一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法与流程

本申请涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法。

背景技术：

脊髓损伤是主要因外伤所致的疾患，常导致脊髓局部大量神经细胞死亡、纤维束断裂，造成患者损伤平面以下不同程度的感觉、运动及内脏功能障碍。

针对脊髓损伤处神经纤维再生、通路重建及功能恢复，目前常用一种治疗方式是植入已经分化好的胶质细胞，例如嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells，oecs)，从而有利于神经的再生。嗅鞘细胞具有长突起，可修复原有损伤的神经元轴突，同时能分泌多种神经营养因子(如ngf、bdnf、gdnf)，可以为轴突再生提供适宜微环境，有利于神经的再生，改善脊髓损伤后的神经功能。

目前，采用oecs治疗损伤脊髓，多数采用将嗅鞘细胞注射移植至机体损伤脊髓处的模式，但是，在实际的治疗过程中，脊髓损伤存在较大的组织坏死囊腔，使得植入的oecs缺乏细胞外基质支持以及缺乏血供和必要的生存微环境，因此，移植至损伤脊髓处的oecs在损伤区大量死亡，导致oecs对损伤脊髓治疗的效果欠佳，对轴突再生促进作用较小，对髓鞘形成及机体运动功能恢复也不明显。

技术实现要素：

本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，以解决现有的嗅鞘细胞在实际移植治疗过程中，存活率较低，对损伤脊髓的治疗效果欠佳的问题。

本申请提供一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤s100，在ed的介导作用下，使ha与adh进行交联反应，制得ha水凝胶；

步骤s200，采用液氮梯度冷冻法，将ha水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架；

步骤s300，采用naio4氧化法，将antingr连接到具有纵向通道结构的ha支架上，得到接枝antingr的ha水凝胶支架；

步骤s400，将接枝antingr的ha水凝胶支架置于培养孔板内，调节其ph值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的dmem/f-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。

可选地，步骤s100具体包括，

(1)称取0.04gpll，加入去离子水溶解，并调节其ph值至11左右；

(2)在pll溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，充分搅拌至充分溶解后,加入1.4gadh，搅拌24h，调节该混合溶液的ph值至4.7左右，得到中间混合液；

(3)将0.4gedc先用去离子水溶解后，再逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌至溶液渐成凝胶；

(4)将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，调节ph值至7，并置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到ha水凝胶；

(5)将冻干的ha水凝胶材料置于真空干燥器中备用。

可选地，步骤s200具体包括，

(1)将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具；

(2)将ha水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的ha水凝胶上下端暴露；

(3)将注有ha水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min；

(4)将注有ha水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架，将其放入真空干燥器中备用。

可选地，步骤s300，具体包括，

(1)取5mgantingr溶于10ml去离子水中，加入100mgnaio4，轻微搅拌至充分溶解；

(2)将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的naio4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；

(3)对制备得到的具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antingr的ha水凝胶支架。

可选地，步骤s400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：

1)取新生的sd大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；

2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有pbs液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的dmem/f-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；

3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的co2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；

4)加入含含胎牛血清的dmem/f-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的dmem/f-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；

5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养12小时；

6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养24小时；

7)将细胞悬液以1×10⁸l^-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的co2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。

可选地，步骤s400中，嗅鞘细胞接种的浓度为1×10⁹l^-1。

本申请还提供一种采用上述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。

本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，用于制备嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ha水凝胶冻干后的大体形态及超微结构，其中，图1-a、图1-b为ha水凝胶冻干后的大体形态图，图1-c的比例尺scalebar为100μm的ha水凝胶冻干后的微观结构图，图1-d为比例尺scalebar：50μm的ha水凝胶冻干后的微观结构图；

图2为ha水凝胶支架的外形及内部结构，其中，图2-a为ha水凝胶支架的外观形态，图2-b为ha水凝胶支架的的横断面微观形貌，图2-c为scalebar：50μm的ha水凝胶支架的纵切面微观形貌，图2-d为scalebar：100μm的ha水凝胶支架的纵切面微观形貌；

图3为ha水凝胶支架上接枝的antingr的免疫荧光染色显示图；

图4为培养的嗅鞘细胞的形貌图；

图5为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的免疫荧光染色显示图，其中，图5-a、图5-b分别为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的细胞表达gfap、p75，图5-c显示hoechst染色显示的细胞核，图5-d图为上述三种染色的叠加；

图6为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的微观结构图。

具体实施方式

本申请提供一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，用于制备嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。

本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤s100，在碳二亚胺盐酸盐(edc)的介导作用下，使透明质酸(ha)与己二酸二酰肼(adh)进行交联反应，制得ha水凝胶。

本实例中，步骤s100具体实现过程包括：

步骤s110，称取0.04g多聚左旋赖氨酸(pll)，其分子量范围mw为150-300kda，加入去离子水20ml溶解，使用1mol/l的naoh溶液调节其ph值至11左右；

步骤s120，在pll溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，其分子量范围mw为2.6-2.7millionda，用磁力搅拌器搅拌4-5h使其均匀溶解,用保鲜膜封住烧杯口、备用，以防止干凝；

步骤s130，加入1.4gadh，其分子量范围mw为174.2da，搅拌24h，使用1mol/l的hcl溶液调节该混合溶液的ph值至4.7左右，得到中间混合液；

步骤s140，用去离子水溶解0.4gedc，其分子量范围mw为191.7da，将溶解的edc溶液逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌10-20min至溶液渐成凝胶；

