注射用水清洗离心机至ph呈中性，离心参数设置为1000s排渣一次，进液量控制在120l/小时，然后将发酵菌液离心，离心结束后将菌泥转入灭菌的生理盐水中(等体积复原)，再按复原后菌液总量的0.2％加入稀释后的甲醛，搅拌保温保压灭活24小时，取样送检并做灭活检验；

5)配苗分装：向灭活后的菌液中加入氢氧化铝胶，充分混合后加入硫柳汞和苯酚，灭活后的菌液与氢氧化铝胶的体积比为5:1，硫柳汞的终浓度为0.005％，苯酚的终浓度为0.2％，充分震荡摇匀，无菌检验合格后分装。

原培养工艺的制备方法，包括以下步骤：

1)一级种子繁殖及鉴定：将各株冻干菌种分别接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24小时，然后按规程标准，每株挑选5个以上典型菌落，分别接种鲜血琼脂斜面若干支，37℃培养24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过14日。继代不得超过5代；

2)二级种子繁殖：将各株一级种子分别接种于含0.1％裂解血球全血的马丁肉汤中，在37℃培养24小时后，分别取样用马丁琼脂按照现行《中国兽药典》作纯粹检验；同时置2～8℃保存不得超过4日；

3)制苗用菌液制备

制苗用培养基为马丁肉汤，其中马丁肉汤培养基中的成分配比为：牛肉汤，猪胃消化液，氯化钠按ml:ml:g计为200:200:1，马丁肉汤培养基的ph为7.2-76；

菌液培养：将各株二级种子菌液等量混合，按培养基总量的1％～2％接种二级种子液，并按0.1％加入裂解血球全血及适量消泡剂，已逐渐增大通气量的方法，在37℃培养24小时；

纯粹检验和活菌计数：菌液培养完成后，取样，用马丁琼脂做纯粹检验，应纯粹；并用含0.1％裂解血球全血和4％健康动物血清的改良马丁琼脂平板按现行《中国兽药典》做活菌计数，作为培苗参考；

灭活：按菌液总量的0.1％～0.15％加入甲醛溶液，在37℃灭活12小时，用马丁琼脂按现行《中国兽药典》作灭活检验，应无菌生长；

配苗：以5份灭活的菌液加入1份灭菌的强氧化铝胶进行配苗，同时按疫苗总量的0.005％加入硫柳汞或0.2％苯酚，充分振荡摇匀；

半成品检验：无菌检验，按现行《中国兽药典》进行，应无菌；

疫苗分装：经无菌检验合格后，进行混合，组批，定量分装，分装时随时搅拌，使其混合均匀，产品进行成品检验。

相关检测分析

1)发酵液活菌数的检测分析

具体操作为：1)取10ml吸管套在电动移液器吸口上，吸取稀释液至10ml刻度以上，使液体流至10ml刻度，放入a型试管9ml，以此方法，按所需支数分装，放置到试管架上；2)吸菌液：取1ml吸管套在电动移液器吸口上，将菌液摇6～8次，吸管反复吸、放菌液4～6次，而后吸至1ml刻度以上，使菌液流到1ml刻度。吸管垂直放入装有9ml的第1支a型试管中(吸管勿接触液面)，使菌液自然流下，(吸管没有标有“吹”字，不能将残留的菌液放入，下同)弃去吸管；3)连续稀释：将试管倾斜使管壁的菌液融合到液体中，然后用漩涡振荡器使菌液充分混均。将1ml吸管套在电动移液器吸口上，用吸管反复吸、放菌液4～6次，而后吸至1ml刻度以上，并使菌液流到1ml刻度，加入到第2支试管中，弃去吸管。以此方法稀释，直至所需倍数；4)滴平皿：表面培养法，选2个适宜的连续稀释度滴平皿。每个稀释度用1支1ml吸管吸取菌液，滴3个平皿，每个平皿滴0.1ml，摇动平皿，使菌液在琼脂表面散布均匀，放置在温箱中(37℃或适宜温度)，完全盖上平皿，待平皿表面无液体后，平皿倒置，培养24小时(或适宜的时间)；5)计算菌数：计算每个稀释度平皿的平均菌落数，高稀释倍数的平均菌落数乘以10，再计算2个稀释度的平均菌落数，乘以稀释倍数，既是菌液或原苗的每毫升菌数。记录检验结果。

