丙酸杆菌科产酶新物种及其应用的制作方法

2021-02-02 18:02:01|

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本发明属于微生物技术领域，具体涉及丙酸杆菌科产酶新物种及其应用。

背景技术：

丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)属于细菌域(bacteria)-放线菌门(actinobacteria)-放线菌纲(actinomycetia)-丙酸杆菌目(propionibacteriales)。该科是e.a.德尔维奇于1957年建立的，目前包括23个有效描述属，其中包括auraticoccus、brooklawnia、granulicoccus、micropruina、nigerium、propionicicella、propioniciclava、propioniferax、propionimicrobium、raineyella等10个属只有1个有效描述种，aestuariimicrobium、brevilactibacter、desertihabitans、mariniluteicoccus、propionicimonas等5个属只有2个有效描述种。说明该科的属间多样性比较高。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，是重要的水解碳水化合物酶；脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，二者都是重要的工业酶制剂品种，广泛应用于环保、饲料、日化等行业。氨氮能够消耗大量的水体中溶解氧，造成水体缺氧，同时也可能引起水体富营养化。传统的硝化细菌为自养菌，所要求的生长环境严格，生长速度慢，难于大量培养，造成应用受到限制。异养硝化细菌能够直接利用水体中有机质营养进行生长的同时降解氨氮，适应性强，生长速度快，可同时去除cod和氨氮。传统意义上认为反硝化是在厌氧下进行，而一些异养硝化菌却能够进行好氧反硝化，这对氮素污染物的去除具有巨大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供丙酸杆菌科产酶新物种及其应用。

第一方面，本发明保护一株丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium99b。

本发明保护的丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium99b的分类命名为olearicoccumamyloliquefacium，该菌株已于2020年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.20523。

第二方面，本发明保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。

本发明保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在生产或制备淀粉酶中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备生产或制备淀粉酶的产品中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在生产或制备脂肪酶中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备生产或制备脂肪酶的产品中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在异养硝化和/或好氧反硝化中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备异养硝化和/或好氧反硝化的产品中的应用。

所述异养硝化是指异养微生物将氨氮氧化为硝酸氮、亚硝酸氮的过程。

所述好氧反硝化是指在有氧条件下微生物将硝酸氮、亚硝酸氮还原成含氮气体(no、n2o、n2)的过程。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在降解氨氮中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备降解氨氮的产品中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在去除氮素污染物或餐厨垃圾处理或污水处理中的应用。

本发明还保护丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备去除氮素污染物或餐厨垃圾处理或污水处理的产品中的应用。

第三方面，本发明保护一种淀粉酶或脂肪酶。

本发明保护的淀粉酶或脂肪酶是将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium发酵培养后得到的。

进一步的，所述发酵培养的方法包括如下步骤：将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium接种至lb液体培养基中进行发酵培养。

更进一步的，所述发酵培养的条件为30℃、150rpm振荡培养24h。

所述淀粉酶可作用底物包括可溶性淀粉。

所述脂肪酶可作用底物包括脂肪源(脂肪源是将2％的聚乙烯醇溶液与三丁酸甘油酯按照体积比为1:9的比例混合而成)。

第四方面，本发明保护一种产品，其活性成分为丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；

所述产品具有如下1)-5)中任一种功能：

1)生产或制备淀粉酶；

2)生产或制备脂肪酶；

3)异养硝化和/或好氧反硝化；

4)降解氨氮；

5)去除氮素污染物或餐厨垃圾处理或污水处理。

第五方面，本发明保护如下a1)-a4)任一种方法：

a1)一种生产或制备淀粉酶的方法，包括将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium进行发酵培养的步骤；

a2)一种生产或制备脂肪酶的方法，包括将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium进行发酵培养的步骤；

a3)一种降解氨氮的方法，包括用丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂处理氨氮的步骤；

a4)一种去除氮素污染物或餐厨垃圾处理或污水处理的方法，包括用丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂处理氮素污染物或餐厨垃圾或污水的步骤。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述培养液的制备方法具体如下：将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium接种在lb液体培养基中进行发酵培养。进一步的，所述发酵培养条件具体为：30℃、150rpm振荡培养24h。

所述菌悬液的制备方法具体如下：将丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium接种在lb液体培养基中进行发酵培养，得到培养液；将所述培养液离心，收集菌体；用无菌水重悬所述菌体，得到菌悬液。进一步的，所述发酵培养的条件具体为30℃、150rpm振荡培养24h。所述离心的条件具体为4℃、8000rpm条件下离心5min。所述用无菌水重悬所述菌体为用等体积无菌水重悬所述菌体。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium为丙酸杆菌科olearicoccumamyloliquefacium99bcgmccno.20523。

