一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法与流程

2021-01-08 12:01:33|

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本发明属于免疫学领域，具体涉及一种冻干人用cpg佐剂狂犬病疫苗的制备方法。

背景技术：

狂犬病是一种致死率接近100％人畜共患疾病，它的高度致死性对整个社会造成很大危害。巴斯德首先发现了狂犬病病毒，并成功研制出了疫苗。狂犬病疫苗的研制及应用已有将近200多年，疫苗的生产制备方式不断更新。目前，上市的狂犬疫苗有vero细胞疫苗、原代地鼠肾细胞疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞培养疫苗等。现代人用细胞培养疫苗已得到广泛的应用。但目前在我国上市的人用狂犬疫苗，均无佐剂成分，暴露后患者需同时注射免疫球蛋白，增加患者的经济负担。

佐剂是一种非特异性免疫增强剂，能够增强机体对抗原的免疫应答，引导特异的免疫反应。为了探究减少狂犬病疫苗的抗原用量的同时，增强疫苗的免疫效果，在疫苗内加入佐剂或免疫促进剂方面，国内外众多学者进行可很多尝试和研究。

目前佐剂主要有铝佐剂、皮卡佐剂、cpg佐剂。截至目前，铝佐剂在人用疫苗应用最广泛，也被认为是最安全的一种佐剂。铝佐剂的主要成分是ai(oh)3，可以诱导强烈体液免疫反应，而对细胞免疫的作用则不明显。因为铝佐剂具有缓慢释放抗原的特点，所以早期并不能产生效价较高的抗体。因此不利于预防和保护狂犬病病毒感染者。皮卡(pika)佐剂作为一种免疫刺激复合物，被证明在狂犬病预防方面有显著作用，皮卡狂犬病疫苗是一种新型佐剂狂犬病疫苗，由我国学者林海祥于1991年至1993年在法国巴斯德研究所工作时的研究成果。皮卡佐剂既能够增强非特异性免疫应答，也能增强特异性体液免疫应答。皮卡是一种聚肌胞衍生物，为极强的干扰素诱生剂，促进细胞免疫和体液免疫。cpg佐剂可以由人工合成，如含未甲基化cpg基序的寡核苷酸(odn)，也可以来源于原核生物，如细菌基因组dna。cpg-dna的免疫刺激活性受其长度，cpg基序的数目和cpg基序序列的影响。佐剂的加入可以降低抗原使用量和免疫球蛋白使用量。

然而将cpg佐剂用于制备狂犬疫苗却未见报道或使用，亟需一种人用cpg佐剂狂犬病疫苗。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种冻干人用cpg佐剂狂犬病疫苗的制备方法。本发明在现有狂犬疫苗工艺中添加cpg佐剂，使患者提前产生抗体，从而提前保证患者的生命安全。本发明采用人工合成的甲基化寡聚核苷酸iss-1018型别的cpg佐剂制备成疫苗，通过试验证明该佐剂疫苗有良好的免疫效果，提前产生抗体的同时保证人狂犬病疫苗的稳定性；而且该佐剂疫苗尚无不良反应。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种冻干人用cpg佐剂狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)人用狂犬病疫苗制备：人用狂犬病疫苗为狂犬病毒株pv-2061株、pm株、vnukovo-32株、flury株、ag株、ctn-1株、cvs株中的一种，接种于真核细胞，进行培养，再收获病毒液，经灭活，纯化后制得；

(2)cpg佐剂溶液配制：将iss1018佐剂加入到适量的pbs中，配置成终含量0.1～5mg/mliss1018佐剂的溶液，充分搅拌，并过滤除菌即制得cpg佐剂溶液；

(3)冻干人用cpg佐剂狂犬疫苗制备：在步骤(1)得到的人用狂犬病疫苗中加入步骤(2)配制浓度的cpg佐剂溶液，混合均匀后，加入赋形剂，分装到药学上可接受的包装容器中，经冻干得到所述冻干人用cpg佐剂狂犬疫苗，其中人用狂犬病疫苗含量为0.1～15iu，佐剂含量为0.1～5mg/ml。

进一步地，所述真核细胞包括vero细胞。

进一步地，所述赋形剂包括蔗糖、右旋糖酐40。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

目前在我国上市的人用狂犬疫苗，均无佐剂成分，故而，该新型疫苗与无佐剂疫苗相比，可以刺激小鼠更早的产生更高的血清中和抗体，同时分泌更多的il-2，ifn-γ细胞因子。采用叙利亚金黄色地鼠模型证实了佐剂疫苗的加入可以减少免疫球蛋白的使用量，减轻暴露后患者的经济负担。cpg佐剂与狂犬病疫苗联合使用，既可以增强细胞免疫和体液免疫应答水平，尤其是产生早期的体液保护效果，又可以减少抗原使用量，降低疫苗成本。本发明提供的方法简单，效价显著提高，生产的疫苗可以降低原工艺疫苗的抗原使用量，降低人免疫球蛋白的使用量，节约疫苗生产成本，通过佐剂的有效性和疫苗剂量配比关系试验证明本疫苗有良好的免疫效果，提前产生抗体的同时保证人狂犬病疫苗的稳定性；而且该疫苗尚无不良反应。在当前抗狂犬病免疫球蛋白价格昂贵和紧缺的情况下，cpg佐剂人用狂犬病疫苗具有广阔的前景。

