一种离心式核提扩增一体化系统及检测方法与流程

2021-02-02 19:02:50|

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本发明涉及生物医学基因分析仪器技术领域，具体来说，涉及一种离心式核提扩增一体化系统及检测方法。

背景技术：

核酸提取及聚合酶链反应（pcr）是分子生物学常用的分析手段。一直以来，传统核酸提取及pcr都在分立的仪器中进行，实验人员在做完样本前处理后，需要手工进行核提的上样，并在核提结束后，手工配制pcr实验体系，上机检测，整个流程下来，至少需要半天时间，分析检测时间过长，浪费时间和人力。

另外，核提及pcr的分立流程容易导致交叉污染及环境污染，带来检测结果的假阳性，影响结果分析，有鉴于此，急需开发一款集核酸提取、pcr扩增检测于一体的系统。

技术实现要素：

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种离心式核提扩增一体化系统，能够克服现有技术的上述不足，可以缩短分析检测时间，减少了交叉污染的可能性，检测结果更准确。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种离心式核提扩增一体化系统及检测方法，包括离心式核提扩增一体化仪器和进行核提扩增一体化反应的卡盒，所述卡盒包括核酸处理区和核酸检测区，所述核酸处理区与所述核酸检测区之间通过沟道连通，所述沟道中设有封堵的蜡阀；

所述离心式核提扩增一体化仪器上设有卡盒承托机构、离心运动驱动装置、温控反应机构、光学检测机构及电路控制系统。

进一步地，所述卡盒上设有采用化学惰性材料注塑加工而成的储液端，所述储液端连接的沟道及开口密封采用惰性材料的膜片或玻片，所述密封的方式为粘胶、uv胶曝光或超声焊接。

进一步地，所述核酸检测区的数量为一个或多个，所述核酸检测区预埋有反应试剂，所述反应试剂的形态为干粉、冻干球或液态的反应体系。

进一步地，所述卡盒在还包括废液区和注液区；所述注液区与所述核酸处理区及所述核酸处理区与所述废液区均通过沟道连通，所述沟道中设有封堵的蜡阀；所述注液区的数量为一个或多个，所述注液区预埋有核提反应试剂，所述核提反应试剂的形态为干粉、冻干球或液态的反应体系。

进一步地，所述卡盒可采用磁珠法或离心柱法的核酸提取及纯化；所述磁珠法核酸提取及纯化方式，所述离心式核提扩增一体化仪器上设有与所述核酸处理区的磁珠对位的磁珠吸附机构；所述离心柱核酸提取及纯化方式，所述核酸处理区中部加入有离心柱。

进一步地，所述卡盒固定于所述卡盒承托机构上方，所述至少承载两个所述卡盒，两个所述卡盒以轴对称或中心对称的方式排布；

所述温控反应机构位于卡盒承托机构上方，所述卡盒的核酸检测区与所述温控反应机构紧密接触，所述光学检测机构固定于所述离心运动驱动装置外侧。

进一步地，还包括融蜡机构，所述融蜡机构的采用接触式融蜡或非接触式融蜡；所述融蜡机构采用接触式融蜡，所述卡盒承托机构上表面与所述卡盒蜡阀的位置设有对应接触的温度控制点；所述非接触式融蜡方式，所述融蜡机构固定于离心机构外侧，可采用红外照射加热。

进一步地，所述卡盒承托机构以电路控制系统设定的转速进行离心式的旋转运动，所述卡盒的每个所述核酸检测区依次通过光学检测机构进行光学信号检测。

在本发明的另一方面，提供一种离心式核提扩增一体化的检测方法，包括荧光检测方法和显色检测方法；

所述荧光检测方法中，所述光学检测机构通过光纤连接有检测光路，所述光纤固定对准核酸检测区的一周，所述核酸检测区旋转经过所述光纤的路径时，所述检测光路的激发光源发光进入所述核酸检测区射入到检测器件，所述检测器件转换为电信号传输到电路控制系统；

所述显色检测方法中，激发光源及检测器件分别置于所述核酸检测区的上侧和下侧或内侧和外侧，所述激发光源发出的光射入所述核酸检测区，经过显色体系吸收后的光射入到激发光源另一侧的检测器件。

进一步地，在所述荧光检测方法中，所述激发光源及所述检测器件分别置于与所述核酸检测区所在圆周的不同方向，所述激发光斜射入所述核酸检测区，发出的光经过滤片射入到另一方设置的检测器件；

