一种降低白酒中氨基甲酸乙酯的解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于白酒酿造与食品安全领域，具体地，涉及一种降低白酒中氨基甲酸乙酯的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

氨基甲酸乙酯(ec)，俗称尿烷，是发酵食品(腐乳、酱油、酸奶等)和酒精饮料(白酒、葡萄酒、啤酒、清酒、黄酒等)在生产和贮存过程中产生的一种天然副产物。因此在日常生活中，发酵食品与酒精饮料是人体直接摄入ec的主要来源。食品添加剂法规委员会(ccfa)指出人体从酒精饮品摄入的ec含量约为通过食物摄入量的近5倍。ec在2007年已被世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)归为2a类致癌物，持续过量摄入对人体健康造成威胁。

随着白酒产业的迅速发展，我国对白酒产品的质量也提出了更高的要求。鉴于ec在酒精饮料中存在的广泛性及其基因毒性和致癌性，世界各国针对酒精饮料中的ec展开了大量研究，并规定了各饮料酒中ec的最高允许水平。我国对酒精饮料中ec的研究起步较晚，目前尚未制定酒精饮料中ec的限量标准，因此中国白酒中的ec问题应当引起高度重视。

目前，国内外都对白酒中氨基甲酸乙酯的控制进行了研究，但大多集中在黄酒、葡萄酒上，对白酒中氨基甲酸乙酯的控制研究较少。仅有的研究主要集中在白酒ec及其前体物质检测方法上的探索，发酵过程中微生物组成的分析以及具有降解ec能力优势菌株的筛选等方面。至今为止，能够应用与实际生产中的控制措施仍然有限。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种降低白酒中氨基甲酸乙酯的解淀粉芽孢杆菌，菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020609，保藏时间为2020.10.20，保藏地点为武汉大学

本发明另一方面提供一种降低白酒中氨基甲酸乙酯的方法，包括在白酒酿造过程中接种本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌的步骤。

进一步地，在入窖发酵前，往曲药中添加体积质量分数为2％～4％的解淀粉芽孢杆菌菌液，混合均匀，与糟醅一起入窖发酵。

更进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌菌液中的菌含量为10⁸-10⁹cfu/ml。

在本发明的一些实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌菌液的制备方法包括以下步骤：

(1)取酒糟与水按1：2的比例充分混匀后，80-100℃蒸煮30-40min，冷却后过滤获得酒糟浸提液；

(2)利用步骤(1)中获得的酒糟浸提液制备的种子培养基培养所述解淀粉芽孢杆菌，获得解淀粉芽孢杆菌种子；

(3)将(2)获得解淀粉芽孢杆菌种子转移至含有步骤(1)中获得的酒糟浸提液的扩大培养基中，制备得到所述解淀粉芽孢杆菌菌液。

进一步地，所述种子培养基的组成为：每1000ml酒糟浸提液中，葡萄糖9g，l-谷氨酸钠3g，蛋白胨4g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g。

进一步地，所述扩大培养基的组成为：体积比为20％的酒糟浸提液，葡萄糖14.0g，l-谷氨酸钠3.0g，蛋白胨8.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，caso42～3mg，mnso46～7mg。

更进一步地，所述方法包括在发酵过程中添加解淀粉芽孢杆菌菌液的步骤。

优选地，分别在发酵15-20天时和25-30天时添加解淀粉芽孢杆菌菌液。

在本发明中，在封窖时，在窖口竖直放入五根玻璃管，之后覆上窖泥，封住玻璃管。在发酵15-20天时和25-30天时，分别通过玻璃管往糟醅里添加所述解淀粉芽孢杆菌液体菌剂。

进一步地，进行陶缸进行贮藏。

更进一步地，在10-15℃进行低温保藏。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

1、本发明提供一种新的解淀粉芽孢杆菌，结合使用方法，可以使得白酒中氨基甲酸乙酯降低40％以上，具有显著的经济和社会价值。

2、本发明利用酿酒过程中的废弃酒糟作为菌株发酵的种子培养基，实现废料利用，减少了生产成本。同时，酒糟中富含解淀粉芽孢杆菌生长的所有营养因子，实现了菌株的自然模拟培养生长。

