虹鳟atg12基因及虹鳟ATG12蛋白的制作方法

2021-02-02 21:02:13|

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本发明涉及一种虹鳟基因及虹鳟的蛋白。

背景技术：

虹鳟(onchorynchusmykiss)作为在全球范围内较早开始人工养殖的经济鱼类，在我国的养殖始于上世纪50年代末期。目前我国虹鳟的养殖技术和规模十分成熟，已经成功在全国各地20多个地区进行推广。虹鳟作为典型的肉食性冷水鱼类，具有生长速度快、肉多质好、风味鲜美、易养易捕捞、饲料利用率高等特点。作为联合国粮农组织向全球推广的3种质优而高产的淡水养殖鱼类之一，其在国际上也被视为名贵的品种。自噬是真核细胞中普遍存在的现象，它对细胞内环境稳态的维持及细胞的生长、分化都具有特殊的作用。溶酶体依赖性降解途径作为真核细胞中普遍存在的一种方式，其中细胞的自噬是机体自我修复、保持细胞活性、更新、交换和内环境稳态的一种重要机制。此外，自噬在病原体感染过程中也起着特殊的作用

在细胞正常的状态下，自噬维持在基础水平，然而受到细胞外界的环境信号刺激(如营养物质缺乏、激素和微生物病原体等)，细胞自噬会被诱导至较高的水平。目前，已经有30多种自噬相关基因(autophagy-relatedgenes,atg)被鉴定出来。其中，atg12对于自噬小体膜的延长以及与其它自噬蛋白的正确定位起到重要的作用。但目前商业化的抗体无法特异性识别虹鳟atg12蛋白。

技术实现要素：

本发明提供了虹鳟atg12基因序列及虹鳟atg12蛋白，以及虹鳟atg12蛋白多克隆抗体的制备方法。

本发明中虹鳟atg12蛋白经原核表达获得，为虹鳟自噬蛋白相关机制研究奠定物质基础。由于冷水性鱼类有效商业抗体的缺乏，使其生长与发育机制的研究被限制在转录及转录后水平；并且目前冷水性鱼类蛋白水平的机制研究处于空白阶段。本发明获得的虹鳟自噬蛋白(atg12蛋白)的多克隆抗体能高效并特异性地检测虹鳟自噬蛋白的表达，为冷水性鱼鱼类蛋白水平的机制研究奠定了物质基础。

本发明虹鳟atg12基因的核苷酸序列如seqidno：1中核苷酸序列所示。

本发明虹鳟atg12蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明虹鳟atg12基因原核表达载体的构建方法：

分别在虹鳟atg12基因克隆上、下游引物5’端加入酶切位点和保护碱基；利用带酶切位点的引物进行pcr扩增，pcr产物连接pmd-18t载体并进行测序，测序正确后对质粒进行双酶切；酶切产物经胶回收后连接用ecorⅰ和xhoⅰ酶切的pet-32a载体中，构建pet32a-rtatg12表达载体；

其中虹鳟atg12基因克隆上游引物序列为gacacactcatgataaggactgctg；下游引物序列为acattggtttaggcaaggaagg；

酶切位点为ecorⅰ和xhoⅰ位点。

本发明虹鳟atg12蛋白多克隆抗体的制备方法：

一、虹鳟自噬蛋白的诱导表达与纯化

二、免疫动物；

三、elisa检测抗血清效价；

四、抗血清特异性的鉴定。

本发明虹鳟atg12多克隆抗体，经过了westernblot和免疫组化实验验证，可高效并特异性的识别虹鳟组织中的atg12蛋白，westernblot特异性条带如图1所示。本发明为冷水性鱼类细胞自噬的研究提供了物质基础，此制备方法可满足获取冷水性鱼类多克隆抗体的需求。

与二倍体虹鳟相比，三倍体虹鳟性腺组织中通过透射电镜可观察到明显的自噬体结构，证明三倍体虹鳟性腺组织中细胞发生自噬。然而，透射电镜观察到自噬体结构的存在只能证明细胞自噬的发生，而无法表明细胞自噬的强度。本发明制备的虹鳟atg12多克隆抗体则可用于检测自噬蛋白的表达水平，判定虹鳟组织或细胞中自噬水平的高低。利用本发明的虹鳟atg12多克隆抗体可在虹鳟中完成atg12蛋白的表达与定位。

