HCV重组抗原及其突变体的制作方法

2021-02-02 21:02:12|

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本发明涉及hcv检测领域。具体而言，本发明涉及hcv重组抗原及其突变体，其可以用于检测来自受试者的样品中的hcv抗体的存在等。本发明还涉及编码所述的hcv重组抗原及其突变体的核酸以及相关的载体、宿主细胞、免疫测定法和检测试剂盒等。

背景技术：

丙型病毒性肝炎，简称丙型肝炎或丙肝，是由丙型肝炎病毒(hepatitscvirus，hcv)感染而引发的疾病，主要由血液或体液传播。据世界卫生组织估计，全球约有1.8亿人感染丙肝，全球hcv的感染率约为3％。在我国健康人群抗hcv阳性率为0.7％-3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，导致约80％的hcv感染者发展为慢性肝炎，其中10％-20％将发展成肝硬化，肝硬化患者中每年有1％-5％发展成为肝细胞癌症，因此，慢性hcv感染的流行成为世界各国一项重要的社会经济负担。

hcv为单股正链rna病毒，基因组全长约9.5kb可分为3个区域，即5’非编码区(5’utr)、编码区(orf)、3’非编码区(3’utr)，其排列顺序为5′utr-c-e1-e2-p7-ns2-ns3-ns4-ns5-3′utr。5’utr为高度保守区，是病毒翻译的起始位点，在hcv复制过程中有非常重要的作用。开放读码框架(orf)包括结构蛋白区c、e1、e2和非结构蛋白区p7、ns2-ns5。包膜区(e1、e2)和核心区(c)编码病毒颗粒，非结构蛋白区在病毒复制和病毒蛋白合成中起重要作用。其中核衣壳蛋白(core)和非结构蛋白部分的ns2、ns3、ns4a、ns5a和ns5b等是目前主要的免疫诊断研究的重要靶点。

hcv核心蛋白(core蛋白)位于hcv基因组的第342-914核苷酸位点，编码191个氨基酸，氨基酸序列十分保守。hcvcore蛋白是一种具有多种生物学功能的病毒蛋白，除了具有组装病毒颗粒的功能外，还在hcv增殖及致病机制中起重要作用，是hcv感染的重要标志。hcvcore蛋白在hcv感染后体内抗体阳转前即可产生，是患者体内hcv复制和hcv病毒载量的重要指标。由于高度保守且有很强的免疫原性，使得其在hcv诊断和疫苗的研究中应用广泛。ns3基因位于hcv全基因组序列第3300-5200核苷酸位点，编码含有630个氨基酸。ns3蛋白具有蛋白酶功能，其n端的189个氨基酸具有丝氨酸蛋白酶活性，c端的442个氨基酸具有核苷三磷酸酶(ntpase)和rna解旋酶的活性。抗ns3抗体最早出现，ns3蛋白具有很强的抗原性，几乎所有的hcv感染者都会产生高滴度特异性的抗ns3抗体。ns4基因位于hcv全基因组的第4974-5133位核苷酸，编码两个蛋白ns4a和ns4b。ns4a为54个氨基酸的短肽，ns4b是一个27kda大小的定位于er膜的跨膜蛋白，具有很强的疏水性，ns4区含有至少两个免疫优势序列位点，抗原性强，绝大多数hcv感染者能产生针对该区的抗体。ns5基因编码区为全长3117个核苷酸，编码两个蛋白ns5a和na5b，是hcv基因组中最长的编码区。

随着基因工程技术的发展，对hcv病毒基因的分子生物学研究日趋成熟，并且应用于诊断试剂。hcv诊断试剂在不同检测平台上的主要使用core，ns3，ns4等基因片段，在诊断试剂中hcv诊断原料多以单独hcv-core、单独ns3、core+ns3嵌合、ns3+core嵌合、ns3+ns4嵌合等模式。嵌合方式的调整能够一定程度提高灵敏度，但是对特异性并没有很大帮助，因此，本领域仍然需要高灵敏度和高特异性检测hcv的产品。

技术实现要素：

在深入研究重组hcv抗原构建过程中，发明人发现现有的ns3区的1305/1315/1318/1394/1400/1454至少任意一位半胱氨酸突变为g/a(优选突变为a)，具有预料不到的优异效果，包括例如提高来自受试者样品中的hcv抗体检测的特异性，从而降低假阳性率。