本发明提供了一种丙酸杆菌科产酶新物种及其应用，该丙酸杆菌科产酶新物种的菌株名称为99b，已于2020年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20523。通过实验证明：99bcgmccno.20523菌株能够产淀粉酶和脂肪酶，能够同步异养硝化-好氧反硝化，是一株功能性的丙酸杆菌科新物种，在餐厨垃圾处理、菌肥制剂、污水处理等方面将具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为99b系统发育树。

保藏说明

拉丁名：olearicoccumamyloliquefacium

菌株编号：99b

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年8月11日

保藏中心登记入册编号：cgmccno.20523

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、99b菌株的分离、鉴定与保藏

一、99b菌株的分离

99b菌株于2020年6月分离自河北廊坊的油井采出液。具体步骤如下：将采出液用无菌生理盐水稀释后涂布在lb固体培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为10g/lnacl、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、15g/l琼脂，ph7-8)上，30℃静置培养，待长出单菌落后挑取单菌落进行划线纯化直至获得纯菌菌株，并将其命名为99b菌株。

二、99b菌株的鉴定

1、形态鉴定

99b菌株在lb固体培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为10g/lnacl、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、15g/l琼脂，ph7-8)上形成圆形规则凸起暗黄色菌落。菌体革兰氏染色为阴性、球状，产芽孢。

2、生理生化鉴定

99b菌株能够在0-8％(质量分数)氯化钠条件下生长，其中1-5％(质量分数)氯化钠条件下最适生长，8％(质量分数)氯化钠条件下生长较弱。

3、分子鉴定

将活化的99b菌株接种在lb液体培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为10g/lnacl、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8)中，30℃、150rpm振荡培养24h后取1ml新鲜培养菌液在4℃、8000rpm条件下离心5min，收集菌体于2ml离心管中，采用dna提取试剂盒提取dna。电泳检测后，采用通用引物8f/1492r进行pcr扩增。pcr产物电泳检测后，测定16srdna基因序列，具体序列如序列表中序列1所示。

使用ncbi数据库经过序列比对后发现99b菌株属于丙酸杆菌科，但和已有菌株的相似性很低。基于16srdna基因序列使用软件mega构建系统发育树，结果如图1所示。99b菌株与发育树最接近的菌株aestuariimicrobiumkwangyangense和aestuariimicrobiumsoli的相似性分别只有94.74％和94.67％，均低于95％。

使用ezbiocloud数据库比对结果如表1所示，与丙酸杆菌科其它属最相似的菌株luteococcusperitonei的相似性为95.22％、菌株microlunatuslucidus的相似性为94.81％、菌株brooklawniacerclae的相似性为94.30％、菌株tessaracoccusflavescens的相似性为94.16％、菌株naumannellahuperziae的相似性为93.57％、菌株mariniluteicoccusflavus的相似性为93.56％。同时丙酸杆菌科目前23个有效描述属中10个属只有1个有效描述种，5个属只有2个有效描述种，说明该科的属间多样性比较高。因此综上表明：99b菌株是一种新发现的属于丙酸杆菌科的新属菌株。

表1、ezbiocloud数据库比对结果

三、99b菌株的保藏

99b菌株的分类命名为olearicoccumamyloliquefacium，该菌株已于2020年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.20523。

实施例2、99bcgmccno.20523菌株的淀粉酶活性检测

1、在lb液体培养基中加入0.2％(质量分数)可溶性淀粉和1.5％(质量分数)琼脂，灭菌后倒固体平板，得到淀粉固体培养基。

2、将实施例1中活化的99bcgmccno.20523菌株接种在lb液体培养基(10g/l氯化钠、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8)中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到99b菌液。同时以与99bcgmccno.20523菌株发育树最接近的aestuariimicrobiumkwangyangense菌株和aestuariimicrobiumsoli菌株作为对照。

3、取5μl步骤2获得的新鲜99b菌液点接在淀粉固体培养基上，30℃静置培养48h，加卢氏典液显色。

结果显示：99bcgmccno.20523菌落周围出现明显的透明圈，透明圈与菌落的圈径比为21/6＝3.5，说明99bcgmccno.20523菌株具有较好的淀粉酶活性。而与99bcgmccno.20523菌株发育树最接近的aestuariimicrobiumkwangyangense菌株和aestuariimicrobiumsoli菌株均没有淀粉酶活性，进一步说明99bcgmccno.20523菌株是属于丙酸杆菌科的新属菌株。

