一种适用于木本植物组织培养的常用培养基的制作方法

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种适用于木本植物组织培养的常用培养基。

背景技术：

植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，起始于20世纪30年代，经历80多年的基础研究和技术完善。在农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物进行组织培养研究并取得了成功。在马铃薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、杨树以及一些花卉上已有商业化的试管苗生产体系，产生了良好的经济效益和社会效益，形成了“兰花工业”、“香蕉工业”。植物组织培养，可以快速提高多年生或种子繁殖系数小、难度大的植物的繁殖速度。另外，组培脱毒技术提高植株的产量减少农药化肥使用，在脱毒马铃薯、脱毒草莓中有广泛的应用。组织培养对很多果树、苗木、林木、中药材具有巨大的技术优势，可以快速将优势单株进行工厂化、批量化生产，减少繁殖周期，降低时间成本。植物组织培养，在植物育种、林木种质资源保存和交换、遗传学、分子生物学、基因工程和生物工程等方面的研究都有很好的应用。

申请人自2004年开展桉树优良单株的组培技术研究，在研究过程中，使用过盐浓度较高的ms培养基，对生长速度慢、无机盐浓度要求低的植物易产生不良影响；使用过盐浓度较低的white培养基、硝态氮和钙、钾含量高，不含碘和钼的wpm培养基以及低nh4⁺含量的b5培养基，均表现不理想，褐化、死亡、苗弱、叶色不正常或长势缓慢等情况常常发生。

经过不断的对基本培养基进行调整，最终找到一个培养基，命名为b1培养基，非常适合桉树生长，苗壮，长势正常。在以后的豆腐菜、刺槐、红叶石楠、金叶莸、花叶锦带、红王子锦带、厚朴、海州常山、喜树、构树、核桃、粉葛和猕猴桃等多种植物组培研究中，以b1作为基本培养基，均取得很好的效果。

技术实现要素：

本发明提供一种适用于木本植物组织培养的常用培养基（即b1培养基），营养成分全面，盐浓度、no³⁺和nh4⁺比例适中，适合做很多植物组织培养研究中的基本培养基，适合大多数植物生长。

本发明解决上述问题所采用的技术方案如下：

一种适用于木本植物组织培养的常用培养基，所述基础培养基包括以下成分及含量：

大量元素：nh4no3240~480mg/l、kno31200~2400mg/l、ca(no3)2·4h2o400~800mg/l、mgso4·7h2o240~480mg/l及kh2po4183~366mg/l；

铁盐：feso4·7h2o19.46~36.14mg/l及na2-edta26.11~48.49mg/l；

微量元素：mnso4·4h2o18~27mg/l、znso4·7h2o8.64~12.96mg/l、cuso4·5h2o0.02~0.03mg/l、na2moo4·2h2o0.2~0.3mg/l、ki0.664~0.996mg/l及h3bo34.64~6.96mg/l；

有机物：vb52.5mg/l、vb61.2mg/l、vb14.795mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸3.997mg/l、l-半胱氨酸7.5mg/l、vb210mg/l、vh0.3mg/l、泛酸钙2.395mg/l及vc2mg/l；

及蔗糖10~50g/l。

进一步地，所述基础培养基包括以下成分及含量：

大量元素：nh4no3360mg/l、kno31800mg/l、ca(no3)2·4h2o600mg/l、mgso4·7h2o360mg/l及kh2po4275mg/l；

铁盐：feso4·7h2o27.8mg/l及na2-edta37.3mg/l；

微量元素：mnso4·4h2o22.5mg/l、znso4·7h2o10.8mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、ki0.83mg/l及h3bo35.8mg/l；

有机物：vb52.5mg/l、vb61.2mg/l、vb14.795mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸3.997mg/l、l-半胱氨酸7.5mg/l、vb210mg/l、vh0.3mg/l、泛酸钙2.395mg/l及vc2mg/l；

及蔗糖30g/l。

进一步地，所述基础培养基的成分还包括起固定作用的琼脂，其具体用量是根据所选用的琼脂的凝固能力而确定的。

进一步地，所述微量元素中还包括alcl3，所述alcl3的含量为0.024~0.036mg/l，具体的含量可根据所选植物种类对氯的需求不同而上下浮动，优选的，alcl3的含量为0.03mg/l。