因此，在一些实施方案中，本发明涉及以下一项或多项。

1.一种hcv重组抗原，其包含至少1个ns3抗原，其中所述ns3抗原中的至少一个半胱氨酸突变为g或a，优选突变为a，所述突变位点在hcv氨基酸第1192-1517位之间。

2.一种hcv重组抗原，其包含至少1个ns3抗原，其中所述ns3抗原在对应hcv氨基酸序列第1305/1315/1318/1394/1400/1454位中至少任意一位半胱氨酸突变为g或a，优选突变为a。

3.项目1所述的hcv重组抗原，其中所述ns3抗原包含选自hcv氨基酸序列第1027-1657位的ns3多肽，例如所述多肽的长度可以为41-631个氨基酸，例如41、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个氨基酸，例如所述ns3多肽包含hcv氨基酸序列第1027-1657、1380-1420、1075-1657、1230-1465、1192-1478、1377-1443、1192-1608或1192-1517位；例如所述ns3多肽包含选自seqidno：1-9的序列。

4.项目1-3中任一项所述的hcv重组抗原，其还包含另外的hcv抗原，例如另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns3抗原，另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns4抗原，另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns5抗原，和/或另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)核心抗原。

5.项目4所述的hcv重组抗原，其中ns3抗原，ns4抗原，ns5抗原和/或核心抗原之间直接连接或任选地通过一个或多个接头连接，例如所述接头可以是(g)n，(gs)n、(sg)n、(gggs)n或(ggggs)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整数。

6.项目1-5中任一项所述的hcv重组抗原，其中所述hcv重组抗原包含n和/或c端修饰，例如组氨酸标签、生物素化和/或可检测标记修饰。

7.项目1-6中任一项所述的hcv重组抗原，其中所述hcv包括hcv基因型1a，1b，2a，2b，2c，2d，3a，3b，3c，3d，3e，3f，4a，4b，4c，4d，4e，4f，4g，4h，4i，4j，5a或6a。

8.一种编码项目1-7中任一项所述的hcv重组抗原的核酸。

9.一种包含项目8所述核酸的表达载体。

10.一种包含项目9所述表达载体的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞。

11.一种缀合物，其包括项目1-7中任一项所述的hcv重组抗原。

12.项目11所述的缀合物，其还包含与hcv重组抗原缀合的固体支持物、可检测标记物或结合配偶体，例如所述缀合物中hcv重组抗原可以直接或间接进行缀合，例如其中固体支持物包括磁性颗粒、微量滴定板或纤维素膜，例如其中可检测标记物可以是金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记，例如可以是胶体金，放射性同位素，荧光团，自旋标记，或噬菌体标记，例如可以是罗丹明，荧光素，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记，例如其中结合配偶体包括生物素，链霉亲和素或亲和素。

13.一种试剂盒，其包含项目1-7中任一项所述的hcv重组抗原或项目11或12所述的缀合物。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含另外的hcv抗原，所述hcv抗原包含与hcv抗体免疫反应的表位。在一些实施方案中，本发明描述的hcv重组抗原可以与所述另外的hcv抗原共同包被在相同固相上或分别包被在单独固相上。

14.项目13所述的试剂盒，其还包含检测抗体。在一些实施方案中，所述检测抗体可以是检测人抗体的抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒中可以包含抗hcv抗体。在一些实施方案中，检测抗体和/或抗hcv抗体可以用可检测标记物标记。

15.项目1-7中任一项所述的hcv重组抗原或项目11或12所述的缀合物在制备用于检测来自受试者样品中的丙型肝炎病毒抗体或抗原的试剂盒中的用途。

16.项目15所述的用途，其中所述样品包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液，例如血液样品，例如血浆、血清、血制品，例如精液或阴道分泌物。

本发明的重组hcv抗原可以通过本领域已知的任何适当方法制备。例如，在一些实施方案中，可以制备编码本发明的重组hcv抗原的核酸，克隆到任意合适的载体如质粒、噬菌体、粘粒中，然后通过适当的表达系统(例如昆虫、哺乳动物、细菌、病毒、酵母表达系统)通过适当的宿主表达重组分子。在一些实施方案中，适合重组表达的宿主细胞是本领域熟知的，包括例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、人胚胎肾细胞、细菌宿主细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌属细胞，酵母宿主细胞如酿酒酵母等。在一些实施方案中，可以通过一个或多个接头连接抗原片段制备重组hcv抗原。本文使用的接头包括将目标多肽序列连接的天然或人工多肽序列。接头可以具有约4至约50个氨基酸的长度，例如约6至约30个氨基酸的长度。在一些实施方案中，本发明中hcv的基因型没有特别限定，可以包括例如hcv基因型1a，1b，2a，2b，2c，2d，3a，3b，3c，3d，3e，3f，4a，4b，4c，4d，4e，4f，4g，4h，4i，4j，5a或6a。本发明中ns3抗原在对应hcv氨基酸序列第1305/1315/1318/1394/1400/1454位置应该理解为对应本发明实施例中半胱氨酸所在的位置。

