快速高效检测雪峰虫草不同菌株交配型的方法及引物组与流程

本发明属于生物领域，尤其涉及一种快速高效检测雪峰虫草不同菌株交配型的方法及引物组。

背景技术：

虫草是寄生于昆虫、植物和少数真菌上的一类真菌的总称，隶属于子囊菌门(ascomycota)，粪壳菌纲(sordariomycetes)，肉座菌目(hypocreales)。已知的子囊菌均为二极性交配系统，由一对交配型位点决定，根据自交是否可育，有性生殖方式分为同宗结合和二极性异宗结合，同宗结合的子囊菌能由单个菌株完成有性生殖，异宗结合子囊菌的有性生殖过程需要互补交配型菌株共同参与。交配型基因位于真菌交配系统的交配型位点，编码有性繁殖的主要调控因子，在真菌有性生殖、子实体发育和遗传进化等方面发挥着决定性作用。因此对不同菌株交配型的研究，为菌种鉴定、改良和子实体的培育提供理论基础，具有重要理论和实践价值。

雪峰虫草(ophiocordycepsxuefengensis)于2013年首次被报道，为线虫草菌属雪峰虫草菌o.xuefengensis寄生于疖蝙蛾幼虫(phassusnoduschu&wang)形成的真菌子座和僵虫的复合体，其寄主疖蝙蛾幼虫生长于马鞭草科植物大青(clerodendrumcyrtophyllumturcz.)近地面根或茎中，是迄今发现的最大的虫草，与冬虫夏草o.sinensis互为姐妹群。在湖南地区，被认为是冬虫夏草的天然替代品，是湖南洞口县瑶族用药，具有止咳化痰、补肾壮阳和增强免疫功能等作用。雪峰虫草为异宗结合真菌，具有mat1-1和mat1-2两种交配型，其有性生殖需要两种交配型菌株的参与。因此，研究快速检测菌株交配型的方法，对于培育雪峰虫草子实体具有重要的应用价值。

目前，用pcr方法对子囊菌交配型基因进行研究和检测的报道不断增多，但这类方法存在鉴定效率低，周期长，步骤繁琐，需要pcr预变形、温度循环、胶电泳和紫外显影等步骤。

名词解释：bstdnapolymerase：bstdna聚合酶。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种快速高效检测雪峰虫草不同菌株交配型的方法及引物组。本发明的检测结果特性强，简单快速，不需要pcr热变形、温度循环、胶电泳和紫外显影等步骤，只需将试剂混合后置于恒温水浴锅中反应，通过混合液的颜色即可快速区分交配型，实现了分雪峰虫草交配型的高效、快速检测。

为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：

一种引物组，包括雪峰虫草mat1-1交配型引物组和雪峰虫草mat1-2交配型引物组；雪峰虫草mat1-1交配型引物组包括序列seqidno:1、序列seqidno:2、序列seqidno:3和序列seqidno:4；所述雪峰虫草mat1-2交配型引物组包括序列seqidno:5、序列seqidno:6、序列seqidno:7和序列seqidno:8。

一种快速高效检测雪峰虫草不同菌株交配型的方法，包括如下步骤：

步骤一、将待检测物和环介导等温扩增缓冲液与雪峰虫草mat1-1交配型引物组或雪峰虫草mat1-2交配型引物组混合，得到混合反应液；雪峰虫草mat1-1交配型引物组包括序列seqidno:1、序列seqidno:2、序列seqidno:3和序列seqidno:4；所述雪峰虫草mat1-2交配型引物组包括序列seqidno:5、序列seqidno:6、序列seqidno:7和序列seqidno:8；

步骤二、将混合反应液加热进行环介导等温扩增；

步骤三、根据混合反应液颜色得到待检测物是否为雪峰虫草mat1-1交配型或雪峰虫草mat1-2交配型。

进一步的改进，所述步骤一中，混合反应液中包括10×bstbuffer2体积份，100mmmg2so41.6体积份，10mmdntps2.8体积份，雪峰虫草mat1-1交配型引物组或雪峰虫草mat1-2交配型引物组ox1f共1体积份；引物组中各引物摩尔量相同；8u/μlbstdnapolymerase0.8-1.5体积份，3mm羟基萘酚蓝溶液0.8体积份，10-200ng/μl待检测物1体积份，然后加ddh2o补足至20体积份。

进一步的改进，所述步骤二中，加热温度为61-63℃，加热时间为0.75-1.5h。

进一步的改进，所述待检测物为所需检测样本的dna。

附图说明

图1为特异性引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b(seqidno:1-4)和ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b(seqidno:5-8)检测雪峰虫草菌株的交配型图，a和b为羟基萘酚蓝染色检测，c和d为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，m:dl2000，3和6为阴性对照(dna模板用ddh2o代替)，1为引物组ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b对交配型mat1-1的结果(阴性)，2为引物组ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b对交配型mat1-2的检测结果(阳性)，4为引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b对交配型mat1-1的检测结果(阳性)，5为引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b对交配型mat1-2的检测结果(阴性)。

图2为特异性引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b和ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b对不同来源的雪峰虫草菌种交配型进行检测图，a1和b1为羟基萘酚蓝染色检测，a2和b2为2％的琼脂糖凝胶电泳检测；m:dl2000；a1和a2中的1-14为引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b对不同来源的雪峰虫草菌种交配型mat1-1检测图，a1和a2中的zj1为阳性对照，zj3为阴性对照，ck为对照(dna模板用ddh2o代替)；b1和b2中的1-14为引物组ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b对不同来源的雪峰虫草菌种交配型mat1-2检测图，b1和b2中的zj1为阴性对照，zj3为阳性对照，ck为对照(dna模板用ddh2o代替)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明。

