一种含1,3,4-噻二唑吡啶-2-酮衍生物的制备方法和作为抗癌药物的应用与流程

本发明涉及药物领域，具体的说，涉及一种5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物及其制备方法和作为抗癌药物的应用。

背景技术：

癌症已经成为对人类健康和生命威胁最大的一类非传染性疾病，目前治疗癌症的主要方法是放疗疗法和化学疗法。因此抗癌药物的研究与开发一直是化学家和药物学家关注的热点。寻找高效、高选择性和低毒副作用的抗癌药物是药物研究开发的生要方向之一。

吡啶酮衍生物是广泛存在于自然界的重要杂环化合物,因其具有独特的化学和生理药理活性而引起人们的浓厚兴趣.越来越多的研究表明吡啶酮类化合物具有消炎、止痛、退热、抑菌、杀菌、抗高血糖、抗癌、抗凝血剂等药理活性。如u.velaparthi报道的bms-695735(一种含苯并咪唑的吡啶-2-酮化合物)具有很好的抗肿瘤活性(j.med.chem.2008,51,5897–5900),d.a.wacker等报道的bms-903452(一种含哌啶的吡啶-2-酮化合物)具有很好的抗糖尿病活性(j.med.chem.2014,57,7499−7508)。鉴于吡啶酮化合物在有机合成以及药物合成中的重要性,对这类化合物的合成及活性研究已引起了人们的极大兴趣。

1,3,4-噻二唑是一类含氮、硫杂原子的五元芳杂环,1,3,4-噻二唑类化合物的良好生物活性已在医药、农药方面得到广泛应用,如抗艾滋病、糖尿病、杀菌和抗肿瘤活性等。如k.zhang等报道的含希夫碱的1,3,4-噻二唑化合物具有很好的抗肿瘤活性(bioorg.med.chem.lett.2014,24,5154–5156)，2007年m.k.abdel-hamid等报道含1,3,4-噻二唑的吲哚-2-酮化合物,其对碳酸酐酶具有很好的抑制作用，其ic50为2.0μmol/l(bioorg.med.chem.,2007,15,6975–6984)。因此,设计合成新的含1,3,4-噻二唑骨架的吡啶酮衍生物用于抗肿瘤药物具有重要的理论和现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物。

本发明的目的也在于提供一种5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物的制备方法。

本发明的目的也在于提供上述5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

一种5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物，其化学结构式如式i所示：

式（i）中，取代基r是h、c1-6的烷基、f、cl、br、i、烷氧基、羟基、腈基、硝基、羧基或磺酸基。

一种5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物的制备方法，反应通式为：

具体步骤如下：

(1)将2,3-二羟基吡啶溶于无水甲醇中，加入磷酸盐缓冲溶液、碘酸钠以及芳香胺于容器中，室温下搅拌，tlc跟踪反应进程，待反应结束后加入大量的蒸馏水，静置后，过滤得砖红色沉淀；将沉淀干燥，经柱层析得中间产物5,6-二取代苯胺基吡啶-2,3-二酮1；

(2)取中间产物5,6-二取代苯胺基吡啶-2,3-二酮1、硫代卡巴肼分别依次溶于无水乙醇中，室温下搅拌均匀，逐滴滴加浓盐酸，于60℃条件下反应，tlc跟踪反应进程，待反应完全后，冷却至室温，加入200ml蒸馏水放置冰箱过夜，柱层析分离纯化得中间体2；

(3)将中间产物2和原甲酸三乙酯加入圆底烧瓶中，于110-120℃下加热回流反应，tlc跟踪反应进程，待反应完全，将反应液冷却至室温，柱层析分离纯化得到目标化合物5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物。

优选的是，步骤(1)中所述的氧化剂为碘酸钠，反应温度为室温。

优选的是，步骤(2)中所述的酸催化剂为盐酸，回流温度为60℃。

所述的5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述抗肿瘤药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂。

本发明的有益效果：通过实验证明，本发明的5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物对肿瘤细胞具有良好抑制活性。可用于制备抑制肿瘤细胞的药物。并且合成方法简单、材料易得、收率高，为解决抗肿瘤药物提供了一种新的开发途径。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，现给出制备5,6-二取代苯氨基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物的实施例，本发明包括但不限于此制备方法。

实施例1：5,6-二邻氯苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3a)的合成。

将10mmol2,3-二羟基吡啶溶于20ml的无水甲醇中，加入30ml的磷酸盐缓冲溶液，15mmol氧化剂碘酸钠以及20mmol邻氯苯胺于150ml的锥形瓶中，室温下搅拌，tlc跟踪反应进程，待反应结束后加入大量的蒸馏水，静置过夜后，过滤得砖红色沉淀。将沉淀干燥，经柱层析得中间产物1。

取1mmol的中间产物1和1mmol硫代卡巴肼溶于40ml的无水乙醇中，室温下搅拌均匀，逐滴滴加浓盐酸0.75ml，，然后将反应移入油浴锅中，反应温度为60℃，tlc跟踪反应进程，待反应完全后，冷却至室温，向滤液中加入200ml蒸馏水放置冰箱过夜，过滤，柱层析纯化得中间体2。

将0.6mmol中间体2溶于4ml原甲酸三乙酯中，移入油浴锅，设置反应温度为115℃。tlc跟踪反应进程，反应结束后，冷却至室温，过滤，柱层析得到红棕色固体5,6-二邻氯苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮。其化学结构式如式（3a）所示，产率：68%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ13.65(s,1h),8.65(s,1h),8.04(s,1h),7.78(s,1h),7.54–7.46(m,3h),7.38–7.30(m,2h),7.18–7.15(m,1h),7.07–7.05(m,1h),6.70–6.98(m,1h)6.66(s,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ169.25,158.83,145.77,142.30,136.43,131.87,130.82,130.52,130.37,128.25,127.70,126.42,126.24,125.84,124.24,121.96,121.30,104.53;esimsm/z:458(m+h)⁺。

实施例2：5,6-二间氯苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3b)的合成。

本实施例的制备方法除用间氯苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二间氯苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3b）所示，产率：60%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ13.66(s,1h),8.67(s,1h),8.08(s,1h),7.40–7.32(m,4h),7.22–7.20(m,1h),7.15–7.14(m,1h),7.11–7.09(m,1h),6.96(s,1h),6.83-6.81(m,1h),6.68(s,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ158.70,146.33,145.79,142.13,140.65,136.01,135.32,131.91,131.35,130.68,130.26,125.65,123.87,121.04(d,j=2.5hz),119.14,118.78,104.59,99.98；esimsm/z:458(m+h)⁺。

实施例3：5,6-二对甲基苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3c)的合成。

本实施例的制备方法除用对甲苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二对甲基苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3c）所示，产率：62%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.58(s,1h),8.62(s,1h),8.11(s,1h),7.30(s,1h),7.25–7.21(m,4h),7.16(d,j=8.5hz,2h),6.84(d,j=7.5hz,2h),6.54(s,1h),2.37(d,j=2.0hz,6h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.47,159.04,145.35,142.54,141.68,136.68,135.19,133.88,133.59,131.20,130.83,130.18,122.04,120.49,102.19,20.92；esimsm/z:418(m+h)⁺。

实施例4：5,6-二邻溴苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3d)的合成。

本实施例的制备方法除用邻溴苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3d）所示，产率：58%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.66(s,1h),8.65(s,1h),7.97(s,1h),7.76(s,1h),7.70–7.65(m,2h),7.52(d,j=8.0hz,1h),7.43–7.37(m,2h),7.10(t,j=8.0hz,1h),7.03–6.96(m,2h),6.65(s,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.22,158.79,145.71,143.75,142.09,137.64,133.99,133.63,132.06,130.52,128.94,128.36,126.69,124.82,121.81,121.54,115.99,115.89,104.31；esimsm/z:545(m+h)⁺。

实施例5：5,6-二邻氟苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3e)的合成。

本实施例的制备方法除用邻氟苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二邻氟苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3e）所示，产率：58%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.65(s,1h),8.65(s,1h),8.00(s,1h),7.47(t,j=8.0hz,1h),7.42(s,1h),7.24–7.17(m,5h),7.14–7.10(m,1h),7.05–7.02(m,1h),6.56(s,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.28,158.80,155.95,153.97,152.00,145.72,142.71,132.47(d,j=12.5hz),132.30,130.55,127.61(d,j=11.3hz),126.78(d,j=6.3hz),125.45(d,j=2.5hz),124.72(d,j=7.5hz),123.45,122.35,117.04(d,j=18.8hz),115.34(d,j=20.0hz),104.30；esimsm/z:426(m+h)⁺。

