一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒及其制备方法和应用与流程

2021-02-02 15:02:24|

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本发明涉及荧光纳米颗粒的制备领域，尤其涉及一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

β-磷酸三钙(β-tcp)是一种具有良好生物相容性和可降解性的生物陶瓷材料，其溶解度约比羟基磷灰石高10～20倍，能够与骨组织直接化学键合，降解产物无毒并能为新骨生成提供丰富的钙、磷，促进新骨的生长，在临床骨修复领域已得到广泛的应用。β-tcp晶格中的钙离子易于被其它金属离子取代，通过掺入具有荧光性能的稀土eu³⁺离子可以赋予β-tcp独特的荧光性能。因此，eu³⁺掺杂β-tcp荧光纳米颗粒有望成为一种生物安全、可降解的显影剂，用于生物医学领域。

研究表明，颗粒尺寸小于200nm易于细胞吞噬，特别是达到纳米级后，基于epr效应(即实体瘤的高通透性和滞留效应，enhancedpermeabilityandretentioneffect)表现出更好的肿瘤靶向能力。但是，β-tcp是磷酸钙的一种高温物相，需要经过高温热处理才能得到。而高温热处理在促进β-tcp晶相形成的同时，也会导致β-tcp颗粒尺寸的长大和团聚。这不利于细胞对eu³⁺掺杂β-tcp荧光纳米颗粒的吞噬，进而影响其生物成像的应用。

目前，可借鉴的制备β-tcp的方法主要有固相反应法、化学沉淀法、醇化合物法等。固相反应法常以二水磷酸氢钙和碳酸钙为原料，通过高温固相反应进行制备，所得粉末晶体结构无晶格收缩、结晶性好，但粉末晶粒粗(微米级)，组成不均匀，往往有杂相存在；醇化合物法是利用钙醇化物之间的反应来生成磷酸盐，制得的β-tcp粉体纯度高、化学均匀性好，但所用有机溶剂有毒性且对环境有污染；化学沉淀法，即先通过调控钙、磷离子的混合浓度来控制晶核生长，进而高温煅烧得到目标产物，反应简单易操作，产物纯度高，但颗粒依然易团聚，团聚后的颗粒尺寸通常超过500nm。因此，对于eu³⁺掺杂β-tcp颗粒作为荧光显影剂应用的关键，就是通过制备方法的改进，降低颗粒团聚，减小颗粒尺寸，实现颗粒纳米化。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要提供一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒及其制备方法和应用，用以解决现有技术中现有的铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒尺寸大、易团聚的技术问题。

本发明的第一方面提供了一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

配制聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；

配制ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液；

将上述ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液经超声喷雾混入上述聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒。

本发明的第二方面提供了一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒，该铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒通过本发明第二方面提供的铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒的制备方法得到。

本发明的第三方面提供了一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒的应用，该铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒作为荧光显影剂应用于细胞荧光标记；该铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒通过本发明第一方面提供的铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒的制备方法得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用超声空化效应将ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液转化成雾状液滴，增加了溶液的比表面积，提高了与磷酸根离子溶液混合的均匀性；同时，含有大量羧酸根的聚丙烯酸通过静电相互作用吸附在磷酸钙(铕)颗粒表面，借助空间位阻效应可防止颗粒团聚、长大；此外，在高温煅烧过程中，存在于磷酸钙(铕)颗粒表面的聚丙烯酸链段可以起到阻隔作用，降低煅烧过程中颗粒的团聚程度，抑制颗粒的长大。

本发明制备的荧光纳米颗粒尺寸处于纳米级，团聚程度低，呈球形，具有良好的荧光性能，可作为荧光显影剂用于细胞标记。

附图说明

图1是实施例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的x射线衍射图谱；

图2是实施例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的透射电镜图片；

图3是实施例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的扫描电镜图片；

图4是实施例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的荧光显微镜图片；

图5是实施例2中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的x射线衍射图谱；

图6是实施例3中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的x射线衍射图谱；

图7是对比例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的扫描电镜图片；

图8是对比例2中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒的扫描电镜图片；

图9是对比例3中产物的x射线衍射图谱；

图10是应用例1中eu³⁺掺杂β-tcp颗粒细胞标记荧光显微镜图片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附体及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的第一方面提供了一种铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