附图说明

图1为本发明实施例4中cpg-1018狂犬病疫苗免疫小鼠中和抗体结果图；

图2为本发明实施例4中对照组狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；

图3为本发明实施例4中实验组-1狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；

图4为本发明实施例4中实验组-2狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；

图5为本发明实施例4中实验组-3狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1

灭活的纯化的狂犬病病毒的制备

1.细胞制备

将保存于液氮中的vero细胞进行复苏，经细胞方瓶、细胞工厂扩增后，用胰蛋白酶进行消化，加入细胞培养液混合均匀后，置37℃培养成均匀的单层细胞；其中，细胞培养液制备方法如下：将mem培养基按配方用注射用水进行溶解，经0.2μm无菌滤膜过滤后加入8％新生牛血清制成细胞培养液。

2.病毒接种

当细胞培养成致密单层后，弃去细胞培养液，用胰酶消化，将毒种(ctn株)和细胞按0.001moi进行混匀，37℃培养3天。用胰酶消化后加入病毒维持液，33～35℃继续培养，其中，病毒维持液制备方法如下：将mem培养基按配方用注射用水进行溶解，经0.2μm无菌滤膜过滤后加入0.1％人血白蛋白制成病毒维持液。

3.病毒收获

更换病毒维持液后，每隔4天收获病毒液、补加维持液，共收获4次。

4.病毒收获液浓缩

将同一批生产的多个单次病毒收获液合并。合并后的病毒液用截留分子量为100-300kd的超滤膜包进行30～60倍超滤浓缩。

5.病毒灭活

于浓缩后的病毒收获液中按比例加入β-丙内酯灭活96小时，灭活到期后在37℃水浴，以确保β-丙内酯完全水解。

6.病毒的层析纯化

采用柱层析法对灭活后的病毒液进行纯化，在280nm紫外检测下收取狂犬病病毒蛋白峰，即为病毒纯化液。用于配制bcg-cpg-dna佐剂狂犬病疫苗。

实施例2

摸索佐剂含量的范围

根据人和动物按体表面积折算等效剂量比值，小鼠和人之间剂量以80倍计算。控制相同的抗原的含量(0.0056iu)，配方及实验程序如下表1：

表1

通过三针法免疫小鼠后，检测血清的中和抗体滴度。

中和抗体结果如下表2：

表2

佐剂添加后，中和抗体水平明显提升。

初免后7天时，随佐剂量增加，血清的中和抗体水平增大，增加不明显。14天后滴度均达到0.5，转为阳性，但没有随佐剂的量增大而升高。

实施例3

摸索抗原含量的范围

根据人和动物按体表面积折算等效剂量比值，小鼠和人之间剂量以80倍计算。控制佐剂的含量相同(30ug/ml)，配方及实验程序如下表3：

表3

通过三针法免疫小鼠后，检测血清的中和抗体滴度，结果如下表4，

表4

佐剂添加后，实验组中，佐剂能提高中和抗体滴度，并且随时间增长而升高。

实施例4

cpg—iss1018

1.材料

cpg-iss1018由广州锐博生物技术有限公司合成；冻干人用狂犬病疫苗由长春卓谊生物股份有限公司生产；4～6周龄，12～14g，icr小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司；dmembasic(1×)、0.25％trypsin-edta购自gibco；胎牛血清购自武汉三利生物技术有限公司；狂犬病毒cvs-11株、第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品购自中国食品药品检定研究院；狂犬病毒荧光抗体(fifc)购自中国农业科学院长春兽医研究所；伊文斯蓝染色液(0.5％)购自上海源叶生物科技有限公司；氯化钠、氯化钾购自江苏省勤奋药业有限公司；十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司；