实施例1：

引物组ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b检测雪峰虫草交配型mat1-1菌株。

(1)快速释放样品中的dna；

称已知交配型为mat1-1雪峰虫草菌株(交配型mat1-1代表菌株zj1)的新鲜样品≧100mg或干燥样品≧50mg，置于研钵中，加入等重量的无菌石英砂，混合研磨后，转入离心管中，加200-600μl无菌双蒸水，100℃水浴10min，10000rpm/min离心8min，取上清，备用。上清液保存于-20℃，48h内使用。

(2)利用由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成的4条特异性引物(ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b)进行环介导等温扩增，引物序列见表1。

表1雪峰虫草交配型mat1-1快速检测引物序列

(3)交配型mat1-1等温扩增体系和反应温度如下：10×bstbuffer2μl，100mmmg2so41.6μl，10mmdntps2.8μl，10μm引物ox1f0.25μl，10μm引物ox1b0.25μl，10μm引物ox1fip2.5μl，10μm引物ox1bip2.5μl，8u/μlbstdnapolymerase1.5μl，3mm羟基萘酚蓝溶液0.8μl，步骤(1)的备用液1μl，ddh2o补足至20μl。混合后61℃水浴0.75h，再80水浴10min终止反应。样品交配型mat1-1的反应体系由紫色变成天蓝色，如图1中的a所示；

(4)用2％的琼脂糖凝胶电泳检测进行验证。检测结果见图1中的c。

实施例2：

引物组ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b检测雪峰虫草交配型mat1-2菌株。

(1)快速释放样品中的dna；

称已知交配型为mat1-2雪峰虫草菌株(交配型mat1-2代表菌株zj3)的新鲜样品≧100mg或干燥样品≧50mg，置于研钵中，加入等重量的无菌石英砂，混合研磨后，转入离心管中，加200-600μl无菌双蒸水，100℃水浴10min，10000rpm/min离心8min，取上清，备用。上清液保存于-20℃，48h内使用。

(2)利用由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成的4条特异性引物(ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b)进行环介导等温扩增，引物序列见表2。

表2雪峰虫草交配型mat1-2快速检测引物序列

(3)交配型mat1-2等温扩增体系和反应温度如下：10×bstbuffer2μl，100mmmg2so41.6μl，10mmdntps2μl，10μm引物ox2f0.25μl，10μm引物ox2b0.25μl，10μm引物ox2fip2.5μl，10μm引物ox2bip2.5μl，8u/μlbstdnapolymerase0.8μl，3mm羟基萘酚蓝溶液0.8μl，步骤(1)的备用液1μl，ddh2o补足至20μl。混合后61℃水浴1.5h，再80水浴10min终止反应。样品交配型mat1-2的反应体系由紫色变成天蓝色，如图1中的b所示。

(4)用2％的琼脂糖凝胶电泳检进行验证。检测结果见图1中的d所示。

实施例3：

与实施例1中的步骤(1)不同，其余相同。具体为：

采用ctab/nacl法提取所需检测样本的dna，用1％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的dna进行定量分析。保存于-20℃，1年内有效。

实施例4：

与实施例2中的步骤(1)不同，其余相同。具体为：

采用ctab/nacl法提取所需检测样本的dna，用1％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的dna进行定量分析。保存于-20℃，1年内有效。

实施例5：

对不同来源的雪峰虫草菌种交配型进行检测。

(1)随机选取通过单分生孢子分离技术选取的14个雪峰虫草单分生孢子菌株，进行检测。以确定检测体系的实用性。利用8条特异性引物(ox1f/ox1fip/ox1bip/ox1b和ox2f/ox2fip/ox2bip/ox2b)对10个雪峰虫草单分生孢子菌株进行交配型检测。交配型mat1-1等温扩增体系和反应温度同实施例1，交配型mat1-2等温扩增体系和反应温度同实施例2。交配型mat1-1等温扩增体系由紫色变成天蓝色的样品为交配型mat1-1，如图2中的a1所示；交配型mat1-2等温扩增体系由紫色变成蓝色的样品为交配型mat1-2，如图2中的b1所示。

(2)用2％的琼脂糖凝胶电泳检进行验证。检测结果见图2中的a2和b2。

本发明基于环介导等温扩增技术，4条引物(fip，bip，f，b)是根据靶基因的6个特异性结合位点设计，在链置换型dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下，合成会产生如花椰菜状，含不同茎环个数，长短不一的dna双链，同时利用dntp后析出的p2o7^4-会与反应液中的mg²⁺结合生成副产物mg2p2o7⁴白色沉淀，导致反应体系中的mg²⁺减少，ph发生变化，在羟基萘酚蓝(hnb)存在时，反应液呈天蓝色，反之则保持紫色。

本发明检测结果特性强，简单快速，不需要pcr热变形、温度循环、胶电泳和紫外显影等步骤，只需将试剂混合后置于恒温水浴锅中反应，通过混合液的颜色即可快速区分交配型。

上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。

序列表

<110>怀化学院

<120>快速高效检测雪峰虫草不同菌株交配型的方法及引物组

<130>2020.9.21

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