一种杀菌-释放双重功能的抗菌表面及其制备方法与流程

本发明涉及抗菌表面技术领域，具体涉及一种杀菌-释放双重功能的抗菌表面及其制备方法。

背景技术：

细菌附着和繁殖所造成的组织感染、设备故障是生物医学应用领域长期存在的问题，严重威胁着人类的生命健康。通过构建抗菌表面预防或减少材料表面生物污染具有重要的社会和经济意义。

目前抗菌方式主要有二种，分别是主动杀菌表面和被动抗菌表面，但是单功能抗菌表面都有自身无法克服的缺陷，如主动杀菌表面使用一些天然的或者合成的杀菌剂，但是一旦死菌黏附在表面后，杀菌表面就会逐渐失去杀菌性能，甚至形成生物膜导致表面的污染。而被动的抗菌表面则是利用一些亲水性的或者两性离子聚合物，在表面形成一层水合层来阻止细菌的黏附，但是由于没有杀菌性能，一旦细菌黏附则会逐渐形成生物膜影响表面的性能。因此抗菌表面逐渐由单功能向多功能发展。

cn105749334a公开了一种新型抗菌纳米银温敏水凝胶及其制备方法，采用壳聚糖80～90份、硝酸银0.03～0.08份、冰醋酸溶液25～34份、甘油磷酸钠12～16份、磷酸氢二钠适量反应制得，该水凝胶抑菌作用持久、透气性和吸湿性良好。

cn109232834a公开了一种具有抗污-杀菌-释放三重功能的抗菌聚合物刷的制备方法，将将活性自由基引发剂接枝在基底材料表面；再与刺激响应型单体进行聚合反应，得到响应型聚合物刷；将响应型聚合物刷与亲水性单体进行聚合反应，得到的亲水响应型聚合物刷接枝三氯生抗菌剂或负载银纳米颗粒，得到所述的抗菌聚合物刷。该方法能够赋予抗菌表面长效抗污、高效杀菌以及细菌释放的多重功能。但采用的是原子转移自由基聚合的方法，该方法对反应条件要求严格，需要引发剂、配体的存在，要求无氧环境，这对工业化方法是一种挑战。

因此要获得多功能抗菌涂层的同时，还需简化制备方法，得到能够长效抗菌、释放的智能抗菌表面。

技术实现要素：

本发明旨在结合这两种抗菌表面的功能，制备一种“杀菌-释放”智能抗菌表面，该表面由于金属离子的存在，使得细菌在接触表面的时候被杀死，而响应性微凝胶球可以在外界条件刺激下改变自己的形态构象，使得表面细菌被释放，从而达到表面清洁的作用，此外邻苯二酚的作用下可以黏附各种基底，使得应用更加广泛。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种杀菌-释放双重功能的抗菌表面的制备方法，包括如下步骤：

(1)自由基聚合制备响应性功能的微凝胶球；

(2)将步骤(1)制备的微凝胶球、邻苯二酚类衍生物和金属杀菌剂共沉积于基底，得到所述的杀菌-释放双重功能的抗菌表面。

所述响应性功能的微凝胶球包括温度响应性微凝胶球、ph响应性微凝胶球或盐响应性微凝胶球。

优选地，步骤(1)中，制备响应性功能的微凝胶球的响应性单体为n-异丙基丙烯酰胺(nipam)、n-乙烯基己内酰胺(vcl)、n,n-二乙基丙烯酰胺(deaam)、n-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam)、甲基丙烯酸(maa)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(dmaema)、3-(二甲基(4-乙烯基苄基铵)丙基磺酸盐(dvbaps)、3-(1-(4-乙烯基苄基)-1h-咪唑-3-鎓)丙烷-1-磺酸盐(vbips)中一种或多种。

步骤(1)中自由基聚合的反应温度为50^～70℃，反应时间为5～7h。

步骤(1)中自由基聚合还包括交联剂和催化剂，所述交联剂包括n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)、二乙烯基苯、二异氰酸酯中一种或多种，交联剂的质量为响应性单体原料总质量的1～5％。

所述催化剂包括过硫酸钾、过硫酸铵，催化剂的质量为响应性单体原料总质量的1～5％。

步骤(1)中，所述微凝胶球的制备过程还包括反应结束后采用透析去除小分子杂质，提高微凝胶球的质量。

所述邻苯二酚类衍生物包括多巴胺盐酸、单宁酸、儿茶酚、邻甲氧基酚或2-甲氧基-4-甲基苯酚。邻苯二酚类衍生物具有粘度多种通用基底的作用，且通过共沉积的方法能够简单方便对多种基底实现功能化。

所述金属杀菌剂为银盐、铜盐、锌盐中一种或多种。所述银盐包括硝酸银或氯化银，所述铜盐包括硝酸铜或氯化铜，所述锌盐包括硝酸锌或氯化锌。

优选地，所述邻苯二酚类衍生物为多巴胺盐酸，所述金属杀菌剂为硝酸银。多巴胺盐酸的价格低廉，工业化可能性高，而银离子有着优异的杀菌性能。

步骤(2)中，加入有缓冲液，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、有机酸缓冲液、硼酸盐缓冲液或氨基酸缓冲液，使溶液的ph控制在7～9之间。