实施例3、99bcgmccno.20523菌株的脂肪酶活性检测

1、在lb液体培养基中加入2％(质量分数)脂肪源(脂肪源是将2％的聚乙烯醇溶液与三丁酸甘油酯按照体积比为1:9的比例混合而成)和1.5％(质量分数)琼脂，灭菌后倒固体平板，得到脂肪固体培养基。

2、将实施例1活化的99bcgmccno.20523菌株接种在lb液体培养基(10g/l氯化钠、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8)中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到99b菌液。

3、取5μl步骤2获得的新鲜的99b菌液点接在脂肪固体培养基上，30℃静置培养48h。

结果显示：99bcgmccno.20523菌落周围出现明显的透明圈，透明圈与菌落的圈径比为22/7＝3.14，说明99bcgmccno.20523菌株具有较好的脂肪酶活性。

实施例4、99bcgmccno.20523菌株的同步异养硝化-好氧反硝化功能检测

1、将实施例1活化的99bcgmccno.20523菌株接种在lb液体培养基(10g/l氯化钠、10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉，ph7-8)中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到99b菌液。

2、取步骤1获得的新鲜的99b菌液在4℃、8000rpm条件下离心5min，收集菌体，然后用等体积的无菌水悬浮，制成99b菌悬液。

3、按1％(v/v)将步骤2获得的99b菌悬液接种在好氧反硝化液体培养基(溶剂为水，溶剂及其浓度分别为葡萄糖2g/l、乙酸钠1.25g/l、氯化钠0.25g/l、七水硫酸镁0.15g/l、三水磷酸氢二钾0.35g/l、硝酸钠0.3g/l)中，并将未接菌的培养基作为对照组，30℃、150rpm振荡培养7d，得到接菌培养液。

使用格里斯氏(griess)试剂(购买自上海瑞楚生物科技有限公司)检测接菌培养液，结果表明接菌培养液中出现亚硝酸盐氮，而对照组未出现亚硝酸盐氮，说明硝酸盐氮有被99bcgmccno.20523还原成亚硝酸氮。根据标准hj636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定接菌培养液和未接菌对照的总氮浓度，按总氮降解率＝{(未接菌对照总氮浓度-接菌培养液总氮浓度)/未接菌对照总氮浓度}×100％，计算总氮降解率。

结果表明：99bcgmccno.20523菌株的总氮降解率为44.12％。99bcgmccno.20523菌株具有好氧反硝化功能。

4、按1％(v/v)将步骤2获得的99b菌悬液接种在异养硝化液体培养基(溶剂为水，溶剂及其浓度分别为葡萄糖2g/l、乙酸钠1.25g/l、氯化钠0.25g/l、七水硫酸镁0.15g/l、三水磷酸氢二钾0.35g/l、氯化铵0.18g/l)中，并将未接菌的培养基作为对照，30℃、150rpm振荡培养7d，得到接菌培养液。

使用格里斯氏(griess)试剂(购买自上海瑞楚生物科技有限公司)检测接菌培养液，结果表明：接菌培养液中出现亚硝酸盐氮，而对照组未出现亚硝酸盐氮，说明氨氮有被99bcgmccno.20523氧化成亚硝酸氮。根据标准hj535-2009水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法测定接菌培养液和未接菌对照的氨氮浓度，按氨氮降解率＝{(未接菌对照氨氮浓度-接菌培养液氨氮浓度)/未接菌对照氨氮浓度}×100％，计算氨氮降解率。结果表明：99bcgmccno.20523菌株的氨氮降解率为59.14％。99bcgmccno.20523菌株具有异养硝化功能，可将氨氮氧化为亚硝酸氮等。

同时进一步测定接菌培养液和未接菌对照的总氮浓度，按总氮降解率＝{(不接菌对照总氮浓度-接菌培养液总氮浓度)/不接菌对照总氮浓度}×100％，计算总氮降解率。结果表明：99bcgmccno.20523菌株的总氮降解率为36.73％。

综上所述，本发明的99bcgmccno.20523菌株是异养硝化-好氧反硝化菌，能够进行异养硝化，同时又可以在氧气存在的条件下进行反硝化，有同步异养硝化-好氧反硝化功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>微米环创生物科技（北京）有限公司

<120>丙酸杆菌科产酶新物种及其应用

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