一种巨大芽孢杆菌的制作方法

2021-02-02 18:02:41|

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本发明涉及微生物工程领域，尤其涉及一种巨大芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

bacillusmegaterium(巨大芽孢杆菌)是一类好氧或兼性厌氧，能产生抗逆性芽孢的革兰氏阳性细菌。其名字中的“megaterium”寓意着该类细菌个体较大，被认为是芽孢杆菌属中尺寸最大的细菌。巨大芽孢杆菌具有种类多、遗传稳定性强，耐高温和抗逆性强等特性，具有防治植物病虫害、分泌植物激素和溶解土壤中难溶的含磷化合物等作用，是一类重要的、具有促生功能的资源微生物，在工业、农业和医学等科学领域有着十分广泛的应用前景；

目前，在我国东北黑土区分离纯化获得兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的芽孢杆菌纯菌株比较少，限制了适用于东北黑土区的优质促生芽孢杆菌菌种资源的应用。因此，本发明提出一种巨大芽孢杆菌及其应用，以补充现有促生芽孢杆菌菌种的不足。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌，本发明分离纯化出的巨大芽孢杆菌是一种兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的芽孢杆菌，在促进植物生长和溶解土壤中难溶的含磷化合物方面具有重要的应用。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种巨大芽孢杆菌，该菌株已于2020年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020086，并且在美国国立生物技术信息中心(ncbi，nationalcenterforbiotechnologyinformation)的登录号为：cp054037。

进一步改进在于：所述巨大芽孢杆菌的16srdna序列长度为1430bp，所述巨大芽孢杆菌的核苷酸序列如seqidno:1所示。

进一步改进在于：所述巨大芽孢杆菌在促进植物生长中的应用，该巨大芽孢杆菌兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性。

本发明还提供一种巨大芽孢杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一：菌株分离纯化

取样后对黑土土壤样品进行预处理，得到样品原液，然后将样品原液采用梯度稀释法进行稀释，依次将样品稀释至10^-3；

在超净工作台内进行无菌操作，用振荡器将稀释后的样品原液溶液混匀，吸取200μl加入到1/2na培养基的平板中央，用涂布棒涂匀，每个黑土土壤样品3次重复；

将涂好的平板进行培养，然后选择菌落数在30-300的平板进行菌落计数，然后选取3次重复中菌落数较多的平板，并在平板中挑取形态、菌落大小和颜色特征不同的菌株，在1/2na培养基上进行纯化，每个黑土土壤样品各分离50株，纯化3-4次直至菌斑大小一致后，4℃冰箱保存，得到样品菌株；

步骤二：筛选具有分泌iaa能力的样品菌株

采用改良salkowski比色法测定样品菌株分泌iaa的能力，将样品菌株放置于含40μl无菌水的pcr管中，混匀制取待测定菌悬液，然后将待测定菌悬液加入含100mg·ml^-1色氨酸的na液体培养基离心管中进行培养，3次重复，然后用分光光度计测定od530值，最后利用吸光值线性公式换算各样品菌株的iaa浓度含量；

步骤三：筛选具有解磷能力的样品菌株

将样品菌株接种于以磷酸三钙为磷源的解磷菌筛选培养基上进行培养，然后采用钼锑抗比色法测定供试菌株培养液中水溶性磷含量，确定该菌株解磷能力；

步骤四：筛选具有分泌acc脱氨酶的样品菌株

将样品菌株转接于na液体培养基培养上进行培养，再取包含na液体的样品菌株悬液至df液体培养基中继续进行培养，然后从df液体培养基中取样至adf液体培养基中培养，再将adf液体培养基进行梯度稀释，涂布在adf固体培养基，判断样品菌株能否在adf固体培养基上生长，能正常生长则证明样品菌株具有分泌acc脱氨酶的能力；

步骤五：提取样品菌株的dna

将样品菌株采用ctab/nacl法提取样品菌株的dna，提取后再使用nanodrop测得样品菌株的dna纯度及浓度。

进一步改进在于：所述步骤一中对黑土土壤样品进行预处理，具体为：将黑土土壤样品加入到装有无菌水的三角瓶中，超声波1min后在200rpm转速下振荡45min，然后静置20min，再吸取悬液加入到无菌试管中，于85℃恒温槽中热击50min，得到样品原液。

进一步改进在于：所述步骤一中将涂好的平板进行培养时，将涂好的平板放入28℃的培养箱中培养24h。

进一步改进在于：所述步骤二中具体操作为：采用改良salkowski比色法测定样品菌株分泌iaa的能力，用灭菌牙签挑取样品菌株放置于含40μl无菌水的pcr管中，涡旋混匀制取待测定菌悬液，然后将待测定菌悬液加入1.5ml含100mg·ml^-1色氨酸的na液体培养基离心管中进行培养，每个离心管含1mlna液体培养基，3次重复，对照组为1ml无菌水加入色氨酸na培养基，3次重复，180rpm振荡培养7d，培养后将菌悬液在10000rpm离心10min，取1ml上清液加入2mlsalkowski比色液，避光静置反应35min，用分光光度计测定其od530值，最后利用吸光值线性公式换算各样品菌株的iaa浓度含量。