进一步地，所述基础培养基的成分还包括激素，所述激素及含量为：6-ba0.4mg/l及naa0.2mg/l，该含量仅作为一种优选，具体可根据所选植物种类对激素的需求不同而选择。

进一步地，所述基础培养基的ph值范围为5.4-6.0，该范围仅作为一种优选，具体可根据所选植物种类对环境酸碱度的需求不同而改变。

进一步地，使用所述基础培养基进行植物组织培养时的培养温度为20-25℃，该范围仅作为一种优选，具体可根据所选植物种类对环境温度的需求不同而改变。

进一步地，使用所述基础培养基进行植物组织培养时的光照条件是暗培养7-10天，再在光照强度为2000lx-3000lx，光照时间14h/d的条件下进行培养。需要先进行暗培养的原因是：该基本培养基中增加了核黄素vb２，核黄素vb２参与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育，能够参与细胞的生长代谢，是肌体组织代谢和修复的必须营养素。但其缺点是见光破坏，因此需要在弱光下培养效果才明显。

本发明所提供的基本培养基的技术特点：

（1）本发明所提供的基本培养基营养成分全面，盐浓度适中，适合做很多植物组织培养研究中的基本培养基，适合大多数植物生长，表现生长正常、组培苗健康、环境适应能力强、移栽成活率高等特点。与常用培养基ms和white比较，其盐浓度适中，不会因为盐浓度太高导致盐中毒或因盐浓度低而造成营养不良的情况，减少幼苗死亡或长势较弱等情况的发生率。

（2）本发明所提供的基本培养基中no³⁺和nh4⁺比例适中，防止因nh4⁺浓度过高造成玻璃化、水肿、小苗顶部发黑、切口和根系发黑、落叶、叶子黄化或变褐色后脱落成光棍等现象发生。

（3）本发明所提供的基本培养基的有机物中盐酸硫胺素vb1和甘氨酸含量比其他基本培养基高，同时增加了l-半胱氨酸、核黄素vb2、生物素vh和泛酸钙（vb5的钙盐）。其中，盐酸硫胺素vb1在体内的作用在于以羧化酶，转羟乙醛酶系统的辅酶形式参加糖类代谢，是物质代谢和能量代谢中具有关键性的物质基础，参与体内的氧化脱羧作用，为支链氨基酸代谢所必需；甘氨酸促进离体根的生长；l-半胱氨酸可预防褐化发生，核黄素vb2、生物素vh和泛酸钙有利于促进试管苗的生长；核黄素vb2是体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），缺乏时影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍；生物素vh是合成维生素c的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，是生物体固定二氧化碳的重要因素，是多种羧化酶的辅酶，在羧化酶反应中起co2载体的作用；泛酸钙是辅酶a的成分，参与蛋白质、脂肪、糖在体内的新陈代谢。

（4）本发明所提供的基本培养基中还加入其他常用培养基中没有的营养成分alcl3，一般的植物对氯的需要量很小，而盐生植物含氯相对较高，约70～100mg/l，但在光合作用中cl^-参加水的光解，叶和根细胞的分裂也需要cl^-的参与，cl^-还与k⁺等一起参与渗透势的调节，如与k⁺和苹果酸一起调节气孔开闭，植物缺氯会导致叶片萎蔫，失绿坏死，最后变为褐色，同时根系生长受阻、变粗，根尖变为棒状。只有少数对cl^-敏感的植物（如蓝莓组织培养）在培养中不需要加cl^-外，在其他植物的组织培养的基本培养基中加入cl^-，对培养效果能够起到促进作用。

本发明的有益效果：本发明提供的基础培养基营养成分全面，盐浓度、no³⁺和nh4⁺比例适中，有机物中盐酸硫胺素vb1和甘氨酸含量比其他基本培养基高，同时增加了l-半胱氨酸、核黄素vb2、生物素vh和泛酸钙（vb5的钙盐），更加适应植物的生长需求，适合做很多植物组织培养研究中的基本培养基，适合大多数植物生长。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种适用于木本植物组织培养的常用培养基，所述基础培养基的各成分及其含量如下：

