一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法与流程

本发明属于生物技术模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法。

背景技术：

细胞死亡是哺乳动物的发育、内环境稳态的维持以及疾病发生的重要环节之一。铁死亡(ferroptosis)是细胞死亡的一种方式，在细胞水平，和小鼠的水平已经研究较多。铁死亡是在谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4，gpx4)调控下铁依赖性细胞程序性死亡。2014年细胞死亡命名委员会正式命名，铁死亡有以下4点特征：细胞死亡与铁水平增加有因果关系，铁死亡过程需有铁的参与；脂质过氧化物增加和nadph减少；线粒体有特殊形态改变；可被亲脂抗氧化剂和铁螯合剂逆转。铁死亡与多种病理性细胞死亡相关，例如一些退行性病例改变就是由于修复过氧化脂质的能力下降导致的细胞死亡；铁死亡可能具有肿瘤抑制功能，它可以去除无法获取关键营养因子或受感染以及因环境改变损伤的细胞。

斑马鱼是一种热带鲤科鱼，目前被广泛应用于新药筛选中。这是因为斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因相似度高达87％，器官病变过程又与人类极为接近。同时，斑马鱼胚胎发育是全透明的，加上适当的色素抑制处理，可以清晰地观察病变过程，并且斑马鱼体型小、实验周期短，且维护费用低廉，非常适合于高通量实验。然而斑马鱼作为生物医学研究的第三大模式生物，还没有关于铁死亡的应用技术和方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足之处，本发明目的在于提供一种成本低、见效快、模型性能稳定，适用性广的斑马鱼铁死亡模型构建方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法，包括以下步骤：

1)斑马鱼的繁殖：将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；收集到的鱼卵置于含e3的培养皿中，挑选受精鱼卵，将受精鱼卵按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，28℃恒温孵育5小时；

2)铁死亡模型的构建：挑选步骤1)中孵育正常的斑马鱼，按10-20条/孔的密度分布于6孔板中，加入e3培养液，28℃恒温孵育24h；除去e3培养液，将6孔板中的受精卵随机分为dmso阴性对照组、erastin处理组和枸橼酸铁铵(fac)处理组，分别向其中加入dmso、erastin溶液和fac溶液，恒温培养48h；

3)铁死亡模型的验证：使用台盼蓝对步骤2)中dmso阴性对照组、erastin处理组和fac处理组的斑马鱼进行活体染色，检测到细胞死亡现象，即得到斑马鱼铁死亡模型。

进一步地，所述erastin溶液的浓度为20μmol/l，fac溶液的浓度为200μg/ml。

进一步地，所述步骤2)中，恒温培养的条件为28℃、避光处理。

本发明的有益效果是：斑马鱼作为生物医学的模型，在铁死亡领域一直未见任何报道，也未有确定在斑马鱼体内定义铁死亡的方法。本发明首次使用斑马鱼来定义和研究铁死亡现象，利用铁死亡诱导剂处理斑马鱼幼鱼，然后利用台盼蓝染色来定义死亡细胞。本发明发现，铁死亡诱导剂都能明显地增加斑马鱼体内的ros产生，诱使细胞死亡数目明显增加，改变了铁死亡相关基因的表达。具有便利、快捷、成功率高，易重复等优点，能够实现铁死亡在个体水平的定性和定量，使斑马鱼能够成为便利的模型来研究铁死亡现象，以及铁死亡相关的癌症、血管、骨质疏松、代谢以及其他人类疾病的模型，也能为高通量筛选铁死亡相关的药物提供模型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本案中dmso阴性对照组、erastin处理组和fac处理组的斑马鱼活体染色后ros产生示意图。

图2是本案中dmso阴性对照组、erastin处理组和fac处理组的斑马鱼活体染色后铁死亡结果示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1：斑马鱼的繁殖

将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；收集到的鱼卵置于含e3的培养皿中，去除未受精卵，将受精鱼卵按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，28℃恒温孵育5小时。

实施例2：铁死亡模型的构建

挑选实施例1中孵育正常的斑马鱼，按10-20条/孔的密度分布于6孔板中，加入e3培养液，28℃恒温孵育24h；除去e3培养液，将6孔板中的受精卵随机分为dmso阴性对照组、erastin处理组和fac处理组，分别向其中加入dmso、erastin溶液和fac溶液，28℃、避光培养48h，每24h更换一次相应溶液；erastin溶液的浓度为20μmol/l，fac溶液的浓度为200μg/ml。

实施例3：铁死亡模型的验证

使用台盼蓝对实施例2中的dmso阴性对照组、erastin处理组和fac处理组的斑马鱼进行活体染色，若检测到细胞死亡现象，即得到斑马鱼铁死亡模型。

从图1中可以看出fac组和erastin处理组比dmso阴性对照组更亮，越亮代表ros越多，说明斑马鱼体内ros明显增加，其诱使细胞死亡数目增多，这从图2中也可以看出，斑马鱼表面的黑点(黑点表示铁死亡的数目)明显增多，即表明本发明成功构建了斑马鱼铁死亡的模型。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

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