一种多取代苯甲酰胺化合物及其制备方法和应用与流程

本发明设计合成药物技术领域，具体涉及一种多取代苯甲酰胺化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由疱疹病毒科(herpesviridae)的伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。世界动物卫生组织(oie)将其列为b类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

目前，免疫接种是预防和控制pr的主要措施。国内外已研制成功伪狂犬的常规弱毒疫苗、灭活疫苗以及基因缺失疫苗(包括基因缺失弱毒苗和灭活苗)，这些疫苗都能有效地减轻或防止pr的i临诊症状，从而减少该病造成的经济损失。国内主要应用灭活苗和弱毒苗预防pr，具有良好的免疫效果。灭活疫苗安全性较高但具有使用剂量大、成本高，偶尔有过敏反应的缺点。弱毒疫苗虽然成本低，免疫源性好，但也有未经充分致弱的弱毒苗的毒力可能会返强而导致疾病的流行以及建立潜伏感染，并有可能散毒的隐患。

与疫苗不同，小分子药物具有诸多的优点，比如生产成本低(容易仿制)、方便储存，运输方便、能穿过细胞膜，作用于细胞内靶点、组织渗透性更好、能部分通过血脑屏障、没有免疫原性、广谱性等。根据文献检索，目前尚未发现国内外对抗伪狂犬病毒的小分子药物的设计、合成及相关活性研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多取代苯甲酰胺化合物及其制备方法和应用。本发明所采用的技术方案如下：

第一个方面，本发明提供一种多取代苯甲酰胺化合物，具有如式ia～c所示结构：

式ia-c中，r选自3-叔丁氧羰基氨基哌啶(ia)、4-芴基氨基哌啶(ib)、n-(3-三氟甲基苯基)哌嗪(ic)中的一种。

第二个方面，本发明提供上述多取代苯甲酰胺化合物的制备方法，是采用以下反应方程式，

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，将化合物1的甲氧基邻位上进行溴化反应得到化合物2；

步骤2，将化合物2的羧基进行酯化反应得到化合物3；

步骤3，将化合物3的溴进行suzuki偶联得到化合物4；

步骤4，将化合物4的噻吩上进行α位溴化得到化合物5；

步骤5，将化合物5进行酯水解反应得到化合物6；

步骤6，将化合物6的羧酸基团上引入如ia、ib、ic中的r之一所示的基团。

优选地，所述步骤1中溴化反应采用溴素，并以铁粉为催化剂，所述化合物1、所述溴素和所述铁粉的摩尔比为1：(1.0～1.2)：(0.05～0.15)。

进一步地，所述步骤1中溴化反应具体包括：将化合物1、铁粉以及二氯甲烷混合均匀后预冷；加入溴素反应；反应结束后采用二氯甲烷稀释反应液，依次采用硫酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，保留有机相；然后采用无水硫酸镁干燥有机相，蒸干后重结晶，既得。

进一步地，所述步骤2中酯化反应具体包括：将化合物2和无水甲醇混合均匀，加入二氯亚砜，于回流状态下反应；反应完成后加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤并萃取，有机相依次干燥、浓缩后精制，既得。

优选地，所述酯化反应精制的方法为柱层析。

优选地，所述步骤3中取代反应采用噻吩硼酸，并以pdcl2为催化剂，所述化合物3、所述噻吩硼酸和所述pdcl2的摩尔比为：1：(1.05～1.2)：(0.05～0.2)。

进一步地，所述步骤3中取代反应具体包括：氩气保护下，将化合物3、噻吩硼酸、碳酸钾、pdcl2、二噁烷和水混合均匀，升温至108～112℃反应；反应结束后过滤，滤液依次洗涤、干燥、浓缩后精制，既得。

优选地，所述取代反应精制的方法为柱层析。

优选地，所述步骤4中间位溴化反应采用nbs，所述nbs和所述化合物4的摩尔比为(0.8～1.0)：1。

进一步地，所述步骤4中间位溴化反应具体包括：将化合物4、dmf、nbs混合均匀，室温下反应；反应结束后加入冰水，过滤，将滤饼干燥，既得。

优选地，所述步骤5中酯水解反应采用氢氧化锂为催化剂，所述氢氧化锂和所述化合物5的摩尔比为(4～4.5)：1。

进一步地，所述步骤5中酯水解反应具体包括：将化合物5、甲醇、水混合均匀后，加入氢氧化锂，于40～45℃反应；反应结果后依次浓缩、加水溶解、调ph至2.0～2.5；将析出的固体过滤并干燥，既得。