步骤s150，将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，使用1mol/l的naoh调节凝胶的ph值至7左右，倒入培养孔板或其他容器内，置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到ha水凝胶；应当说明，该步骤中，凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗的过程具体为，将凝胶置于超声波清洗器中，用去离子水反复清洗；

步骤s160，将冻干的ha水凝胶材料置于真空干燥器中备用。

冻干前，ha水凝胶呈胶冻状，粘弹性良好。冻干后，ha水凝胶固定成型，如图1-a与1-b所示，呈圆柱体外形，可切成不同厚度的薄片，用于细胞的3d(threedimensional)培养。

图1-c、1-d为ha水凝胶冻干后的微结构，其中，图1-c的比例尺scalebar为100μm，图1-d的比例尺scalebar为50μm，如图所示，扫描电镜下，ha水凝胶呈疏松的多孔结构，孔洞分布于整个凝胶，孔壁薄，孔径在20μm-100μm间，其中，以50μm左右孔径为多，另外，孔洞的孔壁上有小孔隙，使孔洞相互交通。

步骤s200，采用液氮梯度冷冻法，将ha水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架。

本申请中，步骤s200的具体实现过程包括：

步骤s210，将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具。应当说明，本领域技术人员可根据实际需要，选择塑料吸管的数量与直径，例如，采用10个直径为3.5mm的塑料吸管，其均属于本申请的保护范围。

步骤s220，采将ha水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的ha水凝胶上下端暴露。

步骤s230，将注有ha水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min。应当说明，梯度冷冻为本领域常用技术，其具体实现过程将不在此进行赘述。

步骤s240，将注有ha水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架，并将其放入真空干燥器中备用。

本实例中，ha水凝胶支架外形呈圆柱状，直径为3mm，如图2-a所示。ha水凝胶支架质地柔韧，可根据需要切割成不同形状和大小，扫描电镜观察其横断面呈蜂窝状结构，显示通道密集排列，如图2-b所示。扫描电镜观察ha水凝胶支架的纵切面，可见内部呈纵向多通道结构，通道并行排列，纵向贯通，直径在50μm左右，通道之间借孔隙彼此相通，如图2-c、2-d所示。

步骤s300，采用高碘酸钠(naio4)氧化法，将ngr抗体(antingr)连接到具有纵向通道结构的ha支架上，得到接枝antingr的ha水凝胶支架。

应当说明，naio4氧化法是将ngr抗体fc段的醣残基氧化为醛基，使之与ha水凝胶支架中游离的酰肼基团发生作用，进而将ngr抗体连接到ha水凝胶支架上。另外，本申请中，ngr抗体分子含4条肽链，包括2条重链和2条轻链，其中，2条重链的羧基端为fc段。

本申请中，步骤s300的具体实现过程包括：

步骤s310，取5mg的antingr溶于10ml去离子水中，加入100mgnaio4，轻微搅拌30min至充分溶解；

步骤s320，将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的naio4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；

步骤s330，对制备得到的具有纵向多通道结构的ha水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antingr的ha水凝胶支架。

图3为ha水凝胶支架上接枝的antingr的免疫荧光染色显示图，通过免疫荧光染色试验显示图可知，antingr已经成功地接枝到ha水凝胶支架上。

步骤s400，将接枝antingr的ha水凝胶支架置于培养孔板内，调节其ph值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的dmem/f-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。实际制备过程中，在培养5-7天后，可用共聚焦显微镜或其他显微镜观察细胞生长情况并进行细胞计数，若接枝antingr的ha水凝胶支架上附着有大量嗅鞘细胞，则判定制备得到嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。

应当说明，培养孔板的类型有多种，例如6、12、24、96孔培养孔板，本领域技术人员可根据实际需要选择合适孔数的培养孔板，其均属于本申请的保护范围。另外，本实例中，在培养基内接种嗅鞘细胞，其接种浓度为1×10⁹l^-1。当然，本领域技术人员可根据实际需要调整接种密度，其均属于本申请的保护范围。

步骤s400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：

1)取新生的sd大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；

2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有pbs液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的dmem/f-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；

3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的co2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；

4)加入含含胎牛血清的dmem/f-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的dmem/f-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；

5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养12小时；

6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养24小时；

7)将细胞悬液以1×10⁸l^-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的co2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。

图4为培养的嗅鞘细胞的形貌图，如图4所示，培养的嗅球细胞胞体呈梭形或三角形，伸出细长的突起，突起之间形成连接。

将嗅鞘细胞与接枝antingr的ha水凝胶共同培养，对制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料进行免疫荧光染色测试，图5为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的免疫荧光染色显示图，其中，图5-a、图5-b分别为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的细胞表达gfap、p75，图5-c显示hoechst染色显示的细胞核，图5-d图为上述三种染色的叠加。通过图5中的免疫荧光染色显示图可知，嗅鞘细胞在接枝antingr的ha水凝胶支架上存活良好。

图6为嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的微观结构图,如图6所示，嗅鞘细胞在接枝antingr的ha水凝胶支架上粘附生长，伸出细长突起，突起之间形成连接。

本申请还提供由上述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。

以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。

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