进一步改进在于：所述步骤三中将样品菌株接种于以磷酸三钙为磷源的解磷菌筛选培养基上进行培养时，需要将筛选培养基倒置于28℃的恒温培养箱中培养10d，然后测量溶磷圈大小。

进一步改进在于：所述步骤四中具体过程为：将样品菌株转接于na液体培养基培养上以200rpm进行培养48h，再取1ml包含na液体的样品菌株悬液至df液体培养基中继续以200rpm进行培养48h，然后从df液体培养基中取样1ml至adf液体培养基中培养48h，再将adf液体培养基进行梯度稀释后取样涂布在adf固体培养基，判断样品菌株能否在adf固体培养基上生长，能正常生长则证明样品菌株具有分泌acc脱氨酶的能力。

进一步改进在于：所述步骤五中提取样品菌株的dna后还包括对样品菌株的dna进行16srdna扩增和全基因组测序。

本发明的有益效果为：本发明分离纯化出的巨大芽孢杆菌是一种兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的芽孢杆菌，该兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的巨大芽孢杆菌在促进植物生长和在溶解土壤中难溶的含磷化合物中具有重要的应用，同时本发明提供的一种巨大芽孢杆菌的分离鉴定方法可以快速准确的分离鉴定出巨大芽孢杆菌菌株及其分泌iaa能力、解磷能力和含有的acc脱氨酶活性，分离鉴定结果科学性和稳定性高，且通过该方法可以鉴定出芽孢杆菌的系统发育关系和分类学地位，可以为构建优质的促生芽孢杆菌菌种资源库和促进农业可持续发展提供理论依据和技术保障。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例提出一种芽孢杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一：菌株分离纯化

取样后对黑土土壤样品进行预处理，具体为：将黑土土壤样品加入到装有无菌水的三角瓶中，超声波1min后在200rpm转速下振荡45min，然后静置20min，再吸取悬液加入到无菌试管中，于85℃恒温槽中热击50min，得到样品原液，然后将样品原液采用梯度稀释法进行稀释，依次将样品稀释至10^-3；

将涂好的平板放入28℃的培养箱中培养24h，然后选择菌落数在30-300的平板进行菌落计数，然后选取3次重复中菌落数较多的平板，并在平板中挑取形态、菌落大小和颜色特征不同的菌株，在1/2na培养基上进行纯化，每个黑土土壤样品各分离50株，纯化3次直至菌斑大小一致后，4℃冰箱保存，得到样品菌株；

步骤二：筛选具有分泌iaa能力的样品菌株

采用改良salkowski比色法测定样品菌株分泌iaa的能力，用灭菌牙签挑取样品菌株放置于含40μl无菌水的pcr管中，涡旋混匀制取待测定菌悬液，然后将待测定菌悬液加入1.5ml含100mg·ml^-1色氨酸的na液体培养基离心管中进行培养，每个离心管含1mlna液体培养基，3次重复，对照组为1ml无菌水加入色氨酸na培养基，3次重复，180rpm振荡培养7d，培养后将菌悬液在10000rpm离心10min，取1ml上清液加入2mlsalkowski比色液，避光静置反应35min，用分光光度计测定其od530值，利用吸光值线性公式换算菌株iaa浓度含量。

步骤三：筛选具有解磷能力的样品菌株

将样品菌株接种于以磷酸三钙为磷源的解磷菌筛选培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养10d，然后测量溶磷圈大小，解磷圈直径为1.7cm，d/d值为1.5，然后采用钼锑抗比色法测定供试菌株培养液中水溶性磷含量，确定该菌株解磷能力；

标准曲线绘制：准确吸取浓度为5mg/l的磷标准溶液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml，然后于50ml容量瓶中，加水稀释至约30ml，再加入2滴二硝基酚指示剂，用100g/l碳酸钠溶液调至刚呈微黄色，再加入5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，即得到含磷量分别0.0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l、0.5mg/l和0.6mg/l的标准溶液。室温15℃以上，放置30min，然后在波长700nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/l)为横坐标，绘制标准曲线；

解磷能力测定：取1ml待测定菌悬液接种至装有50ml液体筛选培养基[用磷矿粉(磷含量105g·kg^-1)代替磷酸三钙]的三角瓶中，同时不接种作为对照组(培养基中加1ml无菌水)，在28℃以160rpm振荡培养3d和6d后于4℃，以10000rpm离心15min，吸取5ml上清液移至50ml容量瓶，稀释至约30ml，加入2滴二硝基酚指示剂，用100g/l碳酸钠溶液调至刚呈微黄色，加入5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容。室温15℃以上，放置30min。在分光光度计700nm波长处，以不接菌溶液的对照组为对比，测量吸光度，然后在标准曲线上查出含磷量，有效磷的含量为扣除对照后的值/mg·l^-1，计算公式如下所示：

p＝k×v/v1

式中：p：有效磷增量；k：从标准曲线查得显色液的磷含量(mg·l^-1)；v：显色时溶液定容的体积(ml)；v1：显色时吸取上清液的体积(ml)；

依据该公式测定出的样品菌株解磷能力为：当培养6d时，样品解磷量达17.17mg·l^-1；

步骤四：筛选具有分泌acc脱氨酶的样品菌株

对样品菌株分泌acc脱氨酶的量进行测定：

标准曲线绘制：用0.1mol/ltris-hcl缓冲液(ph＝8.5)配制100mmα-丁酮酸4℃冰箱保存；配制α-丁酮酸梯度稀释液0.1μmol、0.2μmol、0.3μmol、0.4μmol，每个稀释度各取200μl，每管分别加入300μl的0.2％2,4-二硝基苯肼，混匀后于30℃水浴30min，加入2ml2mol/l的naoh溶液显色，测定od540值，以α-丁酮酸浓度(mmol/l)为横坐标，od540值为纵坐标制作标准曲线。

