一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记及其应用。


背景技术：

[0002]
雄性不育是作物杂种优势利用最经济有效的途径。目前，国际上油菜杂种优势利用中，主要利用的雄性不育类型有：msl(欧洲和北美)、pgs(北美)、ogura-inra(北美和欧洲)、波里玛cms(中国)。msl和pgs都属于细胞核雄性不育，msl系统的杂交种占欧洲杂交种的70～80％，pgs系统的杂交种占加拿大市场的40％(2006年)。细胞核雄性不育在杂种优势利用中有很多优点：不育性彻底、稳定，而且只需二系配套，大大缩短育种周期，并且不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，也不存在不育胞质的负效应和细胞质单一化的潜在风险，目前在杂种优势利用中具有很大的潜力。特别是隐性核不育因其恢复谱广，育性稳定，易于转育，为杂种优势的利用提供了广阔的前景。但是隐性核不育也存在明显的不足：很难获得全不育群体，繁殖和制种时必须人工拔除不育系中50％的可育株。因此，如何以经济有效的方法除去母本行中50％的可育株，是广泛应用核不育需要解决的主要问题；同时8029ab细胞核雄性不育两型不育系的转育难度较大。
[0003]
8029ab是一类新型显性细胞核雄性不育材料，其育性受到1对复等位基因(bnms5
a
/bnms5
c
/bnms5
e
)控制。当bnms5
c
基因为纯合、bnms5
a
基因纯合或杂合时育性正常。因此，基因型为bnms5
a
和bnms5
c
bnms5
c
的单株表现可育，而基因型为bnms5
e
bnms5
e
和bnms5
c
bnms5
e
的单株则表现不育。因此，该材料可以模拟细胞质雄性不育实现三系化制种(图1)：两型不育系(ab系，基因型：bnms5
e
bnms5
e
和bnms5
a
bnms5
e
)，临保系(基因型：bnms5
c
bnms5
c
)，恢复系(基因型：bnms5
a
bnms5
a
)。即利用不育系与临保系杂交产生100％的不育群体，再利用该全不育群体与恢复系生产杂交种，从而解决了该显性核不育在杂交制种中的须拔除母本行50％可育株的难题。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记及其应用，可以加快油菜作物显性细胞核雄性不育三系法的选育，从而在繁殖制种时获得100％不育的群体。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记，所述分子标记包括：与bnms5
a
基因共分离的snp标记snpms5
a-5、与bnms5
c
基因共分离的snp标记snpms5
c-3和与bnms5
e
基因共分离的snp标记snpms5
e-1；
[0007]
其中标记snpms5
a-5包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物snpms5
a-5f和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物snpms5
a-5r；
[0008]
标记snpms5
c-3包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物snpms5
c-3f和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物snpms5
c-3r；
[0009]
标记snpms5
e-1包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物snpms5
e-1f和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物snpms5
e-1r。
[0010]
本发明还提供了一种扩增所述分子标记的引物组，所述引物组包括以下引物：snpms5
a-5f、snpms5
a-5r、snpms5
c-3f、snpms5
c-3r、snpms5
e-1f和snpms5
e-1r。
[0011]
本发明还提供了所述分子标记在鉴定油菜显性细胞核不育相关基因中的应用，所述油菜显性细胞核不育相关基因包括bnms5
a
、bnms5
c
和bnms5
e
。
[0012]
本发明还提供了所述引物组在鉴定油菜显性细胞核不育相关基因中的应用，所述油菜显性细胞核不育相关基因包括bnms5
a
、bnms5
c
和bnms5
e
。
[0013]
本发明提供了一种鉴定油菜显性细胞核不育相关基因的试剂盒，所述试剂盒中包括所述分子标记或所述引物组。
[0014]
本发明还提供了所述分子标记在选育三系油菜中的应用，所述三系油菜包括：油菜显性细胞核不育系、油菜显性细胞核临保系和油菜显性细胞核恢复系。
[0015]
优选的，当选育油菜显性细胞核不育系时，以具有油菜显性细胞核不育基因bnms5
e
的不育材料为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
e-1分子标记的后代，得基因型为bnms5
e
bnms5
e
或bnms5
c
bnms5
e
的不育系。
[0016]
优选的，当选育油菜显性细胞核临保系时，以具有油菜显性细胞核可育基因bnms5
c