在一些实施方案中，本申请的重组hcv抗原中除了包含本文描述的突变的ns3抗原以外，还可以包含另外的hcv抗原，例如另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns3抗原，另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns4抗原，另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)ns5抗原，和/或另外的1个或多个(例如至少1、2、3或更多个)核心抗原。在一些实施方案中，如果所述重组hcv抗原中包括多个(例如2个、3个或更多个)相同类型的抗原，例如多个ns3、ns4、ns5、核心抗原，则它们可以相同或不同。

在一些实施方案中，本发明的重组hcv抗原可以包含进一步的修饰，例如标签修饰。本发明的重组hcv抗原的标签修饰没有特别限制，例如可以是蛋白纯化标签，例如亲和标签，例如生物素标签。如本领域已知的，可以通过使靶标hcv抗体与标签化的重组hcv抗原特异性结合，并通过识别标签的结合配偶体分离实现靶标hcv抗体的分离。

在一些实施方案中，来自受试者的样品中的hcv抗体识别在本发明的重组hcv抗原中的表位，因此本发明的重组hcv抗原可用于免疫测定中检测来自受试者的样品中的hcv抗体。在一些实施方案中，本发明的重组hcv抗原可以用于进行免疫测定，例如elisa，荧光免疫层析，胶体金免疫层析，化学发光测定，电化学发光测定，间接免疫荧光测定ifa，放射免疫测定ria以及其它非酶联抗体结合试验或方法。在一些实施方案中，本发明的重组hcv抗原既可以作为捕获抗原，也可以作为检测抗原，或者同时作为检测抗原和捕获抗原。在一些实施方案中，与本发明的重组hcv抗原配对的另一株抗原可以相同或不同，只要包括本发明的hcv重组抗原中各片段即可。例如，在一些实施方案中，与本发明的重组hcv抗原配对的另一株抗原可以是与本发明的重组hcv抗原完全相同的抗原，也可以是包含本发明的重组hcv抗原的对应片段的不同抗原。在一些实施方案中，例如在elisa实验方案中，可以将重组hcv抗原作为捕获抗原包被固相如磁珠，用于捕获样品中的hcv抗体，经显色后读取结果。在一些实施方案中，免疫测定中使用的抗原或抗体可以固定到表面上，例如固相支持物上，例如塑料、膜如硝酸纤维素膜、玻璃、磁珠或金属支持物。在一些实施方案中，来自受试者的样品与所述固相支持物接触，然后接触带有可检测标记的检测抗体或检测抗原识别后进行显色。在本文中，来自受试者的样品可以包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液，例如血液样品，例如血浆、血清、血制品，例如精液或阴道分泌物。

在一些实施方案中，检测抗原或检测抗体(如抗人igg抗体或抗人igm抗体)可以用可检测标记物标记。在一些实施方案中，用于标记抗原或抗体的可检测标记物没有特别限制。在一些实施方案中，所述标记可以包括但不限于荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记，以及间接标记如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。在一些实施方案中，示例性标记包括但不限于放射性同位素，荧光团，罗丹明及其衍生物，荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶(hrp)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记等等。

在一些实施方案中，本发明提供一种方法，例如用于检测来自受试者的样品中的抗hcv抗体存在的免疫测定法，所述方法可以包括：使本发明的重组hcv抗原和所述样品接触，在所述样品中存在hcv抗体的情况下，形成所述hcv抗体和所述重组hcv抗原的复合物，和检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在指示所述样品中存在hcv抗体。在一些实施方案中，可以通过确定可检测标记(例如荧光标记)检测所述复合物。在一些实施方案中，可以使含有或疑似含有hcv抗体的样品与本发明的重组hcv抗原和至少一种检测抗体(例如第二检测抗体或第三检测抗体，如带有可检测标记的抗igg抗体或抗igm抗体)同时或按任意顺序接触。在一些实施方案中，本发明的方法和/或试剂盒适用于任何适当的自动化或半自动化系统中。