结果及判定：选择菌落数在40～200个之间的平皿计数。如有片状菌落生长，或同一稀释度平皿间菌数相差50％以上时应重新计数。结果如表1所示。

表1新、旧培养工艺条件下活菌数检测对比

表2新、旧培养工艺条件下平均收获活菌数

从表1中分析可知，在新工艺培养条件下，培养10h之后，活菌数最高可达310亿/ml，最低200亿/ml。而原工艺培养条件下，培养24h之后，活菌数最高为106亿/ml。且从表2中分析可知，新工艺培养条件下的平均收获活菌数也大大提高。由此可见，新工艺与原工艺相比，培养时间大大减少，但活菌数却明显提高。从而证明了，在新工艺培养条件下，可大大提高活菌数，且菌数的提高可以提升抗原的滴度，从而提高疫苗的效价，提升产品的有效性。

2)生长曲线的分析

通过生长曲线的分析，以确定最佳收获时间，减少了培养时长，菌数最高时进行收获，避免了培养时间过长后，细菌裂解产生大量的内毒素。结果如图1所示。

从图1中分析可知，开始培养时，活菌数随培养时间的增加而增加，当培养时间超过10h之后，活菌数随培养时间的增加呈下降趋势，因此，当培养时间为10h时，活菌数量最高。

同时，可以根据配苗标准(配苗标准：灭活前每头份不低于150亿，100kg以上一头份6ml\以下4ml)来进行稀释与浓缩，制备浓缩苗亦可，这有助于提升产品的产量与质量。

3)成品中内毒素含量的检测分析

具体操作为：

细菌内毒素测定：细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位(eu)表示；

细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；

细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2eu，不大于50eu。细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照；

细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水；

凝胶检检测法：1)打开洁净工作台的风机及照明开关，并用75％酒精棉球擦拭台面；2)用75％酒精棉球擦手消毒；3)内毒素阳性对照溶液的制备：取内毒素工作标准品(10eu)1支，用75％酒精棉球消毒瓶颈，用安瓿开瓶器割开瓶颈；4)用移液枪吸取1ml内毒素检查用水，加入到内毒素工作标准品中，混匀15分钟，作为内毒素标准品溶液(10eu/ml)，再把内毒素标准品溶液稀释成2.0λ浓度的内毒素溶液，作为内毒素阳性对照溶液。(如λ为0.25eu/ml，则应把10eu/ml的内毒素标准品溶液稀释成0.5eu/ml的内毒素阳性对照溶液)

供试品溶液的配制：

供试品的最大有效稀释倍数(mvd)的计算：mvd＝cl/λ(式1)，式中：l为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液浓度；λ为凝胶法鲎试剂的标示灵敏度(eu/ml)。

样品根据(式1)计算公式，制成按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液。

供试品阳性对照液的配制：用供试品溶液把内毒素标准品溶液稀释成浓度为2.0λ浓度的供试品阳性对照液。

取0.1ml/支规格的鲎试剂安瓿瓶5支，用75％酒精棉球消毒瓶颈。

在安瓿瓶颈处用安瓿开瓶器先轻轻转动划痕，然后放在安瓿开瓶器适宜位置掰开瓶帽。

每支中均加入细菌内毒素检查用水0.1ml，混匀，5支鲎试剂安瓿瓶均如此操作。向其中两支中各加入0.1ml供试品溶液作为供试品管；1支中加入0.1ml，2.0λ浓度的内毒素阳性对照液作为阳性对照管；1支中加入0.1ml，细菌内毒素检查用水作为阴性对照管；1支中加入0.1ml供试品阳性对照液作为供试品阳性对照管。将安瓶中溶液轻轻混匀后，用封口膜将安瓶口密封好，放到试管架上并标明编号。把试管架垂直放入(37±1℃)培养箱中，保温(60±2)分钟。

动态浊度法

打开洁净工作台的风机及照明开关，并用75％酒精棉球擦拭台面，用75％酒精棉球擦手消毒。

取内毒素工作标准品1支，用75％酒精棉球消毒瓶颈，用安瓿开瓶器在其顶端开口，用移液枪吸取1ml内毒素检查用水，加入到内毒素工作标准品中，用封口膜封好瓶口混匀15分钟待用。(注意：不要直接在瓶颈开口，以免混匀时标准品液体旋转溢出或碰到封口膜)

制作标准曲线：阴性对照(内毒素检查用水)，根据所检供试品需要选择合适灵敏度范围稀释，标准曲线应包括梯度不大于10倍的至少三个标准内毒素浓度。(参考：把10eu/ml的内毒素标准品稀释成0.03eu/ml、0.25eu/ml、2eu/ml的三个浓度作标准曲线)

供试品准备：根据(式1)计算公式把供试品稀释到适宜的几个梯度，如供试品内毒素过高按10倍系列稀释方法稀释到适宜梯度(即：每支试管中加入900ul检查用水，然后取100ul样品加入到第一支试管中，再从第一支试管吸取100ul加入第二支试管，以此类推往后稀释)。