s1配制聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；该过程中，采用聚丙烯酸和磷酸氢二铵作为原料配制聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液；聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液中，磷酸根离子浓度为0.06～0.1mol/l，聚丙烯酸的浓度为1.0～2.0mg/ml；

s2配制ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液；该过程中，采用可溶性钙盐和可溶性铕盐作为原料配制ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液；进一步地，可溶性钙盐为乙酸钙、硝酸钙中的一种或两种，优选为硝酸钙；可溶性铕盐为乙酸铕、硝酸铕中的一种或多种，优选为硝酸铕；ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.09～0.15mol/l，eu/(ca+eu)的摩尔比为(0.001～0.01):1；

s3将上述ca²⁺、eu³⁺离子混合溶液经超声喷雾混入上述聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到铕掺杂β-磷酸三钙荧光纳米颗粒；该过程中，超声喷雾流量为1.0×10^-6m³/s～2.0×10^-6m³/s，超声功率300～500w，磁力搅拌速率1000～1500r/min，，最终混合完成后(ca+eu)/p的摩尔比为1.5，煅烧温度800℃，保温时间为1～3h。该过程中，为了提高混合均匀性，喷雾过程与磁力搅拌过程同时进行，喷雾结束后，即可经冷冻干燥得到粉末。

本发明中，需要说明的是，上述步骤s1和s2并无先后顺序的限制。步骤s1和s2可先后进行，也可同时进行。

本发明利用超声空化效应将ca²⁺、eu³+离子混合溶液转化成雾状液滴，增加了溶液的比表面积，提高了与磷酸根离子溶液混合的均匀性；同时，含有大量羧酸根的聚丙烯酸通过静电相互作用吸附在磷酸钙(铕)颗粒表面，借助空间位阻效应可防止颗粒团聚、长大；此外，在高温煅烧过程中，存在于磷酸钙(铕)颗粒表面的聚丙烯酸链段可以起到阻隔作用，降低煅烧过程中颗粒的团聚程度，抑制颗粒的长大；本发明通过采用较高的ph，一方面能够保证液滴遇到聚丙烯酸和磷酸根离子的混合溶液时能迅速完全沉淀；另一方面能够使paa分子充分质子化，暴露出分子内的羧酸根，保障paa对沉淀物颗粒起到分散效果，质子化后的羧酸根可以与沉淀物颗粒表面通过静电相互作用结合在颗粒表面，通过空间位阻效应阻隔颗粒团聚。

实施例1

配制100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；其中，磷酸根离子浓度为0.06mol/l，聚丙烯酸浓度为1.0mg/ml；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.09m，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.005:1；

将100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液经超声喷雾混入100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到eu³⁺掺杂β-tcp颗粒；其中，超声喷雾流量为1.0×10^-6m³/s，超声功率300w，磁力搅拌速率1000r/min，煅烧温度800℃，保温时间1h。

如图1所示，产物主晶相为β-tcp；如图2和表1，tem所得颗粒尺寸小于100nm，形态为球形，呈单分散，团聚低，激光粒度仪所得平均颗粒尺寸为251nm；如图3，扫描电镜观察产物颗粒尺寸小于100nm，近似球形，颗粒呈分散态；如图4，所得eu³⁺掺杂β-tcp颗粒在紫外光激发下发出强的红色荧光。

实施例2

配制100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；其中，磷酸根离子浓度为0.08mol/l，聚丙烯酸浓度为1.5mg/ml；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.12mol/l，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.001:1；

将100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液经超声喷雾混入100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到eu³⁺掺杂β-tcp颗粒；其中，超声喷雾流量为1.5×10^-6m³/s，超声功率400w，磁力搅拌速率1200r/min，煅烧温度800℃，保温时间2h。

如图5，产物主晶相为β-tcp；如表1，tem所得颗粒尺寸小于100nm，激光粒度仪所得平均颗粒尺寸为299nm。

实施例3

配制100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；其中，磷酸根离子浓度为0.1mol/l，聚丙烯酸浓度为2.0mg/ml；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.15mol/l，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.01:1；

将100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液经超声喷雾混入100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到eu³⁺掺杂β-tcp颗粒；其中，超声喷雾流量为2.0×10^-6m³/s，超声功率500w，磁力搅拌速率1500r/min，煅烧温度800℃，保温时间3h。

如图6，产物主晶相为β-tcp；如表1，tem所得颗粒尺寸约100nm左右，激光粒度仪所得平均颗粒尺寸为304nm。

对比例1

配制100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液，并用氨水调ph值至11～12；其中，磷酸根离子浓度为0.06mol/l，聚丙烯酸浓度为1.0mg/ml；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.09mol/l，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.005:1；

将100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液快速混入100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到eu³⁺掺杂β-tcp颗粒；其中，磁力搅拌速率1000r/min，煅烧温度800℃，保温时间1h。

如图7，扫描电镜观察显示大部分颗粒尺寸大于100nm，形态不规整，呈团聚态；如表1，tem所得颗粒尺寸约为245nm，激光粒度仪检测平均颗粒尺寸为597nm。

对比例2

配制100ml磷酸氢二铵水溶液，并用氨水调ph值至11～12；其中，磷酸根离子浓度为0.06mol/l；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.09mol/l，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.005:1；

将100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液经超声喷雾混入100ml磷酸氢二铵溶液中，同时磁力搅拌，得到乳白色悬浮液，经冷冻干燥得到粉末，高温煅烧处理得到eu³⁺掺杂β-tcp颗粒；其中，超声喷雾流量为1.0×10^-6m³/s，磁力搅拌速率1000r/min，煅烧温度800℃，保温时间1h。

如图8，扫描电镜观察显示大部分颗粒尺寸大于100nm，形态不规整，呈团聚态；如表1，tem所得颗粒尺寸约为297nm，激光粒度仪检测平均颗粒尺寸为696nm。

对比例3

配制100ml聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液，并用氨水调ph值至9～10；其中，磷酸根离子浓度为0.06m，聚丙烯酸浓度为1.0mg/ml；

配制100ml硝酸钙、硝酸铕混合水溶液；其中，ca²⁺、eu³⁺离子的总浓度为0.09m，eu/(ca+eu)的摩尔比为0.005:1；

如图9所示，产物主晶相为焦磷酸钙，无法得到具有较高纯度的目标产物eu³⁺掺杂β-tcp颗粒。

表1实施例1～3和对比例1～2中经透射电镜和激光粒度仪测得的样品平均颗粒尺寸

(激光粒度仪测试过程中，分散剂为水，分散性差，从而导致激光粒度仪尺寸较大，倾向于是团聚体的尺寸；可以通过激光粒度仪尺寸间的横向比较来说明降低颗粒尺寸和团聚的效果)。

由表1和图1～6可以看出，本发明实施例1～3中所得产物为eu³⁺掺杂β-tcp颗粒，其tem粒径在100nm左右，说明本发明的方面能够有利于降低产物粒径。

与实施例1相比，对比例1未将硝酸钙、硝酸铕混合水溶液经超声喷雾混入聚丙烯酸和磷酸氢二铵的混合溶液中，从而导致对比例1所得产物具有较高的粒径，说明超声喷雾有利于进一步降低产物粒径。

与实施例1相比，对比例2中未加入聚丙烯酸，从而导致对比例2所得产物具有较高的粒径，说明聚丙烯酸的加入有利于进一步降低产物粒径。

与实施例1相比，对比例3中的ph为9～10，从而导致对比例3的产物主晶相为焦磷酸钙，无法得到具有较高纯度的目标产物eu³⁺掺杂β-tcp颗粒，说明ph对目标产物的形成具有重要的影响，若ph较低，碱度不够，无法形成纯β-tcp相。

应用例1

将实施例1合成的eu³⁺掺杂β-tcp颗粒应用于肿瘤细胞标记。称取1mg的eu³⁺掺杂β-tcp颗粒分散在10ml去离子水中，然后加入6mg肝素钠，经超声分散处理得到肝素钠稳定的eu³⁺掺杂β-tcp颗粒悬浮液；肝癌细胞(hepg2)按照1×10⁵个/孔的密度接种于玻底培养皿中，用rpmi-1640培养基(含有10％小牛血清和1％青霉素－链霉素)在含5％co2的细胞培养箱中培养24h(37℃)，吸出原培养基，加入用新鲜培养基稀释10倍的eu³⁺掺杂β-tcp颗粒悬浮液，继续培养24h后，吸去玻底培养皿中的培养基，并用pbs洗涤，hoechst33342染色细胞核，然后将培养皿置于荧光显微镜下进行细胞荧光成像。如图10所示，细胞间、细胞内可以观察到红色荧光信号，表明该纳米颗粒具有作为肿瘤细胞标记物的潜力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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