在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的重组hcv抗原的试剂盒，例如用于检测来自受试者样品的hcv抗体存在的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括适合进行免疫测定的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含用于检测hcv抗体的免疫测定中使用本发明的免疫诊断试剂(例如包含重组hcv抗原的缀合物)的说明书。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含校准物或对照物，例如标准或对照hcv抗体。在一些实施方案中，本发明的重组hcv抗原或缀合物包含在试剂盒中的容器如试管、微量板或试纸条上。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含固相支持物如磁珠、试管、微量板、比色皿、薄膜、滤纸、注射器、移液器、缓冲液如测定缓冲液、洗涤缓冲液、预处理试剂、可检测标记如酶标记的底物溶液等。

在一些实施方案中，本发明包括含有所述重组hcv抗原的试纸条，例如侧向层析检测试纸条。在一些实施方案中，所述检测试纸条包含包被于固相上的重组hcv抗原，带有可检测标记(如胶体金)的至少一种检测抗体或至少一种检测抗原。在一些实施方案中，所述检测试纸条包含带有可检测标记的重组hcv抗原，包被于固相上的至少一种检测抗体或至少一种检测抗原。在一些实施方案中，本发明可以通过肉眼观察或化学发光全自动仪器快速准确地检测受试者中的hcv抗体。在一些实施方案中，可以利用双抗原夹心原理制备试剂盒。例如，在一些实施方案中，样品中的抗体被包被在固相上的重组hcv抗原捕获，或样品中的抗体被可检测标记物标记的重组hcv抗原检测。在一些实施方案中，可以利用间接法原理制备试剂盒。例如，在一些实施方案中，样品中的抗体被包被在固相上的重组hcv抗原捕获。在一些实施方案中，加入激发液，用化学发光全自动仪器测量发光值，发光值与样品中的抗体总浓度呈正相关，与临界值相比较，从而判断阴阳性。本文使用的术语抗体如检测抗体没有特别限制，可以包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、单链抗体、单结构域抗体，也可以包括所述抗体的功能片段，例如fab片段、f(ab′)片段、fab′-sh片段、f(ab′)2片段、fd片段、fv片段、单链fv片段(scfv)、dab片段、分离的互补性决定区(cdr)和抗独特型抗体、双功能抗体或双结构域抗体等。

在一些实施方案中，本文描述的方法和/或试剂盒可以用于检测来自受试者的样品中的hcv抗体的存在、测量hcv抗体的量或浓度、用于监测疾病进展、监测治疗效果、和/或确定受试者的肝炎发病或发病风险等。

本发明的方法和/或产品解决了灵敏度低、特异性低等中的一种或多种问题，因此与现有方法相比有利地具有下述一个或多个方面的优势：提高的灵敏度和/或提高的特异性等。

具体实施方式

实施例1含融合蛋白载体的构建

本实施例选择以融合蛋白作为特定蛋白进行克隆构建，其序列如下所示；其dna序列可以以e.coli、pet32a、基因合成等方式进行获得，同时也可进行密码子优化以达到最佳的表达状态。本实施例下述序列，构建含有his标签表达载体，并在融合蛋白序列3’端引入(ggggs)3融合蛋白，并预留bglii/ecori酶切位点。

融合蛋白序列：

实施例2hcv基因工程重组蛋白表达质粒的构建

设计hcv重组蛋白的基因片段(参见实施例5)，各基因片段的链接方式可以通过限制性内酶切以及t4dna连接酶工具酶以酶切、连接的方式拼接同时也可以以桥式pcr的以引物褡裢的形式进行拼接。各区段间可以通过或不通过接头(linker)连接，接头可以采用常见的接头形式，例如ggggsggggsggggs。以上基因片段均通过限制性内酶切以及t4dna连接酶工具酶以酶切、连接的方式构建到实施例1的表达载体上。