附图说明

图1是虹鳟组织中atg12蛋白的westernblot特异性条带。

图2是实施例18中western-blot不同发育时期性腺中atg12的表达测试结果图以及相对灰度值分析，*表示显著性差异vs160dpf,p<0.05。

图3是实施例19中利用虹鳟atg12多克隆抗体进行免疫组化染色分析实验结果图，其中a为180dpf二倍体、b为240dpf二倍体、c为300dpf二倍体、d为210dpf三倍体(阴性对照)、e为180dpf三倍体、f为210dpf三倍体、g为240dpf三倍体、h为270dpf三倍体、f为300dpf三倍体。

图4是实施例14中sds-page凝胶电泳蛋白胶充分脱色后的蛋白条带观察图。

具体实施方式

实施例1

虹鳟自噬基因atg12的cds区克隆：

一、引物设计：引物序列为f：gacacactcatgataaggactgctg，

r：acattggtttaggcaaggaagg；

二、虹鳟组织总rna的提取：利用trizol提取虹鳟肝脏组织中的总rna；

三、rna反转为cdna：操作步骤参照反转abi试剂盒k1622revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit；

四、rt-pcr扩增反应；

五、pcr反应产物胶回收，获得纯化的虹鳟自噬基因atg12。

经测序本实施例虹鳟atg12基因的核苷酸序列如seqidno：1中核苷酸序列所示。

实施例2

实施例1步骤二中rna提取方法如下：

(1)匀浆处理：将肝脏组织在液氮中磨碎，每100mg加入1mltrizol并反复震荡，样品体积不超过trizol体积的10％；

(2)将匀浆样品在室温放置10min，目的使核酸与蛋白复合物完全分离；

(3)4℃、10000g条件下离心10min，取上清液体加入新的ep管中；

(4)向上清液体中加入200μl氯仿，剧烈震荡30s，冰上放置5min；

(5)4℃、10000g条件下离心15min，之后将上清水相液体转移到新的ep管中；

(6)向上清水相液体中加入500μl异丙醇，冰上放置10min；

(7)4℃、10000g条件下离心10min，离心后的ep管底会出现白色沉淀；

(8)加入1ml75％乙醇，洗涤沉淀，4℃、7000g离心10min，弃上清，注意保留沉淀(rna)；

(9)室温放置干燥rna沉淀，约10min之后加入30μlrnase-free水，将rna沉淀溶解；

(10)计算rna分子完整性(rnaintegritynumber,rin)，只有rin值在8到10之间的样品可用于后续实验，保存于-80℃。

实施例3

实施例1步骤三中反转体系和pcr反转录程序

反转体系为：

pcr反转录程序为：

25℃10min

37℃120min

85℃5min

反转之后的cdna，分装好保存于-20℃中，尽量避免反复冻融。

实施例4

实施例1步骤四中rt-pcr扩增反应体系和反应程序

rt-pcr扩增虹鳟atg12基因的反应体系为：

rt-pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min。

反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，110v、40min。凝胶成像系统，拍照后，对目的条带(467bp)进行切胶。

实施例5

实施例1步骤五中pcr反应产物胶回收操作步骤如下：

(1)切取琼脂糖凝胶中的目的dna条带，放入干净的离心管中称重(0.1g＝100μl)；

(2)加入3倍体积溶液gsb，于55℃水浴中溶胶约10分钟，2分钟间断混合，当胶块完全融化后，观察溶液的颜色，若颜色为紫色，加入3m醋酸钠，调整颜色为gsb相同的黄色；

(3)待融化的凝胶溶液降至室温，加入离心柱中静置1分钟，1000g离心1分钟，弃出废液；

(4)加入650μlwb溶液，1000g离心1min，弃出废液；

(5)1000g空离2min，弃出残留的废液；

(6)将离心管柱置于一干净的离心管中，开盖静置1min，在柱的中央加入30μl提前55℃水浴预热的去离子水，室温静置1min；

(7)1000g离心1min，洗脱纯化的dna，用于后续实验。

实施例6

虹鳟atg12基因原核表达载体的构建

根据实施例1获得的虹鳟atg12基因，分别在克隆引物序列(引物序列为f：gacacactcatgataaggactgctg，r：acattggtttaggcaaggaagg；)5’端加入酶切位点(ecorⅰ和xhoⅰ)和保护碱基；利用带酶切位点的引物进行pcr扩增，pcr产物连接pmd-18t载体并进行测序，测序正确后对质粒进行双酶切；酶切产物经胶回收后连接用ecorⅰ和xhoⅰ酶切的pet-32a载体中，构建pet32a-rtatg12表达载体(重组质粒)。之后对重组质粒小提，并对重组质粒进行限制性内切酶鉴定。

实施例7

虹鳟atg12自噬蛋白的诱导表达与纯化

(1)将实施例6鉴定酶切片段为虹鳟atg12基因的pet32a-rtatg12表达载体(重组质粒)转化到bl21(de3)感受态细胞中，37℃条件下，12h之后，进行质粒小提，酶切鉴定正确的菌液进行后续实验；