在所述显色检测方法中，所述激发光源与所述检测器件的设置有角度，所述激发光源发出的光射入所述核酸检测区，经过显色体系吸收后的光射入到检测器件；

所述荧光检测方法中，所述光学检测机构至少进行一个光学通道的检测。

本发明的有益效果：系统操作简单、体积小、自动化程度高；只需手工加入样本，系统便可全自动流程运行，整个过程仪器是无液体操作；无需手动对提取物进行转移，避免交差污染；降低结果假阳性的风险；将提取的核酸模板直接在同一个卡盒上进行扩增反应，使不同反应卡盒内的反应液体一次性离心进入相关区域，实现自动化操作的同时减少了液体转移的时；旋转式的方式使卡盒可以依次通过pcr光学检测机构，减少了传统模式的光学机构扫描时间或成像时间。此外改系统特别适用于急诊、中小型医院等非特定的pcr实验室环境，同时对操作人员也无专业要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1据本发明实施例所述的卡盒的结构示意图

图2是根据本发明实施例所述的卡盒采用离心柱法的结构示意图；

图3是根据本发明实施例所述的卡盒采用磁珠法的结构示意图；

图4是根据本发明实施例所述的离心式核提扩增一体化仪器的剖视结构示意图；

图5根据本发明实施例所述的荧光法检测结构示意图一；

图6根据本发明实施例所述的荧光法检测结构示意图二；

图7根据本发明实施例所述的显色法透射检测结构示意图一；

图8根据本发明实施例所述的显色法透射检测结构示意图二；

图9根据本发明实施例所述的显色法反射检测结构示意图一；

图10根据本发明实施例所述的显色法反射检测结构示意图二。

图中：10、卡盒；10-1、废液区；10-2、注液区；10-3、样本区；10-4、裂解结合区；10-5、清洗液区；10-6、洗脱液区；20、离心式核提扩增一体化仪器；1、核酸处理区；1-1、离心柱；1-2、磁铁；1-3、磁铁运动轨道；2、核酸检测区；3、蜡阀；4、卡盒承托机构；5、离心运动驱动装置；6、温控反应机构；7、光学检测机构；8、温控反应机构；7-1、光纤。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-4所示，根据本发明实施例所述的一种离心式核提扩增一体化系统，包括离心式核提扩增一体化仪器20和进行核提扩增一体化反应的卡盒10，所述卡盒10包括核酸处理区1和核酸检测区2，所述核酸处理区1与所述核酸检测区2之间通过沟道连通，所述沟道中设有封堵的蜡阀3；

所述离心式核提扩增一体化仪器20上设有卡盒承托机构4、离心运动驱动装置5、温控反应机构6、光学检测机构7及电路控制系统。

在本发明的一个具体实施例中，所述卡盒10上设有采用化学惰性材料注塑加工而成的储液端，所述储液端连接的沟道及开口密封采用惰性材料的膜片或玻片，所述密封的方式为粘胶、uv胶曝光或超声焊接。

在本发明的一个具体实施例中，所述核酸检测区2的数量为一个或多个，所述核酸检测区2预埋有反应试剂，所述反应试剂的形态为干粉、冻干球或液态的反应体系。

在本发明的一个具体实施例中，所述卡盒10在还包括废液区10-1和注液区10-2；所述注液区10-2与所述核酸处理区1及所述核酸处理区1与所述废液区10-1均通过沟道连通，所述沟道中设有封堵的蜡阀3；所述注液区10-2的数量为一个或多个，所述注液区10-2预埋有核提反应试剂，所述核提反应试剂的形态为干粉、冻干球或液态的反应体系。

在本发明的一个具体实施例中，所述卡盒10可采用磁珠法或离心柱法的核酸提取及纯化；所述磁珠法核酸提取及纯化方式，所述离心式核提扩增一体化仪器20上设有与所述核酸处理区1的磁珠对位的磁珠吸附机构；所述离心柱核酸提取及纯化方式，所述核酸处理区1中部加入有离心柱。

在本发明的一个具体实施例中，所述卡盒10固定于所述卡盒承托机构4上方，所述4至少承载两个所述卡盒10，两个所述卡盒10以轴对称或中心对称的方式排布；

所述温控反应机构6位于卡盒承托机构4上方，所述卡盒10的核酸检测区2与所述温控反应机构6紧密接触，所述光学检测机构7固定于所述离心运动驱动装置5外侧。

在本发明的一个具体实施例中，还包括融蜡机构，所述融蜡机构的采用接触式融蜡或非接触式融蜡；所述融蜡机构采用接触式融蜡，所述卡盒承托机构4上表面与所述卡盒10蜡阀的位置设有对应接触的温度控制点；所述非接触式融蜡方式，所述融蜡机构固定于离心机构外侧，可采用红外照射加热。

在本发明的一个具体实施例中，所述卡盒承托机构4以电路控制系统设定的转速进行离心式的旋转运动，所述卡盒10的每个所述核酸检测区1依次通过光学检测机构7进行光学信号检测。

如图5-10所示,在本发明的另一方面，提供一种离心式核提扩增一体化的检测方法，包括荧光检测方法和显色检测方法；

所述荧光检测方法中，所述光学检测机构7通过光纤7-1连接有检测光路，所述光纤7-1固定对准核酸检测区1的一周，所述核酸检测区1旋转经过所述光纤7-1的路径时，所述检测光路的激发光源发光进入所述核酸检测区1射入到检测器件，所述检测器件转换为电信号传输到电路控制系统；

所述显色检测方法中，激发光源及检测器件分别置于所述核酸检测区1的上侧和下侧或内侧和外侧，所述激发光源发出的光射入所述核酸检测区1，经过显色体系吸收后的光射入到激发光源另一侧的检测器件。

在本发明的一个具体实施例中，在所述荧光检测方法中，所述激发光源及所述检测器件分别置于与所述核酸检测区1所在圆周的不同方向，所述激发光斜射入所述核酸检测区1，发出的光经过滤片射入到另一方设置的检测器件；

在所述显色检测方法中，所述激发光源与所述检测器件的设置有角度，所述激发光源发出的光射入所述核酸检测区1，经过显色体系吸收后的光射入到检测器件；

所述荧光检测方法中，所述光学检测机构7至少进行一个光学通道的检测。

在本发明的一个具体实施例中，所述核酸检测区2设有4个检测池，经过核酸处理区1处理后的核酸可以通过连通沟道串行或并行进入多个核酸检测池，与预包埋在检测池的体系反应，可以进行单样本多靶标的检测。

为了方便理解本发明的上述技术方案，以下通过具体使用方式上对本发明的上述技术方案进行详细说明。

卡盒10为自动核提及扩增反应的载体，包括核酸处理区1、核酸检测区2和废液区10-1，各个区域之间通过沟道连通，沟道中设有蜡阀封闭。

注液区10-2包括样本区10-3、裂解结合区10-4、清洗液区10-5和洗脱液区10-6；

离心式核提扩增一体化仪器包括卡盒承托机构4，离心运动驱动装置5，温控反应机构6、光学检测机构7和电路控制系统。

卡盒10的核酸检测区预埋的核酸检测试剂，采用的是荧光pcr扩增检测方法，卡盒10设有4个检测区，即通过一体化系统提取出来的核酸可以分配到4个检测区分别进行核酸扩增及检测。

卡盒10装载在卡盒承托机构4上，卡盒10随卡盒承托机构4在离心运动驱动装置5的带动下一起进行旋转运动，卡盒承托机构4上与卡盒10贴紧接触的位置设置的多个温度控制点，该温度控制点的位置与卡盒10的各个蜡阀的位置对应，可以在电路控制系统的控制下分别加热，通过接触对卡盒10的对应位置蜡阀传热，打开蜡阀并连通蜡阀封闭的不同区域之间的沟道。

温控反应机构6对接触的卡盒10的核酸检测区，提供核酸提取及扩增反应所需温度环境，光学检测机构7通过激发光源对核酸检测区的反应体系进行激发及荧光信号采集。

卡盒承托机构4由平台电机、传动装置和平台支撑组件组成，本实施例中的传动装置为带轮及同步带，平台电机通过传动装置带动卡盒承托机构4进行圆周运动。

温控反应机构6为pcr反应提供4℃~100℃的温度环境，包括pcr反应池适配件、温度传感器、帕尔贴和散热片。其中，帕尔贴提供升降温动力源，温度传感器对pcr反应池适配件进行实时反馈，电路控制系统会根据温度传感器的反馈温度，通过pid控制对帕尔贴进行温控，进而控制pcr反应池适配件高速升降温；散热片可将帕尔贴产生的热量导出。

光学检测机构7可以进行4组光路的检测，每个光路具有各自独立的光学检测模块，每组光学检测模块均设有激发光源，激发光源发出的激发光经由激发光滤片、准直镜头、二向色镜和汇聚镜头，通过激发光源照射到卡盒10的核酸检测区2上，激发反应池内的反应体系发出荧光，激发出的荧光再经过激发光源通过汇聚镜头准直进入二向色镜，再经由发射端的汇聚镜头、激发光滤片进入检测器被收集；4个光学检测通道具有不同光谱的激发光源、滤片组以及检测器件，形成各自独立的光路。4组光路并行排列。

采用离心柱法核提的过程：

具体地，反应前将样本加入到样本区10-3中，对该核酸处理区1的蜡阀位置加热，连通封闭的沟道，通过离心运动将样本转移至核酸处理区1中，预封装有裂解结合体系的裂解结合区10-4，通过离心运动进入核酸处理区1中，实现与样本混合反应；

反应后以一定转速快速离心，反应液通过离心柱1-1，使核酸处于离心柱1-1中，通过离心柱的废液进入废液区10-1；

热熔打开清洗液区10-5的蜡阀3，清洗液区10-5通过沟道进入核酸处理区1，快速离心，清洗后的废液进入废液区10-1；

热熔打开洗脱液区10-6的蜡阀3，洗脱液区10-6通过沟道进入核酸处理区1，快速离心，洗脱后的核酸通过离心柱1-1后，处于核酸处理区1的底部，由于洗脱液较少，与废液区10-1连通的沟道处于核酸处理区1的高位，控制离心转速，洗脱下来的核酸不会进入废液区10-1。

打开核酸处理区1与核酸检测区2之间的蜡阀3，反向旋转，则核酸通过连通沟道依次核酸检测区2，多余的核酸进入核酸废液区；核酸分别与3核酸检测区2中预置的扩增体系混合，在温控反应机构6的温度作用下进行pcr反应，在扩增反应过程中，通过卡盒承托机构4与光学检测机构7的协同运行，可实现对核酸检测区2中扩增产物荧光信号的实时检测，至此完成核酸提取与扩增一体化的全过程。

采用磁珠法核提的过程：

预封装有裂解结合体系的裂解结合区10-4，通过离心运动进入核酸处理区1中，实现与样本混合反应。反应过程中可以正反转混匀体系。

反应后以一定转速快速离心，吸附于磁珠表面的核酸被处于磁铁运动轨道1-3中的磁铁1-2磁吸附到核酸处理区1的一侧，废液经由沟道进入废液区10-1；

热熔打开清洗液区10-5的蜡阀3，清洗液区10-5通过沟道进入核酸处理区1，正反转混匀体系，快速离心，清洗后的废液进入废液区10-1；

热熔打开洗脱液区10-6的蜡阀3，洗脱液区10-6通过沟道进入核酸处理区1，一定时间后，洗脱后的核酸处于核酸处理区1的底部，打开蜡阀3，反向旋转，体系中的磁珠被磁铁1-2吸附，核酸则通过沟道依次核酸检测区2，多余的核酸进入核酸废液区；

核酸分别与核酸检测区2中预置的扩增体系混合，在温控反应机构6的温度作用下进行pcr反应，在扩增反应过程中，通过卡盒承托机构4与光学检测机构7的协同运行，可实现对核酸检测区2中扩增产物荧光信号的实时检测，至此完成核酸提取与扩增一体化的全过程。

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，系统操作简单、体积小、自动化程度高；只需手工加入样本，系统便可全自动流程运行，整个过程仪器是无液体操作；无需手动对提取物进行转移，避免交差污染；降低结果假阳性的风险；

将提取的核酸模板直接在同一个卡盒上进行扩增反应，使不同反应卡盒内的反应液体一次性离心进入相关区域，实现自动化操作的同时减少了液体转移的时间；旋转式的方式使卡盒可以依次通过pcr光学检测机构，减少了传统模式的光学机构扫描时间或成像时间。此外该系统特别适用于急诊、中小型医院等非特定的pcr实验室环境，同时对操作人员也无专业要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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