进一步地，所述步骤6采用叠氮磷酸二苯酯(dppa)为催化剂，所述dppa和所述化合物6的摩尔比为(1.5～2.0)：1。

进一步地，所述步骤6具体包括：将化合物6、如ia、ib、ic中之一所示基团的仲胺化合物、tea、无水n,n-二甲基甲酰胺混合均匀，预冷后加入dppa反应；反应结束后依次用冰水猝灭、萃取；获得的有机相依次用饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩后精制，既得。

优选地，所述步骤6中精制的方法为柱层析。

第三个方面，本发明提供上述多取代苯甲酰胺化合物或上述制备方法制备的多取代苯甲酰胺化合物在制备抗伪狂犬病毒药物上的应用。

第四个方面，本发明提供了一种抗伪狂犬病毒药物，包括上述的多取代苯甲酰胺化合物或上述制备方法制备的多取代苯甲酰胺化合物和药学上可接受的辅料。

本发明对所述抗伪狂犬病毒药物并无特殊限定，可以为片剂、胶囊剂、粉针剂或混悬剂等本领域技术人员熟知的剂型。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明发现了一种新的、具有良好抗伪狂犬病毒活性的多取代苯甲酰胺化合物，研究表明式ia～b所示的化合物能够抑制伪狂犬病毒活性，并且对大量病毒侵染细胞具有保护作用，因此表明该化合物能够用于制备具有伪狂犬病毒作用的食品和/或药品，在抗伪狂犬病毒药物开发方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例5中在病毒感染量为moi＝1时各药物组对病毒的抑制作用对比图。

具体实施方式

本发明实施例采用的prv购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

本发明实施例采用的pk-15细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种具有抗伪狂犬病毒作用的药物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

本实施例提供一种多取代苯甲酰胺化合物，具有如式ia所示结构：

式ia所示化合物的制备方法为：

详细制备方法如下：

(1)化合物2的合成：

向250毫升圆底烧瓶中加入10克化合物1(2-甲基-4-甲氧基苯甲酸)(60.24mmol)、0.34克铁粉(6.02mmol)以及10毫升二氯甲烷，置于-5℃下，预冷片刻。缓慢滴加3.7毫升溴素(72.29mmol)，滴加完毕后，恢复至室温搅拌过夜。tlc监测反应待原料消失，用100毫升二氯甲烷稀释反应液，并用10％的硫酸氢钠溶液洗涤2次，再用饱和食盐水洗涤1次。无水硫酸镁干燥有机相，减压抽滤，旋干，用乙酸乙酯重结晶得到3.40克化合物2，产率为23％。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ2.56(s,3h),3.91(s,3h),7.08(s,1h),8.00(s,1h),12.70(brs,1h)。

(2)化合物3的合成：

在氩气保护下，向火焰干燥的反应瓶中加入4.1克化合物2(16.73mmol)及50毫升绝对无水甲醇，置于冰浴条件下，缓慢滴加1.45毫升二氯亚砜(20.08mmol)。滴加完毕后回流5h，向反应液中加入20毫升饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，浓缩，柱层析得到3.7克化合物3，产率为86％。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ2.55(s,3h),3.90(s,3h),3.93(s,3h),7.08(s,1h),8.01(s,1h)，ms:m/z257.99[m(br⁷⁹)+h]⁺,259.99[m(br⁸¹)+h]⁺。

(3)化合物4的合成：

在氩气下，向反应瓶中加入1.5克化合物3(5.8mmol)、0.89克噻吩硼酸(6.95mmol)、2.4克碳酸钾(17.4mmol)、0.42克pdcl2(dppf)(0.58mmol)、60毫升二噁烷及15毫升水。升温至110℃反应4h。反应液用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗滤饼3次，得到的滤液用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩后柱层析，得到0.82克化合物4，产率为54％。¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ2.65(s.3h),3.90(s,3h),3.96(s,3h),6.79(s,1h),7.02(d,j＝4.0hz,1h),7.24(ψt,j＝4.0hz,1h),7.60(d,j＝4.0hz,1h),8.25(s,1h).ms:m/z261.04[m+h]⁺。

(4)化合物5的合成：

向反应瓶中加入0.7克化合物4(2.67mmol)、5毫升n,n-二甲基甲酰胺(dmf)及0.43克n-溴代丁二酰亚胺(nbs，2.40mmol)，在室温下反应2h。向反应液中加入冰水，减压过滤，将得到的白色沉淀物干燥，即得到0.8克化合物5，产率为88％。¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ2.65(s.3h),3.89(s,3h),3.97(s,3h),6.79(s,1h),7.02(d,j＝4.0hz,1h),7.24(d,j＝4.0hz,1h),8.22(s,1h).ms:m/z340.98[m(br⁷⁹)+h]⁺,343.00[m(br⁸¹)+h]⁺。

(5)化合物6的合成：

向反应瓶中加入0.6克5化合物(1.76mmol)，加入四氢呋喃、甲醇及水各3毫升，再加入0.3克水合氢氧化锂(7.10mmol)，在40℃下搅拌4h。反应液浓缩，加水溶解，用烯盐酸调ph至2.0，析出的固体过滤，干燥，得到0.478克化合物6，产率为83％。¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ2.56(s,3h),3.91(s,3h),6.90(s,1h),7.18(d,j＝4.4hz,1h),7.33(d,j＝4.4hz,1h),8.04(s,1h).ms:m/z327.09[m(br⁷⁹)+h]⁺,343.00[m(br⁸¹)+h]⁺。

(6)化合物ia的合成：

在氩气下，向反应瓶中加入30毫克化合物6(0.09mmol)、3-叔丁氧羰基氨基哌啶(0.10mmol)、55微升tea(0.38mmol)以及3毫升干燥的n,n-二甲基甲酰胺。反应瓶置于冰浴条件下，预冷片刻后加入33微升叠氮磷酸二苯酯(dppa，0.15mmol)，继续反应至原料完全消失。反应液用冰水淬灭，并用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，干燥，柱层析得到37毫克ia，产率为82％。

ia核磁结构鉴定如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.42(s,9h),1.58-1.65(m,2h),1.68-1.90(m,2h),2.48(s,3h),3.48-3.52(m,2h),3.56-3.72(m,2h),3.79(s,3h),6.92(s,1h),7.16(d,j＝4.4hz,1h),7.30(d,j＝4.4hz,1h),7.62(brs,1h),8.00(s,1h).¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ170.1,158.2,155.6,140.8,137.9,131.1,129.1,129.0,118.9,114.8,111.6,79.5,56.1,53.1,52.2,47.7,33.6,28.4,22.7,18.4.hrms:m/z508.1039[m(br⁷⁹)+h]⁺,510.1020[m(br⁸¹)+h]⁺。

实施例2

本实施例提供一种多取代苯甲酰胺化合物，具有如式ib所示结构：

该多取代苯甲酰胺化合物的制备方法同实施例1。

最终得到43毫克ib，产率为78％，核磁结构鉴定如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ2.00-1.75(m,4h),2.47(s,3h),3.65-3.58(m,6h),3.79(s,3h),4.46(t,j＝5.6hz,1h),4.70(d,j＝5.6hz,2h),7.05(d,j＝4.4hz,1h),7.28(d,j＝4.4hz,1h),7.25(s,1h),7.38-7.25(m,4h),7.55(d,j＝7.6hz,2h),7.67(brs,1h),7.90(d,j＝7.6hz,2h),8.55(s,1h).¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ170.0,158.2,156.0,143.6,140.8,137.9,131.1,129.2,129.1,126.7,125.2,120.5,118.9,114.8,111.6,67.3,56.5,49.2,47.0,42.6,29.6,18.5.hrms:m/z653.1089[m(br⁷⁹)+na]⁺,655.1068[m(br⁸¹)+na]⁺。

实施例3

本实施例提供一种多取代苯甲酰胺化合物，具有如式ic所示结构：

该多取代苯甲酰胺化合物的制备方法同实施例1。

最终得到28毫克ic，产率为81％，核磁结构鉴定如下：¹hnmr(dmso-d6,400mhz)δ2.47(s,3h),3.17-3.45(m,4h),3.60-3.78(m,4h),3.78(s,3h),6.99(s,1h),7.12(d,j＝4.4hz,1h),7.33(d,j＝4.4hz,1h),8.05(s,1h).¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ69.9,158.4,151.2,140.8,137.8,131.9,131.1,129.6,128.5,124.1,122.3,118.9,114.8,114.6,112.2,111.6,56.3,53.6,50.2,18.5.hrms:m/z561.0446[m(br⁷⁹)+na]⁺,563.0421[m(br⁸¹)+na]⁺。

实施例4

苯甲酰胺化合物抗病毒活性的研究

(1)苯甲酰胺化合物对pk-15细胞毒性研究

以含1％乙醇的细胞维持培养液作为溶剂，将实施例1～3的苯甲酰胺化合物和阳性对照(阿昔洛韦)连续二倍稀释，得到5个浓度梯度的稀释液。待pk-15细胞长至80％-90％时，按如下操作加入药物稀释液和cck-8，每组设置8个重复：