实施例3hcv重组蛋白诱导表达及纯化

重组蛋白诱导表达：将构建好的上述表达质粒用热激法将质粒转化到大肠杆菌bl21感受态(neb(newenglandbiolabs)，货号：c2530h)细胞中，并涂布于含50ug/mlkan的lb平板，37℃培养16h。挑取但菌落，挑选经菌液pcr鉴定、双酶切鉴定正确的阳性菌株进行保种并接种到含50ug/mlkan的lb培养基中，37度震荡培养。待od600达到0.6-0.8后，加入1.0mmiptg，37℃诱导培养2-4h，提取总蛋白，sds-page鉴定重组蛋白表达情况。通过重组蛋白n端带有的6*his标签，经过镍离子螯合纯化和sp柱纯化后得到纯度达到96％的蛋白。

实施例4评价hcv重组蛋白的双抗原夹心法检测丙型肝炎抗体的灵敏度

将上述纯化出来的hcv重组抗原，制备成hcv胶体金侧向层析检测试纸条，具体流程如下：

4.1胶体金制备

在三角烧瓶中加入100ml超纯水，磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％氯金酸(sigma-aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加入1ml1％柠檬酸三钠(sigma-aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续沸腾10分钟，然后自然冷却即可。

4.2hcv重组抗原-胶体金缀合物的制备

取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入170ul的0.2mk2co3调节ph至7.5，继续搅拌20秒；加入一定量的抗融合蛋白单克隆抗体，继续搅拌10分钟；加入0.1ml10％bsa，继续搅拌5分钟；8000g离心20分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(20mmpb，150mmnacl，1％bsa，0.2％tritonx-100，2％sucrose，0.01％proclin300)定容至1ml；最后在该1ml胶体金标记的抗融合蛋白单克隆抗体复合物中加入一定量的带融合蛋白的hcv重组抗原，充分混匀后放-4℃保存，制得hcv重组抗原-胶体金缀合物。

4.3金标垫制备

将上述hcv重组抗原-胶体金缀合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(watman公司)，冻干，即制成金标垫；

4.4硝酸纤维素膜(nc膜)包被

以对应的hcv重组抗原(同一组检测所用重组抗原相同)作为hcv包被抗原，用检测线稀释液(10mmpbs+2％蔗糖)稀释hcv包被抗原至0.5mg/ml制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(millipore公司，货号：hf135002)的相应位置上，37度干燥1小时。

4.5组装

将上述金标垫，分别搭配包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成hcv金标检测试剂条。

4.6检测方法

加80ul待测样品(例如：血清)到样品垫处，室温放置15分钟之后，判定结果；

4.7hcv胶体金检测试纸条性能评价

利用1000份阴性样本进行特异性检测。

实施例5

如下所述进行ns3重组抗原构建，检测ns3重组抗原的特异性，结果发现对ns3区的1305/1315/1318/1394/1400/1454至少任意一位半胱氨酸突变为g或a，能够提高ns3检测的特异性，其中优选为突变为a。

构建的ns3重组抗原的区段和包含的突变以及检测特异性详见下述：

ns3-10重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1075-1657，检测特异性：98.4％。

ns3-11重组抗原，在ns3-10序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.9％。

ns3-20重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1192-1608，检测特异性：98.3％。

ns3-21重组抗原，在ns3-20序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.8％。

ns3-30重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1192-1517，检测特异性：98.4％。

ns3-31重组抗原，在ns3-30序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.9％。

ns3-40重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1192-1478，检测特异性：98.0％。

ns3-41重组抗原，在ns3-40序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.8％。

ns3-50重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1230-1465，检测特异性：98.1％。

ns3-51重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.8％。

ns3-52重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1454a，检测特异性：98.7％。

ns3-53重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1318s，检测特异性：98.2％。

ns3-54重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1400g，检测特异性：98.6％。

ns3-55重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1305a，c1318a，c1454a，检测特异性：99.4％。

ns3-56重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1315s，c1394s，c1454s，检测特异性：98.3％。

ns3-57重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1315g，c1318g，c1454g，检测特异性：99.1％。

ns3-58重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1305a，c1315g，c1318a，c1394g，c1400a，c1454a，检测特异性：99.7％。

ns3-59重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1305g，c1315a，c1318a，c1394g，c1400a，c1454a，检测特异性：99.7％。

ns3-60重组抗原，在ns3-50序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318g，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.8％。

ns3-70重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1027-1657，检测特异性：97.8％。

ns3-71重组抗原，在ns3-70序列上包含的突变：c1305a，c1315a，c1318g，c1394a，c1400a，c1454a，检测特异性：99.6％。