步骤(2)中，微凝胶球的质量浓度为1～5mg/ml，金属杀菌剂的质量浓度0.6～1.2mg/ml，邻苯二酚类衍生物的质量浓度为1～4mg/ml。

步骤(2)中，共沉积时间为6～12h，沉积温度15～30℃。

步骤(2)中，所述微凝胶球、邻苯二酚类衍生物、金属杀菌剂的质量比为(0.8～1.2):2:(0.8～1.2)。若微凝胶球含量过低则会导致细菌释放率下降，而含量过高则会细菌释放不会变化，还会影响杀菌效果。

邻苯二酚类衍生物含量过低则无法让微凝胶球黏附更好，过高则会包埋微凝胶球使得细菌释放率下降，同理若金属杀菌剂含量过低则会导致杀菌率下降，过高则会导致其材料浪费，三者在该比例下，能够得到杀菌效果、响应效果和与基底的贴附性最好的抗菌表面。

本发明的方法可在任意基底制备杀菌-释放双重功能抗菌表面，包括玻璃、塑料或金属等多种。

本发明提供的杀菌-释放双重功能抗菌表面的制备方法。该方法先采用分散聚合或者是沉淀聚合形成刺激响应性微凝胶球，通过邻苯二酚类衍生物与金属杀菌剂一起共沉积在基底上，形成“杀菌-释放”多功能抗菌表面。该表面由于金属离子的存在，使得细菌在接触表面的时候被杀死，而响应性微凝胶球可以在外界条件刺激下改变自己的形态构象，使得表面细菌被释放，从而达到表面清洁的作用，此外邻苯二酚的作用下可以黏附各种基底，使得应用更加广泛。

本发明还提供一种根据所述的制备方法得到的杀菌-释放双重功能抗菌表面。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用刺激响应微微凝胶球通过外界刺激的变化来微凝胶球体积等变化来达到对死菌的释放性能，实现表面的清洁功能。

(2)本发明通过邻苯二酚类与金属离子以及刺激响应性微凝胶球共沉积，得到高杀菌率及其高释放率的性能，且该方法制备方法简单，应用广泛。

附图说明

图1为实施例2的杀菌-盐响应释放功能抗菌表面杀菌-释放过程示意图。

图2为实施例1的抗菌表面在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌下温度响应的细菌荧光图，其中a)为大肠杆菌，b)为金黄色葡萄球菌。

图3为实施例1、6-10的抗菌表面不同银离子浓度对表面杀菌的杀菌率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1

将1.0gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)加入到250ml圆底烧瓶内，用100ml去离子水搅拌溶解，并加入0.05gn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)和0.05g过硫酸钾(kps)，鼓n230分钟并以400转速度搅拌，整个过程在冰水浴中进行。随后将水浴温度升至75℃，反应5小时，结束反应后在去离子水中透析3天，去除一些小分子杂质，最后冷冻干燥得到白色固体粉末的微凝胶球。

取30mg的nipam微凝胶球的粉末加到表面皿中，再加入60mg多巴胺盐酸粉末和30mg的硝酸银粉末，最后加入30mltris-hcl缓冲液溶液并搅拌，最后加入一些小玻璃片作为基底，在黑暗环境中共沉积12小时。反应结束后，所得功能表面用去离子水冲洗多次，并用氮气吹干，最终得到所需杀菌-温度响应释放的功能抗菌表面。

实施例2

将1.0g3-(二甲基(4-乙烯基苄基铵)丙基磺酸盐(dvbaps)加入到250ml圆底烧瓶内，用100ml去离子水搅拌溶解，并加入0.05gn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)和0.05g过硫酸钾(kps)，鼓n230分钟并以400转速度搅拌，整个过程在冰水浴中进行。随后将水浴温度升至50℃，反应24小时，结束反应后在去离子水中透析3天，去除一些小分子杂质，最后冷冻干燥得到白色固体粉末。

取30mg的dvbaps微凝胶球的粉末加到表面皿中，再加入60mg多巴胺盐酸粉末和30mg的硝酸银粉末，最后加入30mltris-hcl缓冲液溶液并搅拌，最后加入一些小玻璃片作为基底，在黑暗环境中共沉积12小时。反应结束后，所得功能表面用去离子水冲洗多次，并用氮气吹干，最终得到具有杀菌-盐响应释放的功能抗菌表面。

杀菌-盐响应释放的功能抗菌表面实现杀菌-释放过程如图1所示，在常态下，细菌贴附与抗菌表面，被银离子杀死，成为死菌贴附在抗菌表面；加入氯化钠促使抗菌表面盐响应，释放清除表面细菌，从而实现杀菌-释放的双功能，提高抗菌表面的长期抗菌性。