实验组：将实施例1～3的药物梯度稀释液按照100μl/孔依次加入96孔板中；

对照组：将细胞维持培养液按照100μl/孔加入96孔板中；

将96孔细胞培养板放置于37℃，5％co2中培养48h。实验组和对照组于避光环境中加入10μl/孔的cck-8。在37℃，5％co2的培养箱中培养30min。于450nm处检测其吸光度值。按照测定的吸光度值计算抑制率：

抑制率＝[(对照孔-试验孔)/对照孔]×100％，[1]

实验重复3次，取平均值。用reed-muench法计算药物cc50值，公式如下：

s＝n-1+(h-r)/(h-l)，[2]

cc50＝c×2^-s，[3]

式[2]和[3]中，n表示高于50％抑制率的药物浓度序列号，h表示高于50％的抑制率，r为50％，l为低于50％的抑制率，c代表序号为1的药物实验组药物浓度。通过计算得出实施例1～3的苯甲酰胺化合物的cc50值分别为11.60μm、10.97μm和25.12μm阿昔洛韦的cc50值为1420.50μm。

(2)苯甲酰胺化合物对prv的半数抑制浓度(ic50)的测定

将苯甲酰胺化合物用细胞培养液进行二倍稀释。将pk-15细胞接种至96孔板中，待其长至80％-90％，按如下操作进行实验：

药物组：将100tcid50的prv接种于96孔板中，于37℃，5％的co2中吸附1h后，弃掉prv稀释液，用pbs清洗3次，分别加入100μl的药物稀释液(包括对照药物阿昔洛韦)，每个浓度设置8个重复；

病毒对照组：将100tcid50的prv接种于96孔板中，不加入任何药物；

空白组：pk-15细胞不进行病毒感染和药物处理。

将96孔细胞培养板放置于37℃，5％co2中培养48h。实验组、对照组和空白组于避光环境中加入10μl/孔的cck-8。在37℃，5％的培养箱中培养30min。于450nm处检测其吸光度值。按照测定的吸光度值计算抑制率＝(药物组-病毒对照组)/(空白组-病毒对照组)。根据抑制率采用reed-muench法计算ic50(计算方法同cc50)。实验重复3次，结果取平均值，实施例1～3的化合物的ic50分别为0.65μm、0.82μm、1.63μm阿昔洛韦的ic50值为148.21μm。

选择指数(si)可以评价山柰酚对prv的抑制效果是否安全，计算公式如下：

si＝cc50/ic50，[4]

实施例1～3的苯甲酰胺化合物的选择指数分别为17.75、13.36和15.34；阿昔洛韦的选择指数为9.58。以上结果见表1，苯甲酰胺化合物相较于阿昔洛韦，具有更强的抑制伪狂犬病毒活性。

表1苯甲酰胺化合物对伪狂犬病毒抑制活性测定

实施例5

苯甲酰胺化合物对大量病毒侵染细胞的保护作用

将pk-15细胞接种于细胞六孔培养板中，加入细胞生长培养液，待细胞长至70-80％，按如下操作处理：

药物组：将实施例1～3的苯甲酰胺化合物(5μm)以及阿昔洛韦(200μm)，与感染复数(moi)＝1的病毒液接种于细胞六孔培养板中，于37℃中吸附1h，然后移除病毒稀释液，用pbs清洗2-3次，于37℃，5％co2中培养48h。

病毒对照组：将moi＝1的病毒液接种于细胞六孔培养板中，于37℃中吸附1h，然后移除病毒稀释液，用pbs清洗2-3次，加入1ml细胞维持培养液，于37℃，5％co2中培养48h。

溶剂对照组：将moi＝1的病毒液接种于细胞六孔培养板中，于37℃中吸附1h，然后移除病毒稀释液，用pbs清洗2-3次，加入1ml含1％无水乙醇的细胞维持培养液，于37℃，5％co2中培养48h。

将上述培养48h后的细胞培养板从培养箱中取出，pbs清洗3次，立即提取dna，将提取的dna样品，利用taqman探针荧光定量方法检测各样品的cq值，并计算病毒拷贝数。结果如图1所示，在大量病毒感染下，苯甲酰胺化合物同样具有良好的抑制prv增殖活性，呈剂量依赖性。在浓度为5μm时，病毒基因组拷贝数降低了超过50倍。

综上，本发明发现了一种新的、具有良好抗伪狂犬病毒活性的多取代苯甲酰胺化合物，研究表明式ia～c所示的化合物能够抑制伪狂犬病毒活性，并且对大量病毒侵染细胞具有保护作用，因此表明该化合物能够用于制备具有伪狂犬病毒作用的食品和/或药品，在抗伪狂犬病毒药物开发方面具有良好的应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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