(2)将酶切鉴定的菌液1:100接种到lb培养基中，每1ml培养基加入1μlampicillin，37℃振荡2.5h之后，用分光光度计对菌液进行od值测定，当od值达到0.5时，取出3ml菌液作为对照；

(3)每1ml菌液加入20μl1mmol/liptg进行诱导，每隔一小时取菌液3ml，其余菌液继续进行诱导，直到诱导后6小时；

(4)每组菌液，12000g离心2min，弃上层，加入总体积5％的pbs溶液悬浮底层菌种，12000g继续离心2min，弃上清，加入200μlpbs；按照1:1加入蛋白上样缓冲液，吹打均匀，煮沸15min之后，进行sds-page电泳；

(5)重组蛋白的纯化。

实施例8

免疫动物以及多克隆抗体制备

一、免疫动物；

二、elisa检测抗血清效价；

三、抗血清特异性的鉴定。

对原核表达蛋白进行sds-page凝胶电泳，利用抗血清作为一抗进行westernblot进行免疫印迹分析，验证蛋白条带的特异性。

实施例9

实施例6中pcr产物与pmd-18t载体连接体系为：

连接条件为：16℃，30min。

实施例10

实施例6中酶切体系为：

37℃，酶切12h。

实施例11

实施例6中将经过双酶切的质粒与经过双酶切的重组载体pet-32a进行连接，连接体系为：

连接条件为：16℃，12h。

实施例12

实施例6中质粒小提步骤如下：

(1)取过夜培养的菌液，10000g离心1min，去上清，如菌液量过大，可分多次离心收集；

(2)加入250μl无色溶液rb(已加rnasea)，震荡悬浮菌体，直至菌块全部消融；

(3)加入250μl蓝色溶液lb，温和地上下翻转6-8次，直至菌体充分裂解，混合液体颜色变为透亮蓝色时，表示菌体完全裂解；

(4)加入250μl黄色溶液nb，轻轻混合5-6次，直到黄色凝集块的形成，在室温下静置2min；

(5)12000g离心10min，小心吸取上清加入离心柱中，12000g离心1min，弃出废液；

(6)加入250μl溶液tb，室温静置10分钟后，12000g离心1min，弃出废液；

(7)加入650μl溶液wb，12000g离心1min，弃出废液；

(8)12000g空离2min，去除残留液体；

(9)将离心柱置于新的离心管中，在柱的中央加入50μl提前预热的去离子水，室温静置1min；

(10)10000g离心1min，洗脱质粒dna，用于后续实验。

实施例13

实施例6中重组质粒的限制性内切酶鉴定，酶切鉴定体系如下：

37℃酶切2h之后，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。

实施例14

实施例7中sds-page凝胶电泳按以下步骤操作：

(1)将制胶玻璃板洗净后放入65℃烘箱中，烘干；

(2)安装制胶板，将玻璃板对齐后垂直夹入制胶板上，下面垫有橡胶垫，防止漏胶，选择合适的蛋白胶厚度进行制作；

(3)首先配制下层分离胶(12％)，沿玻璃板慢慢注射入制胶槽，避免有气泡的产生；到刻度位置停止，之后加入去离子水进行封层，封层可防止下层胶变形；当去离子水与下层胶中间出现明显界限时，表明下层胶已凝固，可将上层去离子水倒掉；

(4)配制上层浓缩胶(5％)，将上层胶缓缓注入制胶槽，直到与制胶玻璃板上层边缘平齐，插入制胶梳，室温下大约20min之后，待上层胶凝固后可将制胶梳取下；

(5)将制胶架与蛋白胶一起放入垂直电泳槽中，每个胶孔最多加入20μl蛋白样品，同时加入蛋白marker，连接电泳仪，开始进行电泳；

(6)上层胶定压80v，下层胶定压120v，大约1.5小时后，观察marker跑开之后，停止电泳；

(7)根据marker条带位置，将目的蛋白大小的下层胶部分切下，放置与平皿中进行考马斯亮蓝染色，大约30min之后，倒掉染色液，加入脱色液进行脱色；

(8)蛋白胶充分脱色后，放入蛋白胶成像系统中，观察蛋白条带，如图4所示。

实施例15

实施例7中重组蛋白的纯化：

(1)将包含重组质粒的菌液与lb培养基1:100比例进行培养50ml菌液，37℃，2.5h之后，加入iptg进行诱导，诱导5h小时之后，8000r/min离心5min，收集菌体；