大量元素：nh4no3360mg/l、kno31800mg/l、ca(no3)2·4h2o600mg/l、mgso4·7h2o360mg/l及kh2po4275mg/l；

铁盐：feso4·7h2o27.8mg/l及na2-edta37.3mg/l；

微量元素：mnso4·4h2o22.5mg/l、znso4·7h2o10.8mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、ki0.83mg/l、h3bo35.8mg/l及alcl30.03mg/l；

有机物：vb52.5mg/l、vb61.2mg/l、vb14.795mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸3.997mg/l、l-半胱氨酸7.5mg/l、vb210mg/l、vh0.3mg/l、泛酸钙2.395mg/l及vc2mg/l；

激素：6-ba0.4mg/l及naa0.2mg/l；

及蔗糖30g/l。

上述基础培养基的配置方法为：将大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素先分别配制成浓缩母液，按比例量取大量元素、微量元素、铁盐、有机物的浓缩母液，每加入一种浓缩母液，都要充分混合后再加第二种浓缩母液；根据培养目的的不同，设计不同的激素配方，按配方加入激素；加30g/l蔗糖、3.6-4.2g/l琼脂溶化后定容；然后用0.1%的naoh和0.1%的hcl调节ph值至5.4-6.0；冷却到50℃后分装，放入高压灭菌锅中，在1.1个大气压下灭菌20min后放入接种室中观察备用。

实施例2

使用实施例1所述的培养基对植物进行组织培养的操作方法：

（1）外植体选择及消毒

采集需要培养的植物的幼嫩茎段、花茎、叶、块茎等作为外植体，用流动自来水冲洗干净，放入75％的酒精中浸泡0-30s，取出用无菌水冲洗2-3次，然后用0.1%的升汞消毒3-10min，再用无菌水冲洗6-8次，使用无菌滤纸吸干其表面水分，用手术剪刀对其进行适当修剪，然后用镊子把消过毒的外植体接入实施例1中配制好的培养基中；

（2）培养

在20-25℃的恒温条件下，先暗培养7-10天，然后在光照强度为2000lx-3000lx，光照时间14h/d的条件下进行培养。每3天观察一次，记录其生长状况，并随时清除污染﹑死亡的培养瓶。

外植体经过培养腋芽萌发长高，产生多个芽，切下这些芽，继续转入新的培养基中进行培养，以达到增殖的目的。当外植体增殖培养到有足够多的外植体时，需要进行生根的诱导，使其长成一棵完整的植株。

实施例3

在桉树多个无性系、红叶臭椿、粉葛、豆腐菜、刺槐、红叶石楠、金叶莸、花叶锦带、红王子锦带、厚朴、海州常山、喜树、构树、核桃、粉葛和猕猴桃等多种植物的组织培养中，本发明提供的基础培养基与常规培养基相比表现出明显效果，具体表现实例如下：

（1）试验苗在培养过程中，如果使用的培养基为ms培养基，植物顶部生长点出现褐色水珠，并伴随着死亡出现，同时会出现生根苗根系顶端变黑死亡，停止生长等情况，在桉树多个无性系和草珊瑚的组培培养试验中，表现非常明显，而把ms培养基替换为本发明提供的基本培养基后，情况逐渐好转，转接一两次后，试验苗完全健康生长。

（2）试验苗在培养过程中，如果使用的培养基为ms培养基或其他培养基，植物玻璃化、水肿现象十分严重，把培养基换成本发明提供的基本培养基后情况逐渐好转，最后水肿和玻璃化完全消失，试验苗长势健壮，在红叶臭椿、豆腐柴、金叶莸、花叶锦带、红王子锦带、厚朴、构树、猕猴桃等植物组织培养研究中，表现较为突出。

（3）试验苗在培养过程中，如果使用的培养基为ms培养基或其他培养基，植物出现落叶、叶子黄化后脱落成光棍等情况常常发生。把培养基换成本发明提供的基本培养基后情况有所好转，新长出的顶芽长出新叶，在核桃和油橄榄的组培试验中，表现明显。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

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