一种抑制棕囊藻生长的方法与流程

本案是以申请日为2017年06月09日，申请号为201710429851.1，名称为食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用的发明专利为母案而进行的分案申请。

本发明属于生物领域，具体涉及一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用。

背景技术：

凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖专一性、非共价可逆结合的特点，部分凝集素还具有免疫调节和抑制肿瘤生长的作用，同时还参与生物体内的一些重要生理过程；在研究生物体内细胞癌变、受精、分化和分子识别等重要生命过程中起着重要作用，所以日益成为国内外生物研究的热点之一。凝集素按不同的分类方法可以分很多类型，主要依据其结合的糖的类型或其来源的物种进行区分。按照凝集素结合糖的类型，把自然界中的凝集素分成若干类型，就叫该糖凝集素，如：d一甘露糖凝集素、l一岩藻糖凝集素(荆豆凝集素)。按照物种的来源分类，凝集素可以分为动物凝集素(哺乳动物凝集素、无脊椎动物凝集素、昆虫凝集素等)、植物凝集素、微生物凝集素。而本发明所涉及的凝集素为食用菌凝集素，也就是植物凝集素。

食用菌又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界上最普遍研究最广的一种菇类，喜生长在粪草酵料上的一种伞菌，食用菌所含的酪氨酶有明显降低血压作用；多糖的醌类化合物与巯基结合，可抑制脱氧核糖核酸合成，在医学上，有抑制肿瘤细胞活性的作用。而双孢蘑菇2796、真姬菇以及长裙竹荪是我国20世纪90年代初选育出的一种质量好高产量的食用菌种类，得到了较大的推广与研究。

hori等(1996)首次报道了几种陆生植物和海藻凝集素对某些海洋微藻的凝集作用；郑怡等(2002)发现坛紫菜凝集素(phl)能够凝集一定浓度范围内的单细胞藻类；陈国强(2008)以褐藻门的铁钉菜(ishigeokamurae)的凝集素为试验材料，研究发现铁钉菜凝集素能抑制多纹膝沟藻和棕囊藻的生长。然而目前有关凝集素对海洋微藻影响的研究，主要集中在海洋大型藻类的凝集素提取、微观层面的细胞凝集反应等方面的研究，未见凝集素对微藻选择性抑制作用的研究。

技术实现要素：

本发明提供一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用，明确了双孢蘑菇部分重要生化特性的影响，为开发环保的选择性抑藻剂技术提供新思路和新方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用，所述食用菌凝集素为双孢蘑菇2796凝集素，其提取步骤为：取食用菌子实体，按质量体积比为1:5加入0.9％w/v生理盐水，在4℃下浸泡18h；然后用高速组织捣碎机将其均浆后再次放在4℃下浸泡4h，4层纱布过滤，弃滤渣，取滤液；在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液；加入22.6％w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为40％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清；再次在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液，加入12％w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为60％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出沉淀；将沉淀溶于1mol/l的nacl中，装入透析袋中除盐，用相同的盐浓度透析至外透析液无so4^2-检出为止；所得透析液聚乙二醇浓缩后上deae-sepharosefastflow柱，以0.05mol/l，ph7.8的磷酸缓冲液pbs对含1molnacl的同一缓冲液梯度洗脱，检测波长280nm，分管收集，以鸽子血检测各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱层析纯化，流速4ml/管，10min/管，洗脱液为0.05mol/l、ph8.0的pbs缓冲液，检测波长280nm，分管收集后检测各峰的凝血活性，收集活性峰，冷冻干燥即得所述食用菌凝集素纯品。

本发明的另一目的在于提供一种上述食用菌凝集素抑制棕囊藻生长的方法，其使用方法为：将所提取的食用菌凝集素直接加入棕囊藻生长水域中，抑制其生长。

食用菌2796凝集素的分离纯化取食用菌子实体，按质量体积比为1:5加入0.9％w/v生理盐水，在4℃下浸泡18h；然后用高速组织捣碎机将其均浆后再次放在4℃下浸泡4h，4层纱布过滤，弃滤渣，取滤液；在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液；加入22.6％w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为40％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清液再次在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液，加入12％w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为60％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出沉淀；将沉淀溶于1mol/l的nacl中，装入透析袋中除盐，用相同的盐浓度透析至外透析液无so4^2-检出为止；所得透析液聚乙二醇浓缩后上deae-sepharosefastflow柱(1.6cm×30cm)，以磷酸缓冲液pbs(0.05mol/l,ph7.8)对含1molnacl的同一缓冲液梯度洗脱，检测波长280nm，分管收集，以鸽子血检测各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱(2.6cm×60cm)层析纯化，流速4ml/管，10min/管，洗脱液pbs(0.05mol/l，ph8.0)，检测波长280nm，分管收集后检测各峰的凝血活性，收集活性峰，冷冻干燥即得食用菌2796凝集素纯品。

本发明的优点在于：将双孢蘑菇凝集素应用于棕囊藻的特应性抑制，明确了双孢蘑菇部分重要生化特性的影响，为开发环保的选择性抑藻剂技术提供新思路和新方法。

附图说明

图1双孢蘑菇凝集素对棕囊藻室内模拟抑制试验，图1a为双孢蘑菇凝集素对高浓度棕囊藻的杀灭效果，图1b为双孢蘑菇凝集素对低浓度棕囊藻的杀灭效果。

具体实施方式

实施例1

食用菌2796凝集素的制备取食用菌子实体，按质量体积比为1:5加入0.9％w/v生理盐水，在4℃下浸泡18h；然后用高速组织捣碎机将其均浆后再次放在4℃下浸泡4h，4层纱布过滤，弃滤渣，取滤液；在4℃，9000r/min下冷冻离心20min，取出上清液；加入22.6％w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为40％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清；再次在4℃，9000r/min下冷冻离心20min，取出上清液，加入12％w/v硫酸铵盐析，并用791磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为60％的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷冻离心20min，取出沉淀；将沉淀溶于1mol/l的nacl中，装入透析袋中除盐，用相同的盐浓度透析至外透析液无so4^2-检出为止；所得透析液聚乙二醇浓缩后上deae-sepharosefastflow柱(1.6cm×30cm)，以磷酸缓冲液pbs(0.05mol/l,ph7.8)对含1molnacl的同一缓冲液梯度洗脱，检测波长280nm，分管收集，以鸽子血检测各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上sephadexg-100柱(2.6cm×60cm)层析纯化，流速4ml/管，10min/管，洗脱液pbs(0.05mol/l，ph8.0)，检测波长280nm，分管收集后检测各峰的凝血活性，收集活性峰，冷冻干燥即得食用菌2796凝集素纯品。

实施例2

凝集素对微藻细胞增殖的影响

1、棕囊藻的培养：棕囊藻在lrh-250-g光照培养箱中培养，温度为25±1℃，光照强度e3000±50lx，光暗周期12h，实验中藻类培养所用培养基为f/2培养基。

2、凝集素对棕囊藻细胞增殖的影响(藻细胞计数)：棕囊藻在正常的生长环境下，通过abl为双孢蘑菇凝集素；hml为真姬菇凝集素；dil为长裙竹荪凝集素和对照处理，三种凝集素对棕囊藻的藻细胞增殖影响研究结果表明(表1)，双孢蘑菇凝集素对棕囊藻细胞增殖具有显著抑制作用。

表1凝集素对微藻细胞增殖的影响

abl为双孢蘑菇凝集素；hml为真姬菇凝集素；dil为长裙竹荪凝集素；下同实施例3凝集素对棕囊藻细胞的凝集实验试验步骤：

(1)海洋棕囊藻在lrh-250-g光照培养箱中培养，温度为25±1℃，光照强度e3000±50lx，光暗周期12h，实验中藻类培养所用培养基为f/2培养基。

(2)各种微藻培养至指数生长期时，离心收集微藻细胞，加灭菌后的海水，3000r/min下离心5min，洗涤2次，最后加入4倍体积的灭菌海水配成藻细胞悬液。

(3)在96孔v型血凝板上用40μl凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释后，加入40μl的藻细胞悬液，以等量消毒海水作为空白对照，振荡均匀，室温下静置2h，显微观察。

实验结果如表2所示，凝集素对微藻细胞的凝集实验的结果表明，双孢蘑菇凝集素(abl)以及长裙竹荪凝集素(dil)在一定浓度下对棕囊藻细胞具有凝集作用。

表2食用菌凝集素对微藻的凝集作用

abl为双孢蘑菇凝集素；hml为真姬菇凝集素；dil为长裙竹荪凝集素；下同“+”凝集；“-”不凝集；下同实施例4凝集素对微藻细胞运动能力的影响试验步骤：在96孔“v”型血凝板上用40μl凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释后，加入40μl经离心洗涤过的藻细胞悬液，以等量消毒海水作为空白对照，振荡均匀，室温下静置1h，显微观察其运动情况。

实验结果如表3所示，实验表明双孢蘑菇凝集素能强烈地抑制棕囊藻鞭毛的摆动使其失去运动能力，且这种鞭毛抑制作用表现出很强的特异性，对其他几种供试的有鞭毛的微藻中仅对塔胞藻的鞭毛有微弱的抑制作用。

表3凝集素对微藻细胞运动能力的影响

实施例5双孢蘑菇凝集素对棕囊藻室内模拟抑制试验模拟赤潮发生时的藻类密度高的环境情况，跟踪观察双孢蘑菇凝集素对高密度棕囊藻的杀灭效果(图1a，图1b)。结果显示在t<3d时双孢蘑菇凝集素处理的右缸和对照组左缸的叶绿素浓度变化基本一致，当t>5d后，左缸与右缸的叶绿素浓度变化趋势开始出现差异。对照组，在不断补充营养盐的条件下，虽然其叶绿素浓度出现了弱的下降趋势，但总体仍维持在1.1mg/l以上的高水平，藻液藻密度高且分布均匀。相比之下，双孢蘑菇凝集素处理的右缸在t>2d后逐渐观察到棕囊藻藻体沉淀的现象，但在t＝3d时，搅匀取样测得的叶绿素浓度数值与对照组差异不大，这可能与藻细胞沉淀但并未解体有关。但随着时间的增加，沉底的藻细胞开始解体，藻液的叶绿素浓度开始急剧下降，呈现出先急后缓的趋势，这可能与凝集素的降解有关。

本发明过程中还发现，1mmol/liptg可以诱导双孢蘑菇凝集素基因在大肠杆菌中表达，为今后稳定、大量获得双孢蘑菇凝集素奠定基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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