供试品阳性准备：用标准曲线中间点内毒素浓度(λm)或接近中间点浓度作为供试品阳性对照溶液中添加的内毒素浓度(如以上参考曲线中0.25eu/ml即为中间点浓度)，取100ul2eu/ml浓度的标准品加入到含900ul供试品溶液中即为供试品阳性对照。目的在于计算回收率参考，回收率在50％～200％则认为无干扰，回收率计算公式为：

把鲎试剂按装量复溶直至溶液澄清

加样：每个样品平行两管、首先在每个反应管中加入100ul鲎试剂，然后分别把100ul准备好的标准品及样品各自加入反应管，在混匀器上轻轻混匀(注意：再加样过程和混匀过程中应避免产生气泡)；

把加好的样品放入已准备好的动态试管仪中检测，检查是否每管都正常读数(参数：波长405，采集时间60分钟)；

填写当次所用各种试剂的名称、批号、有效期等，标记所检样品的名称及稀释倍数，等反应时间结束查看结果报告。

结果判断：

动态浊度法判定：结果直接查看报告，是否可取必须满足所有条件，即：相关系数≥0.980，回收率在50～200％范围内，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点反应时间，反应重复管的变异系数(cv)≤10％。以上条件均会在报告中呈现。

结果如表3和图2所示。

表3新、旧工艺制得的成品中内毒素的含量

内毒素是革兰氏阴性菌在死亡溶解后或人工裂解后释放出来的对宿主有害的物质，能够引起严重中毒反应而死亡、轻则发热、休克、器官损伤等病例反应。因此产品中内毒素的指标是影响产品质量的重要因素。

由表3中的数据分析可知，没有纯化的产品中内毒素均为在45～130万eu/ml之间，最高的达150万eu/ml，经过纯化后内毒素大幅下降，高的只有一万多，低的只有几千。且从图2中观察可知，纯化后的菌液比纯化前的菌液颜色浅。由此可知，通过改进后的新工艺条件下，成品内毒素有了明显的下降，并且内毒素平均降低了高达80倍左右，这可以很大程度降低动物应激反应，对于疫苗的安全性有很大的提升。

3)成品中od值的检测分析

紫外分光光度计(od值测定)

具体操作为：开机自检，确认仪器光路中无阻档物，关上样品室盖，打开仪器电源开始自检；预热，仪器自检完成后进入预热状态，若要精确测量，预热时间需在15分钟以上；确认比色皿，在样品移入比色皿前先确认比色皿是干净、无残留物的，若测试波长小于300nm，必须使用石英比色皿；测量模式选择，主界面选择所需的模式，按enter键进入；设置波长，在基本模式下，按“setλ”键进入波长设定界面，手动输入波长后按“enter”键确认；校准100％t/0abs，将参照系置于光路中，按“100％t/0abs”键校准；测量样品，将样品置于测量槽中，拉动测量杆使样品置于光路中，读取测量结果。结果如表4和图3所示。

表4不同批次产品中的od值

从表4中分析可知：培养工艺优化前od值较低，平均只有4.652。而培养工艺优化后有明显的增长，平均达到8.85。同时，从图3中分析可知，培养工艺优化后，不同时间段的od值均明显升高。从而证明了工艺优化效果明显，提高了抗原含量。

4)成品中效价的检测分析

具体操作为：用体重1.5～2.0kg兔6只，4只各皮下注射疫苗1.0ml，另2只做对照。接种21日后，每只兔各皮下注射多杀性巴氏杆菌c45-2株(cvcc44502)强毒菌液1mld，观察8日。对照兔应全部死亡，免疫兔应至少保护2只。结果如表5所示。

表5不同批次成品中的效价

从表5中分析可知，发酵批号为01、02、03是旧工艺生产，其保护率为1/4(25％保护率)，2/4(50％保护率)，03组3/4(75％保护率)。酵批号为2020001至2020007是新工艺生产，其保护率为3/4(75％保护率)和4/4(100％保护率)，明显好于旧工艺。

综上所述，本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，在培养过程中，通过在合适的时间点添加适量的补料用以添加其生长过程中的营养物质，同时通过将ph值控制在适合生长的范围内，达到高密度培养效果，最终使得在更短的培养时间内，收获更多的抗原，活菌数大幅增加，同时，对发酵后的菌液采用阿法拉伐离心机进行离心，去除菌液中内毒素。本发明的牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法具有培养菌液活菌数更高、生长更快、成品内毒素更低、更安全、产品质量更好的优势。

当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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