实施例3

将2.0g甲基丙烯酸(maa)和0.4g聚乙烯吡咯烷酮加入到250ml圆底烧瓶内，用100ml去离子水搅拌溶解，并加入0.05gn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)和0.05g过硫酸钾(kps)，鼓n230分钟并以400转速度搅拌，整个过程在冰水浴中进行。随后将水浴温度升至50℃，反应24小时，结束反应后在去离子水中透析3天，去除一些小分子杂质，最后冷冻干燥得到白色固体粉末。

取30mg的微凝胶球的粉末加到表面皿中，再加入60mg多巴胺盐酸粉末和30mg的硝酸银粉末，最后加入30mltris-hcl缓冲液溶液并搅拌，最后加入一些小玻璃片，在黑暗环境中共沉积12小时。反应结束后，所得功能表面用去离子水冲洗多次，并用氮气吹干，最终得到具有杀菌-ph响应释放的功能抗菌表面。

实施例4

将1.0gn-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam)加入到250ml圆底烧瓶内，用100ml去离子水搅拌溶解，并加入0.05gn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)和0.05g过硫酸钾(kps)，鼓n230分钟并以400转速度搅拌，整个过程在冰水浴中进行。随后将水浴温度升至75℃，反应5小时，结束反应后在去离子水中透析3天，去除一些小分子杂质，最后冷冻干燥得到白色固体粉末。

取30mg的nipmam微凝胶球的粉末加到表面皿中，再加入60mg多巴胺盐酸粉末和30mg的硝酸银粉末，最后加入30mltris-hcl缓冲液溶液并搅拌，最后加入一些小玻璃片，在黑暗环境中共沉积12小时。反应结束后，所得功能表面用去离子水冲洗多次，并用氮气吹干，最终得到所需杀菌-温度响应释放的功能抗菌表面。

实施例5

将0.8gn,n-二乙基丙烯酰胺(deaam)加入到250ml圆底烧瓶内，用100ml去离子水搅拌溶解，并加入0.05gn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)和0.05g过硫酸钾(kps)，鼓n230分钟并以400转速度搅拌，整个过程在冰水浴中进行。随后将水浴温度升至75℃，反应5小时，结束反应后在去离子水中透析3天，去除一些小分子杂质，最后冷冻干燥得到白色固体粉末。

取30mg的deaam微凝胶球的粉末加到表面皿中，再加入60mg多巴胺盐酸粉末和30mg的硝酸银粉末，最后加入30mltris-hcl缓冲液溶液并搅拌，最后加入一些小玻璃片基底，在黑暗环境中共沉积12小时。反应结束后，所得功能表面用去离子水冲洗多次，并用氮气吹干，最终得到所需杀菌和温度响应释放的功能抗菌表面。

实施例6～10

在实施例1的基础上改变硝酸银的含量，分别加入0mg、6mg、12mg、18mg、24mg的硝酸银，配成0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml和0.8mg/ml不同浓度的硝酸银来体现其不同的杀菌率。

性能测试

采用大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)测试聚合物表面的防污，杀菌和再生性能。两种细菌首先在37℃的luria-bertani(lb)琼脂培养基上孵育过夜，然后将平板上的细菌菌落接种到40mllb培养基中，并在37℃振摇10h。将细菌溶液用纯lb稀释至od值分别对大肠杆菌为0.1和对金黄色葡萄球菌为0.05的稀菌液。为了进行抗菌测定，基底用75％的乙醇溶液灭菌，并用pbs冲洗，然后将其放入12孔无菌板中。随后，将3ml细菌悬浮液添加至孔中，并在100rpm转速下于37℃下培养预定时间(对于大肠杆菌为24h，对于金黄色葡萄球菌为12h)。培养结束后，将样品分为两部分。将用于测试释放特性的样品放入1mnacl溶液中并轻轻振摇10分钟，然后将所有样品用无菌pbs洗涤3次并使用live/deadbacklightviabilitykit(thermofisherscientificinc.)在黑暗中放置15分钟，用无菌pbs冲洗，然后使用axioobservera1型倒置荧光显微镜进行观察。

温度响应释放性能：对实施例1制备的杀菌-温度响应释放功能抗菌表面进行温度响应测试，观察基底表面在不同温度(4℃和40℃)下的细菌密度，结果如图2所示，发现基体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的温度响应，达到良好的细菌释放性能。

杀菌性能：将实施例1，6～10制备的不同硝酸银浓度的功能化的基底进行测试杀菌性能，先把基底浸泡用75％的乙醇溶液灭菌，随后用无菌pbs洗涤3次并使用live/deadbacklightviabilitykit(thermofisherscientificinc.)在黑暗中放置15分钟，用无菌pbs冲洗，然后使用axioobservera1型倒置荧光显微镜进行观察，计算杀菌率，结果如图3所示。

从图3可见，随着硝酸银浓度增加，杀菌效果逐渐提高，但后期杀菌效果提升不再明显，硝酸银的浓度在0.6mg/ml以上，对大肠杆菌的杀菌率在60％以上，金黄色葡萄球菌的杀菌率在35％以上，效果良好，因此应当控制硝酸银的浓度在0.6mg/ml以上。同时过高的浓度会影响微凝胶球的响应灵敏度，因此硝酸银的浓度也不易过高。

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