3、本发明在制备解淀粉芽孢杆菌菌液时，通过在培养基中添加caso4、mnso4提高了菌株的ec降解酶活力，mn²⁺和ca²⁺对菌株产酶的促进效果如表2所示。

4、本发明在白酒发酵期间通过玻璃管向酒醅中添加解淀粉芽孢杆菌菌液，减少翻动窖泥对酒醅发酵中微生物环境的影响，保证发酵环境的平衡。此外，在添加菌液的过程中，促进酒醅热量的散失，在一定程度上降低发酵温度，达到了降低酒醅中氨基甲酸乙酯的效果。

5、本发明在曲药及发酵期少量多次添加解淀粉芽孢杆菌，增强了产ec降解酶效果，明显降低了白酒中的ec含量。同时，采用陶缸低温保藏，也降低了ec含量。

附图说明

图1示出了玻璃管放置示意图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1、产ec降解酶菌株的培养

从白酒酒糟中分离纯化出1株降解ec酶活较强的解淀粉芽孢杆菌菌株j10(bacillusamyloliquefaciensj10)。菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020609，保藏时间为2020.10.20，保藏地点为武汉大学。

取酒糟与水按1:2的比例充分混匀后，80-100℃对其进行蒸煮30-40min，冷却后过滤获得酒糟浸提液。采用种子培养基(葡萄糖9g，l-谷氨酸钠3g，蛋白胨4g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，1000ml酒糟浸提液)培养bacillusamyloliquefaciensj10。

2、制备解淀粉芽孢杆菌菌液

将bacillusamyloliquefaciensj10种子转接至装有250ml高产ec降解酶培养液(酒糟浸提液50ml，葡萄糖14.0g，l-谷氨酸钠3.0g，蛋白胨8.0g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，caso42～3mg，mnso46～7mg)的500ml三角瓶中，32℃培养26h，检测活菌数在10⁸-10⁹cfu/ml。

3、入窖与封窖

入窖发酵前，在曲药中添加体积质量分数为2％～4％bacillusamyloliquefaciensj10菌液(10⁸-10⁹cfu/ml)，与曲药混合均匀，并与糟醅一起入窖发酵。同时，在封窖时，竖直放入五根玻璃管(直径为3～4cm)，之后覆上窖泥，封住玻璃管。玻璃管放置如图1所示。

4、菌剂补充发酵

在糟醅发酵15d～20d时和25d～30d时，分别通过玻璃管往糟醅里添加体积质量分数为2％～4％解淀粉芽孢杆菌液体菌剂，接种浓度为10⁸-10⁹cfu/ml，继续发酵至成熟。

5、使用陶坛室内贮藏白酒，贮藏温度控制在10-15℃。

以常规白酒酿造过程作为对照例1，比较每个酿造阶段浓香型白酒中氨基甲酸乙酯的含量，结果如表1。

表1实验和对照白酒中的ec含量

上述结果可见，添加解淀粉芽孢杆菌菌剂和改变贮藏温度及容器能有效降低浓香型白酒中氨基甲酸乙酯的含量，将贮藏两年的白酒中氨基甲酸乙酯含量从121(μg/l)降低至72(μg/l)，降低了40.49％。

在步骤2中，发明人研究的金属离子对产ec降解酶的影响，结果如表2所示。

表2金属离子对酶活力影响

发明人在确定白酒贮藏的温度和容器(步骤5)时，对比了使用不锈钢和陶坛在不同温度下(4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)贮藏2年的浓香型白酒中ec含量，结果如表3所示，从而确定使用陶坛室内贮藏白酒，贮藏温度控制在10-15℃。

表3贮藏温度和容器对白酒贮藏两年后ec含量的影响

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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