(2)菌体中加入7.5mlpbs缓冲液，置于冰上在细胞超声波破碎仪中，2s破碎，2s暂停，共作用30min；

(3)大肠杆菌细胞破碎后，在4℃条件下，8000r/min离心20min，将上清和沉淀，分别加入蛋白上样缓冲液，煮沸15min；然后进行sds-page凝胶电泳；

(4)将预测目的条带部分的下层胶切下，用18.625g/l预冷的kcl溶液进行染色，将出现白色条带的蛋白胶切下，碾碎放入新的离心管中，并加入适量的pbs(1x)缓冲液；

(5)经反复冻融三次以后，进行sds-page凝胶电泳，验证蛋白的纯化程度；

(6)对纯化蛋白的浓度进行测定，浓度为3mg/ml。

实施例16

实施例8中免疫动物按以下步骤进行：

(1)将纯化之后得到的蛋白，利用pbs缓冲液均稀释到浓度为1mg/ml，用于免疫新西兰大白兔；

(2)首次免疫前，从兔耳缘静脉采血，分离血清之后保存在-80℃中，用作阴性对照；

(3)将纯化后的蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1进行混合，乳化完全以后，通过多点皮下注射入大白兔中，首次免疫的间隔为15天，抗原蛋白量至少为0.5mg；

(4)将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1进行混合，形成稳定的乳剂之后，通过白兔皮下多点注射进行二次免疫，二次免疫的间隔为15天；

(5)第三次免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1进行混合，乳化之后，通过多点注射入白兔皮下；7天之后，白兔耳缘静脉采血，收集血清，通过elisa检测抗血清效价；

(6)效价达到要求后，可大量采血，37℃中放置1h，3000r/min离心20min之后，收集上层血清，分装成每管20μl后保存于-80℃冰箱中。

实施例17

实施例8中elisa检测抗血清效价按以下步骤进行：

(1)利用包被缓冲液稀释原核表达蛋白至浓度0.01mg/ml，每个酶标孔中加入100μl抗原，每一种抗原做一个平行对照，4℃条件下过夜；

(2)弃掉包被液，每孔加入200μlpbst,反复震荡3次，每次3min，弃去废液；

(3)每孔加入200μl5％脱脂乳进行封闭，37℃、2h；之后pbst清洗三次；

(4)将阴性血清和免疫抗血清分别按照相应的浓度利用抗血清稀释液进行稀释，酶标板第一行加入不同稀释浓度抗血清，第二行为相应浓度的阴性对照血清，第三行为空白对照；每孔加入100μl，37℃条件下孵育1h；之后用pbst洗三次；

(5)将二抗(rabbitanti-iggconjugatedtohorseradishperoxidase)稀释为1:3000，每孔加入100μl，37℃孵育1h，之后弃去二抗，用pbst洗三次；

(6)每孔加入100μl底物显色液(a+b混合)，避光反应15分钟；

(7)每孔加入50μl终止液，直到溶液变为黄色，在20分钟内，在450nm处，用酶标仪测定吸光度值；

(8)(阳性抗血清-空白对照)/(阴性血清-空白对照)的吸光度比值大于或等于2.1，此时抗血清的浓度稀释倍数即为该抗血清的效价，进行后续蛋白检测试验，对于抗血清效价的最低要求为1:5000。

实施例18

利用实施例8制备的多克隆抗体可通过westernblot实验检测不同发育阶段三倍体雌性虹鳟性腺中atg12蛋白的表达量。结果表明，200dpf、220dpf和240dpf时期性腺中atg12蛋白表达量显著高于其它时期(p<0.05)，呈现先升高后降低的趋势(如图2所示)。

实施例19

利用实施例8制备的多克隆抗体进行免疫组化实验结果显示(如图3所示)，180-300dpf时期二倍体卵巢中细胞未见自噬，细胞胞浆染色呈蓝色表明出现的为阴性结果(图3-a、b、c)。三倍体卵巢阴性对照未出现阳性结果(图3-d)，180-300dpf时期三倍体卵巢中的细胞普遍发生自噬现象，随发育自噬现象加剧，至240dpf时，大部分细胞胞浆染色呈黄褐色，表明出现的为阳性结果(图3-e、f、g、h、i)。经统计，不同时期的阳性表达率分别为25％、41％、87％、83％、36％。

序列表

<110>中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120>虹鳟atg12基因及虹鳟atg12蛋白

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>363

<212>dna

<213>虹鳟(oncorhynchusmykiss)

<400>1

atgtctgacaacgcagagtctcctacagaaacgcaaaaagatgagccttcaaccccacaa60

cagcctacggaagactcggggatggcagacgataagaaaaaaattgatgtgttgttgaag120