ns3-80重组抗原，对应hcv氨基酸序列位置：1380-1420，98.3％，检测特异性：99.8％。

ns3-81重组抗原，在ns3-80序列上包含的突变：c1394a，c1400a，检测特异性：99.8％。

其中相应序列如下所示：

ns3-10(位于hcv氨基酸序列第1075-1657位，seqidno：1)：

ns3-20(位于hcv氨基酸序列第1192-1608位，seqidno：2)

ns3-30(位于hcv氨基酸序列第1192-1517位，seqidno：3)

ns3-40(位于hcv氨基酸序列第1192-1478位，seqidno：4)

ns3-50(位于hcv氨基酸序列第1230-1465位，seqidno：5)

ns3-70(位于hcv氨基酸序列第1027-1657位，seqidno：6)：

ns3-80(位于hcv氨基酸序列第1380-1420位，seqidno：7)：

实施例6

将实施例5所示的部分ns3区与ns4区和/或core区进行顺序融合，获得的hcv融合抗原制备胶体金检测试纸条，对1000份临床阴性样本进行检测，获得特异性检测结果。

构建的重组抗原所包含的区段以及检测特异性详见下述：

hcv-21重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-10，core-4，检测特异性：98.20％。

hcv-22重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-11，core-4，检测特异性：99.70％。

hcv-23重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-20，ns4-4，检测特异性：98.30％。

hcv-24重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-21，ns4-4，检测特异性：99.70％。

hcv-25重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-30，ns4-6，core-6，检测特异性：98.20％。

hcv-26重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-31，ns4-6，core-6，检测特异性：99.50％。

hcv-27重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-40，ns4-7，core-5，检测特异性：98.40％。

hcv-28重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-41，ns4-7，core-5，检测特异性：99.60％。

hcv-29重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-50，core-6，检测特异性：98.10％。

hcv-30重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-51，core-6，检测特异性：9970％。

hcv-31重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-58，ns4-5，core-6，检测特异性：99.50％。

hcv-32重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-59，ns4-5，core-6，检测特异性：99.50％。

hcv-33重组抗原，其为从n端至c端融合ns3-60，ns4-5，core-6，检测特异性：99.60％。

实施例7

对hcv-5重组hcv抗原中的两个ns3区中1305/1315/1318/1394/1400/1454中至少一个位点进行g/a/s任一突变，其余区段不变，获得的hcv融合抗原制备胶体金检测试纸条，对1000份临床阴性样本进行检测，获得特异性检测结果。hcv-5重组hcv抗原为从n端至c端融合第一ns3区、第二ns3区、第一ns4区、第二ns4区、第三ns4区、core区的融合多肽，其中各区按顺序分别为：ns3-3、ns3-7、ns4-3、ns4-4、ns4-5、core-6，无接头。

构建的重组抗原包含的突变以及检测特异性和灵敏度详见下述：

hcv-5，包含ns3-3，ns3-7，无突变，检测特异性：98.3％，灵敏度98％。

hcv-51重组抗原，包含ns3-3，c1318s；ns3-7，c1400s，检测特异性：98.4％，灵敏度98％。

hcv-52重组抗原，包含ns3-3，c1454a；ns3-7，c1394a，检测特异性：99.0％，灵敏度98％。

hcv-53重组抗原，包含ns3-3，c1315g；ns3-7，c1394g，检测特异性：98.9％，灵敏度98％。

hcv-54重组抗原，包含ns3-3，c1305s，c1318s；ns3-7，c1394s，c1400s，检测特异性：98.5％，灵敏度98％。

hcv-55重组抗原，包含ns3-3，c1315g，c1318a；ns3-7，c1394a，c1400g，检测特异性：99.3％，灵敏度98％。

hcv-56重组抗原，包含ns3-3，c1315g，c1318a，c1394a，c1400a；ns3-7，c1394g，c1400a，检测特异性：99.6％，灵敏度98％。

hcv-57重组抗原，包含ns3-3，c1305a，c1315a，c1318a，c1394g，c1400a；ns3-7，c1394g，c1400a，检测特异性：99.8％，灵敏度98％。

hcv-58重组抗原，包含ns3-3，c1305a，c1315a，c1318a，c1394a，c1400a，c1454a；ns3-7，c1394a，c1400a，检测特异性：99.9％，灵敏度98％。

注：特异性按1000分阴性样本检出率计算，灵敏度按100份riba确证的阳性样本检出率计算。

实施例2和3相应序列如下所示：