2.方法

2.1动物实验

2.1.1稀配疫苗

(1)将20mg/mlcpg-iss1018分别按照1.2ug/剂、12ug/剂、20ug/剂的剂量加至无菌pbs中，作为稀释剂。

(2)0.5ml注射用水复溶批号为201708012的冻干人用狂犬病疫苗；

(3)用稀释剂将狂犬病疫苗按照1:3、1:5、1:5、1:5系列进行稀释，狂犬病疫苗对应稀释倍数分别为3×、15×、75×、375×，稀释方法见表5。

表5疫苗稀释方法

注：对照组用pbs稀释，实验组用稀释剂稀释

2.1.2动物免疫

小鼠随机分为4组，16只/组，用稀配好的375×疫苗，以0.5ml/只腹腔免疫，采用3针法，在0天、3天、7天免疫，分别在7天、9天、11天、14天摘眼球取血。

2.2免疫荧光抑制试验检测血清中和抗体

2.2.1血液处理

(1)摘眼球收集的血液，在2～8℃静置12h，1000r/min离心15min；

(2)收集血清后，至56℃水浴中灭活半小时，转至-80℃保存

2.2.2免疫荧光抑制实验步骤

(1)血清与病毒中和

(1.1)吸取含10％胎牛血清的dmem培养基于96孔细胞培养板中，每孔100ul。

(1.2)分别将50ul待检血清和标准血清加至每块板的第一列孔中，充分混匀后，吸取50ul到第2列孔中，以此类推3倍稀释，最后一孔吸出50ul弃掉。

(1.3)将狂犬病毒cvs-11株用含10％胎牛血清的dmem培养基以1:200进行稀释，每孔50ul加至96孔细胞板中。

(1.4)37℃孵育1小时，使抗体和病毒进行中和。

(2)细胞消化

(2.1)无菌操作，打开75cm²细胞培养瓶的瓶盖，倒掉细胞培养瓶中培养液，吸取0.25％trypsin-edta10ml洗细胞表面一次，弃去。

(2.2)再补加10ml0.25％trypsin-edta进行消化，当看到细胞壁上出现毛玻璃状或轻微裂纹时将0.25％trypsin-edta倒掉，静置片刻。

(2.3)吸取10ml含10％胎牛血清dmem进行吹打，吹打力度适中，当培养瓶中无细胞团块时，吸取少量，细胞计数。

(3)接种细胞

(3.1)用含10％胎牛血清dmem将细胞稀释至1×10⁶个/ml。

(3.2)在中和后的96孔细胞板中每孔加50ul浓度为1×10⁶个/ml的bsr细胞，置于co2培养箱中，37℃±1℃，5％co2培养24小时。

(4)固定及染色

(4.1)弃掉细胞培养基，加100ul80％丙酮溶液，2～8℃固定30min；

(4.2)荧光抗体按1:200倍进行稀释，伊文斯蓝染液按1:100倍稀释，充分混匀后待用。

(4.3)弃掉孔内液体拍干，每孔加50ul孵育液，37℃±1℃孵育1小时；再弃掉孔内液体，0.01mpbs缓冲液洗板1次。

(5)计数计算

生物显微镜分别计数终孔和前一孔荧光灶占比。

3.结果

为研究cpg-iss1018佐剂疫苗增强体液免疫应答水平，分别在初次免疫第7天、第9天、第11天、第14天眼球采血，分离血清，采用免疫荧光抑制实验(rffitc)检测中和抗体水平，并评价其阳转率。结果如表6所示。以初免后天数为横坐标，分别以中和抗体滴度和阳转率为纵坐标作图，如图1-1、1-2所示。对照组为不含佐剂的人用狂犬病疫苗。

表6血清中和抗体滴度及阳转率结果

(3.1)对照组中和抗体水平较低，同时阳转率较低，与实验组成鲜明对比，实验成立。

(3.2)实验组和对照组比较可以看出，cpg-iss1018佐剂的添加，中和抗体滴度逐渐升高，体液免疫效果增强，使阳转率较对照组有所提前。

(3.3)从图1-1可以明显看出，中和抗体滴度随佐剂的量增大而提升。

(3.4)三组实验组比较看，中高剂量的cpg-iss1018佐剂效果比低剂量的效果好，能在7天时全部阳转。

4.结论

cpg-iss1018佐剂疫苗，能显著提升体液免疫应答水平，其中和抗体滴度明显升高，提前阳转，起到提前保护作用。

根据人和动物按体表面积折算等效剂量比值，小鼠和人之间剂量以80倍计算。动物实验中抗原含量范围在0.001～0.188iu/ml，佐剂剂量范围1.25～62.5ug/ml。人用狂犬病疫苗含量为0.1～15iu，佐剂含量为0.1～5mg/ml。

实施例5

冻干人用cpg佐剂狂犬病疫苗的制备

将佐剂溶液与人用狂犬病疫苗原液按6:7比例混合，充分混匀后，加入相应的赋形剂，加1mpbs缓冲液使总体积为3l，混合均匀后，用碳酸氢钠溶液调节ph值，使其至7.2～8.0，用灌装系统将半成品以0.6ml/支规格分装到包材中，经过冻干机冻干，参数摸索，见下表7。选择合适的冻干曲线进行冻干。

表7