实施例6：5,6-二苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3f)的合成。

本实施例的制备方法除用苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3f）所示，产率：55%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.61(s,1h),8.63(s,1h),8.05(s,1h),7.47–7.40(m,6h),7.28(s,1h),7.23(t,j=7.5hz,1h),7.14(t,j=7.5hz,1h),6.94(d,j=8.0hz,2h),6.65(s,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.40,158.99,145.49,145.19,141.72,139.40,132.92,130.95,130.29,129.67,125.50,123.92,121.48,120.63,103.03；esimsm/z:390(m+h)⁺。

实施例7：5,6-二间氟苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3g)的合成。

本实施例的制备方法除用间氟苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二间氟苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3g）所示，产率：67%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.65(s,1h),8.66(s,1h),8.07(s,1h),7.43–7.35(m,3h),7.03–6.99(m,2h),6.96–6.92(m,1h),6.85–6.81(m,1h),6.73–6.71(m,2h),6.70–6.68(m,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.24,164.67(d,j=43.8hz),162.70(d,j=41.3hz),158.75,146.78(d,j=8.8hz),145.80,142.10,141.08(d,j=10.0hz),131.83,131.70(d,j=8.8hz),130.92(d,j=10.0hz),130.32,115.52(d,j=2.2hz),115.20(d,j=38.8hz),112.46(d,j=21.3hz),110.46(d,j=21.3hz),108.50(d,j=22.5hz),107.87(d,j=23.8hz),104.68；esimsm/z:426(m+h)⁺。

实施例8：5,6-二间甲氧基苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮(3h)的合成。

本实施例的制备方法除用间甲氧基苯胺代替邻氯苯胺外，其余同实施例1，最后得棕红色固体5,6-二间甲氧基苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮，其化学结构式如式（3h）所示，产率：71%。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:13.64(s,1h),8.63(s,1h),7.95(s,1h),7.82(s,1h),7.46–7.45(m,1h),7.21–7.17(m,1h),7.05–7.02(m,4h),6.97–6.94(m,2h),6.69(s,1h),3.89(s,3h),3.85(s,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ:169.49,158.98,150.53,149.52,145.37,141.99,133.70,132.57,131.41,129.10,126.43,123.33,122.88,121.76,120.82,119.41,112.33,111.02,103.02,55.83,55.74；esimsm/z:450(m+h)⁺。

下面通过活性实验实例对本发明作进一步详细的描述。

采用mtt法，对所合成的目标产物5,6-二取代苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮进行了抗癌活性的实验。以人的mgc803（胃癌细胞）、hepg2（肝癌细胞）mcf10a(人正常乳腺上皮细胞)为供试材料。收集对数期细胞，用胰酶消化细胞，调整细胞悬液浓度至2×10⁴个/ml，分注到96孔板中，每孔加入200μl；于5%co2，37℃孵育半天，至细胞单层铺满孔底,加入不同浓度的样品，每孔100μl，设3个平行孔；再于5%co2，37℃孵育四天，倒置显微镜下观察；每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），继续培养4h，若药物与mtt能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用pbs冲2-3遍后，再加入含mtt的培养液，终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入180μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪于波长550nm处测量各孔的吸光值。参照对照（不含样品，样品用溶解它的溶剂代替，其它条件完全一样），计算抑制率ic50，测试结果见表1。

表15,6-二取代苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物

的抗肿瘤活性

从表1可以看出，5,6-二取代苯胺基-3-(2-(1,3,4-噻二唑-2-基)亚联氨基)吡啶-2-酮衍生物具有抑制肿瘤活性，其中化合物3a、3b、3e和3g对mgc803细胞具有很好的抑制效果，而且它们的ic50值均小于阳性对照物5-fu(5-氟尿嘧啶)，化合物3a、3e、3f和3g对hepg2细胞具有很好的抑制效果，而且它们的ic50值均小于阳性对照物5-fu(5-氟尿嘧啶)。同时我们也选取了对mgc-803和hepg2均具有很好抑制作用的化合物3a,3e和3g进行了正常细胞试验，从表1可以看出它们对正常细胞的作用较弱，均表现出较好的选择性。

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