将供试菌株在na培养液中培养，30℃，200rpm培养24h，然后4℃，8000g离心10min，收集菌体沉淀；

将菌体沉淀用df液体培养基(不含硝酸铵)洗涤两次，重新悬浮于adf液体培养基，室温振荡培养24h(诱导产生acc脱氨酶)后，4℃，8000g离心10min，收集菌体；

用ph＝7.6的0.1mol/ltris-hcl缓冲液洗涤两次后，重新悬浮于600μlph＝8.5的0.1mol/ltris-hcl缓冲液中，再加入30μl甲苯迅速震荡30s使细胞破碎；

转移200μl含甲苯的细胞提取物，加300μl2,4-二硝基苯肼，30℃水浴30min，加入2ml2mol/lnaoh，使用分光光度计测od540值，代入标准曲线计算对应α-丁酮酸含量；

采用考马斯亮蓝g-250法^[112]测定菌悬液中总蛋白质含量，以牛血清白蛋白(bsa)为对照，绘制标准曲线。acc脱氨酶比活力计算公式如下所示：

3次重复后求平均值，测得样品菌株的acc脱氨酶活性为0.091u/mg；

步骤五：提取样品菌株的dna

将样品菌株采用ctab/nacl法提取样品菌株的dna，提取后再使用nanodrop测得样品菌株的dna纯度及浓度。

样品菌株的dna进行16srdna扩增：

采用细菌通用引物(引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成扩增dna片断，长度约1.5kb)，如下所示：

上游引物27f(5-agagtttgatcctggctcag-3′)

下游引物1492r(5492ragtttgatcctggctca)

反应体系如下所示：

反应程序如下所示：

然后对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1％电泳胶)，在凝胶成像系统下观察拍照存档。将pcr产物送至测序公司(华大基因)测序。

在16srdna测序基础上，进一步对样品菌株进行了全基因组pacbio测序，以便更准确的核实该菌的分类地位和生态功能：

首先对菌株基因组进行dna提取与质检，利用1％琼脂糖凝胶电泳和qubit对基因组dna进行质检，将质检合格的基因组dna样品用covarisg-tube打断成构建文库所需大小的目的片段，经dna损伤修复及末端修复后，使用dna黏合酶将发卡型接头连接在dna片段两端，使用ampurepb磁珠对dna片段进行纯化选择，构建smrtbell文库。纯化后的片段经buffer回溶后，使用bluepipin片段筛选特定大小的片段，并使用ampurepb磁珠对dna片段进行纯化。构建好的文库经qubit浓度定量，并利用agilent2100检测插入片段大小，随后用pacbio平台进行测序。下机数据首先经过质控得到合理数据，然后进行后续生物信息学分析，包括对下机数据进行数据量及长度评估，对于通过评估的数据集进行多方案组装，选取其中最优的组装结果进行环化处理并查找开环点；基于经过环化处理的基金组进行基因组组分分析和数据库注释。

测序结果表明，菌株基因组大小为5,147,837bp，g+c含量为38.2％，基因组不含有质粒。选用多种计算方法针对基因组的进一步分析表明，菌株与bacillusmegateriumnbrc15308(t)、bacillusaryabhattaib8w22(t)和bacillusflexusnbrc15715(t)的相似性分别达到99.8％、99.66％和98.78％，因此确定该菌株隶属于bacillusmegaterium(巨大芽孢杆菌)。与功能数据库比对结果显示，该菌基因组中含有参与蛋白质代谢(246个基因)、氨基酸和衍生物(389个基因)、碳水化合物(359个基因)和dna代谢(74个基因)等过程的基因序列。

所述巨大芽孢杆菌的菌种在美国国立生物技术信息中心(ncbi，nationalcenterforbiotechnologyinformation)的登录号为：cp054037

所述巨大芽孢杆菌由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2020086，保藏日期为2020年4月27日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明分离纯化出的巨大芽孢杆菌是一种兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的芽孢杆菌，该兼具分泌iaa能力、解磷能力和acc脱氨酶活性的巨大芽孢杆菌在促进植物生长和在溶解土壤中难溶的含磷化合物中具有重要的应用，可以为构建优质的芽孢杆菌菌种资源库和农业可持续发展提供理论依据和技术保障。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一种巨大芽孢杆菌

<130>pat010

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1430

<212>dna

<213>巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)

<400>1

ttaggcggctagctccttacggttactccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggt60