烯官能化的肝素化合物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及医疗器械表面肝素抗凝血涂层，更具体地涉及烯官能化的肝素化合物及其应用。

背景技术：

肝素作为一种主要的抗凝和抗血栓药物，临床使用已有近80年的历史，至今尚未有替代品，它相比其他抗凝剂的最大优势在于起效快、抗凝效果显著、临床应用经验丰富。肝素首先从肝脏发现而得名，由葡萄糖胺，l-艾杜糖醛苷、n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15kd，呈强酸性。它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。

近年来，肝素涂层技术在体外循环管路和人工心肺支持装置中的应用越来越多。肝素涂层技术是利用化学或物理反应等方式，将肝素牢固的结合在管路的内表面，肝素涂层管路的应用可以大大提高管路系统的生物、血液相容性，减低炎症反应，降低血液破坏，减少术后并发症等，可降低心脏外科手术术后住院率和死亡率，为人工心肺支持装置的推广应用提供了基础和条件，提高了危重心肺疾病的救治率。

目前肝素涂层的方法大体上可分为3类：1、离子键结合方式是利用肝素本身含有大量负电荷的属性，将高分子材料表面引入带正电荷的季胺基团偶联剂、表面活性剂或含有阳离子的聚合物，再与肝素作用，使材料表面靠离子键作用形成肝素化层。由于离子键结合的不稳定性，具有亲和力的白蛋白等血浆大分子物质可以同肝素结合而导致肝素分子脱落，所以仅能作为短期使用。2、共价键结合方式是利用高分子材料表面的-cns基、-nh2基、-oh基等特异性活性基团与肝素分子的-oh基作用来固定肝素。由于肝素具有大量功能性基团，往往与材料表面的结合过于牢固，导致肝素分子失去活性，因而往往不能得到预期的抗凝效果。3、终点固定方式是先在生物材料表面制备一种约束性离子复合物，再通过一种控制的亚硝酸降解步骤来活化肝素，使肝素分子产生一个终端自由醛基，这种类型的肝素可以通过氨化还原作用与谷氨酸二醛发生化学还原反应，将肝素以共价键方式固定于含氨基的材料表面。

以上肝素涂层均需要材料表面自身或者进行处理后其表面具有特定的属性，才能与涂层进行有效结合，这样不仅需要复杂的前处理过程，而且，可供选择的材料范围也很窄，限制了其在医疗上的广泛应用。2019年底，全球范围内新冠肺炎的爆发，对人工心肺支持设备与耗材从数量与支持时间上提出了更高的要求，因此，更高性能的肝素以及肝素涂层的开发变得十分迫切。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种烯官能化的肝素化合物及其应用。带有异氰酸酯基的不饱和单体的异氰酸酯基与肝素中的羟基反应得到烯官能化的肝素分子，进一步通过光引发剂能够引发烯官能双键发生自由基聚合反应，从而形成底层交联结合于基材，表层连接肝素分子起到抗凝血作用的肝素抗凝涂层。

本发明采用以下技术方案：

一种烯官能化的肝素化合物，其特征在于，该肝素化合物通过肝素与带有异氰酸酯基的不饱和单体反应得到，具体反应式如下：

其中：r为h或者-ch3

n为2-10之间的整数

所述异氰酸酯基不饱和单体与肝素的摩尔比大于1:1；反应的温度为50℃-90℃；反应时间为4-6小时。

本发明还提供了烯官能化的肝素化合物作为医疗器械或者医用耗材的肝素涂层的应用，其特征在于该涂层包含烯官能化的肝素化合物、光引发剂以及溶剂，还可以包含官能化单体、低聚物或者聚合物。

本发明的烯官能化的肝素化合物的肝素分子提供了涂层的抗凝血性能，而烯官能团则通过双键的交联反应将肝素分子固定在基材的表面，使得肝素分子与基材结合的更加牢固。

所述烯官能化的肝素化合物在肝素涂层溶液中的质量含量为0.5～5％。

优选地，所述光引发剂为任何可以获得的自由基光引发剂，包含：苯偶姻及衍生物(如：安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚)；苯偶酰类(如：二苯乙酮、α,α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮)；烷基苯酮类(如：α,α-二乙氧基苯乙酮、α-羟烷基苯酮、α-胺烷基苯酮)；酰基磷氧化物(如：芳酰基膦氧化物、双苯甲酰基苯基氧化膦)；二苯甲酮类(如：二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮)；硫杂蒽酮类(如：硫代丙氧基硫杂蒽酮、异丙基硫杂蒽酮)。常用的商品化的自由基光引发剂包含：tpo(2,4,6(三甲基苯甲酰基)二苯基氧化膦)、tpo-l(2,4,6一三甲基苯甲酰基膦酸乙酯)、907(2-甲基-1-[4-甲硫基苯基]-2-吗琳基-1-丙酮)、itx(2-异丙基硫杂蒽酮)、edb(4-二甲胺基-苯甲酸乙酯)、184(1-羟基-环己基一苯基甲酮)、1173(2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮)、bdk(安息香双甲醚)、ombb(邻苯甲酰苯甲酸甲酯)、cbp(4-氯二苯甲酮)、184(1-羟基-环已基-苯基甲酮)、tbpb(过氧化苯甲酸叔丁酯)、dcp(过氧化二异丙苯)、bpo(过氧化二苯甲酰)、lpo(过氧化二月桂酰)、ch335(1,1-二叔丁基过氧化-3,3,5-三甲基环己烷)、bdk(安息香双甲醚)、epd(4-(n,n-二甲氨基)苯甲酸乙酯)、bp(二苯甲酮)、4-氯二苯甲酮、邻苯甲酰苯甲酸甲酯、二苯基碘鎓盐六氟磷酸盐、eha(对位n,n-二甲氨基苯甲酸异辛酯)、pbz(4-苯基二苯甲酮)、irgacure2959(2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基乙基苯基甲酮)、irgacure651(苄基二甲基缩酮或2,2-二甲氧基-1,2-二苯基乙酮，ciba-geigy)、irgacure184(1-羟基-环己基-苯基甲酮作为活性组分，ciba-geigy)、darocur1173(2-羟基-2-甲基-1-苯基丙-1-酮作为活性组分，ciba-geigy)、irgacure907(2-甲基-1-[4-(甲硫基)苯基]-2-吗啉代丙-1-酮，ciba-geigy)、irgacure369(2-苄基-2-二甲基氨基-1-(4-吗啉代苯基)-丁-1-酮作为活性组分，ciba-geigy)、esacurekip150(聚{2-羟基-2-甲基-1-[4-(1-甲基乙烯基)苯基]丙-1-酮}，fratellilamberti)、esacurekip100f(聚{2-羟基-2-甲基-1-[4-(1-甲基乙烯基)苯基]丙-1-酮}和2-羟基-2-甲基-1-苯基-丙-1-酮的共混物，fratellilamberti)、esacurekto46(聚{2-羟基-2-甲基-1-[4-(1-甲基乙烯基)苯基]丙-1-酮}，2,4,6-三甲基苯甲酰基二苯基氧化膦和甲基二苯甲酮衍生物的共混物，fratellilamberti)、irgacure819(二(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-苯基氧化膦，ciba-geigy)、irgacure1700(二(2,6-二甲氧基苯甲酰基)2,4,4-三甲基苯基氧化膦和2-羟基-2-甲基-1-苯基丙-1-酮的25∶75％共混物，ciba-geigy)，以及其类似物。

所述光引发剂可以单独使用，也可以混合使用。本发明实施例采用常用的irgacure2959。

所述光引发剂的含量在亲水涂层溶液中的质量含量为0.1-10％。

肝素涂层溶液还包含足量的溶剂，以分散或溶解配制品中的其他组分。溶剂应当毒性小、易于挥发，并且使聚合物能够溶解或至少分散于其中。为了很好地溶解或分散亲水性聚合物，溶剂优选为极性液体。

所述溶剂在涂层溶液中的质量含量≥70％。考虑处理性能(低粘度)和/或为了便于组合物的涂覆以得到期望厚度的涂层，在涂层溶液中溶剂的重量含量优选≥80％。

所述肝素涂层溶液还可以包含：官能化的单体、低聚物或者聚合物。添加官能化的单体、低聚物或者聚合物可进一步改善肝素涂层与基材的结合力。

其均为可商业获得的官能化的单体、低聚物或者聚合物；包含：单官能丙烯酸酯，如：甲氧基聚乙二醇单丙烯酸酯、烷氧化苯酚丙烯酸酯、2(2-乙氧基)乙基丙烯酸酯、四氢呋喃丙烯酸酯、2-苯氧基乙基丙烯酸酯、丙烯酸异癸酯、丙烯酸已内酯、丙烯酸异冰片酯、三羟甲基丙烷缩甲醛丙烯酸酯、烷氧化壬基苯酚丙烯酸酯；单官能甲基丙烯酸酯，如：2-苯氧基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸异冰片酯；双官能丙烯酸酯单体，如：1,6-己二醇二丙烯酸酯、烷氧化己二醇二丙烯酸酯、二缩三丙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇(400)二丙烯酸酯、二丙二醇二丙烯酸酯、(3)乙氧化双酚a二丙烯酸酯、(4)乙氧化双酚a二丙烯酸酯、(10)乙氧化双酚a二丙烯酸酯、三环癸烷二甲醇二丙烯酸酯、(2)丙氧化新戊二醇二丙烯酸酯；双官能甲基丙烯酸酯单体，如：乙氧化双酚a二甲基丙烯酸酯、三缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3丁二醇二甲基丙烯酸酯、(2)乙氧化双酚a二甲基丙烯酸酯、(10)乙氧化双酚a二甲基丙烯酸酯；三官能丙烯酸酯单体，如：(6)丙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三(2-羟乙基)异氰尿酸三丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、(3)乙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、(3)丙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、(9)丙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、(3)丙氧化丙三醇三丙烯酸酯、(15)乙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；三官能甲基丙烯酸酯单体，如：三官能酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；多官能丙烯酸酯单体，如：季戊四醇四丙烯酸酯。以及脂肪族聚氨酯丙烯酸酯、脂肪族聚氨酯甲基丙烯酸酯、芳香族聚氨酯丙烯酸酯、环氧丙烯酸酯、环氧甲基丙烯酸酯等。优先选择与基材极性相近的的聚合物或者低聚物。

本发明的有益效果为：提供一种烯官能化的肝素化合物，该化合物通过温和的反应条件即可获得，不会对肝素的活性造成影响。同时，提供了带有烯官能化的肝素化合物作为肝素涂层的应用方法，烯官能化的肝素化合物的烯官能团可参与光引发自由基聚合反应，从而形成交联骨架，交联骨架的表面为肝素分子，通过该方法得到的肝素涂层无需作为基底的材料表面具有特殊的结构或性能，也无需进行复杂的预处理，材料适用范围广泛，工艺简单。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明技术方案进一步说明。显然，本领域技术人员基于本发明的宗旨所做的许多修改和变化属于本发明的保护范围。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当称元件、组件被“连接”到另一元件、组件时，它可以直接连接到其他元件或者组件，或者也可以存在中间元件或者组件。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。

烯官能化的肝素化合物的制备：该肝素化合物通过肝素与带有异氰酸酯基的不饱和单体反应得到，该反应发生在异氰酸酯基的不饱和单体的异氰酸酯基与肝素分子的羟基之间，为了保证肝素分子反应完全，应使异氰酸酯基过量，即异氰酸酯基不饱和单体与肝素的摩尔比大于1:1；反应的温度为50℃-90℃；反应时间为4-6小时。得到烯官能化的肝素，具体反应式如下：

其中：r为h或者-ch3

n为2-10之间的整数

肝素涂层溶液的制备：将烯官能化的肝素化合物与光引发剂、溶剂以及官能化单体、低聚物或者聚合物混合配制成溶液，烯官能化的肝素化合物在肝素涂层溶液中的质量含量为0.5-5％，光引发剂在肝素涂层溶液中的质量含量为0.1-10％，溶剂在肝素涂层溶液中的质量含量≥80％。

涂层溶液的涂敷：在温度18-28℃，湿度45％-65％rh的洁净室内进行肝素涂层溶液的涂敷。涂敷前，使用无尘布蘸取异丙醇将外径3mm的pvc管擦拭三次，再用干燥无尘布将pvc管上异丙醇擦干，晾干5分钟后开始进行涂层溶液涂敷。在涂敷过程中，将pvc管浸入到配制好的涂层溶液中，待pvc管2/3长度浸没在溶液中时，缓慢提起pvc管，然后放置到紫外光源下进行固化。紫外固化光源的实际光强应大于40mw/cm2，固化时间150s。

血小板吸附测试：取健康人全血9ml，加入1ml浓度为109mmol/l枸橼酸钠溶液和8mlpbs缓冲液充分混合，以1200rpm/min转速下离心5min后，取上层清夜。将上述pvc管在上层清液中浸泡1h，之后用pbs缓冲液冲洗3次去除表面吸附不牢固的血小板，将pvc管浸入质量浓度2.5％wt戊二醛溶液中固定12h，然后脱水并在空气中自然干燥，喷金，在扫描电子显微镜(sem)下观察血小板吸附数量及形态。

对比例1

以未经过处理的pvc管作为对照样进行血小板吸附测试，结果表明样品表面吸附了一层血小板，且已经严重变形，聚集行为严重。

实施例1-5

烯官能化的肝素化合物的制备：将15g的肝素溶于100ml的无水thf中，置于三颈瓶中，搅拌均匀通入干燥的n2，加热到60℃；将0.3g的异氰酸酯丙烯酸乙酯溶于20ml无水thf中，置于滴液漏斗中，缓慢滴加入三颈瓶中，30min滴加完成，继续保持温度反应4h。用无水乙醚沉淀两次，置于真空烘箱中干燥24小时。得到烯官能化的肝素化合物。

肝素涂层溶液的制备：在200ml的棕色烧瓶中，按照下表1所示的配方分别加入烯官能化的肝素、光引发剂、溶剂以及官能化的单体、低聚物或者聚合物，室温搅拌至聚合物完全溶解并形成均匀溶液。

表1不同肝素涂层溶液配方

分别采用1-5号涂层溶液进行pvc管的涂敷以及血小板吸附测试，测试结果如下表2所示。

表2不同样品的血小板吸附测试结果

如上所述，对本发明的实施例进行了详细地说明，但是只要实质上没有脱离本发明的发明点及效果可以有很多的变形，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，这样的变形例也全部包含在本发明的保护范围之内。

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