的可育材料为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
c-3分子标记的后代，得基因型为bnms5
c
bnms5
c
的临保系。
[0017]
优选的，当选育油菜显性细胞核恢复系时，以具有油菜显性细胞核恢复基因bnms5
a
的可育材料为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的材料为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
a-5分子标记的后代，得基因型为bnms5
a
bnms5
a
或bnms5
a
bnms5
c
的恢复系。
[0018]
本发明还提供了所述的分子标记或所述引物组在油菜轮回选择育种中的应用。
[0019]
本发明提供了一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记、引物组及试剂盒和应用，本发明所述分子标记与雄性核不育基因bnms5
e
连锁紧密，鉴定结果准确、可靠，为核不育基因bnms5
e
在育种中的应用提供了很好的工具；利用本发明所述分子标记对带有雄性核不育基因bnms5
e
的材料鉴定方法简单，且可在苗期进行，能满足需要进行大量杂交的轮回选择等育种方法的需要，大大降低人工成本，提高育种效率，对于扩大油菜育种的种质基础有极大促进作用；本发明分子标记还对克隆核不育基因bnms5
e
有重要意义。
[0020]
本发明还提供分子标记在油菜及相关作物显性细胞核雄性不育杂种优势利用辅助育种中的应用。本发明具有操作简单、成本低廉、周期短等优点，而且该标记稳定性好，不受环境因素影响，可在早代进行分子标记辅助选择，缩短育种年限，提高育种效率。利用分子标记基因序列信息可以实现油菜及相关作物显性细胞核雄性不育分子标记辅助选择育种；可实现油菜及相关作物显性细胞核三系杂交制种；可实现油菜及相关作物轮回选择群
体单株鉴定选择。
[0021]
生物保藏信息
[0022]
甘蓝型油菜(brassica napus l.)8029a，于2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：p202006；
[0023]
甘蓝型油菜(brassica napus l.)8029b，于2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no：p202007。
附图说明
[0024]
图1是细胞核雄性不育系三系杂交制种流程图；
[0025]
图2是8029ab不育与可育花雄蕊表型，其中a为不育材料8029a的花，b为可育材料8029b的花；
[0026]
图3是标记snpms5
a-5、snpms5
c-3、snpms5
e-1分别在恢复性、保持系与不育系中的扩增效果图，其中m为marker；1～8为标记snpms5
a-5在恢复系中的扩增；9～16为标记snpms5
e-1在不育系中的扩增；17～24为标记snpms5
c-3在保持系中的扩增。
具体实施方式
[0027]
本发明提供了一种与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记，所述分子标记包括：与bnms5
a
基因共分离的snp标记snpms5
a-5、与bnms5
c
基因共分离的snp标记snpms5
c-3和与bnms5
e
基因共分离的snp标记snpms5
e-1；
[0028]
其中标记snpms5
a-5包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物snpms5
a-5f和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物snpms5
a-5r；
[0029]
标记snpms5
c-3包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物snpms5
c-3f和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物snpms5
c-3r；
[0030]
标记snpms5
e-1包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物snpms5
e-1f和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物snpms5
e-1r。
[0031]
本发明优选以油菜显性雄性不育两型系8029ab和油菜恢复系6449为材料构建了近等基因系8030ac，通过筛选snp标记，得到了与恢复基因bnms5
a
连锁的snp分子标记snpms5
a-5；与保持基因bnms5
c
连锁的snp标记snpms5
c-3；与不育基因bnms5
e
连锁的snp标记snpms5
e-1。在本发明中，所述8029ab是一类新型显性细胞核雄性不育材料，其育性受到1对复等位基因(bnms5
a
/bnms5
c
/bnms5
e
)控制。当bnms5
c
基因为纯合、bnms5
a
基因纯合或杂合时育性正常。因此，基因型为bnms5
a
_和bnms5
c
bnms5
c
的单株表现可育，而基因型为bnms5
e
bnms5
e
和bnms5
c
bnms5
e
的单株则表现不育。因此，该材料可以模拟细胞质雄性不育实现三系化制种(图1)：两型不育系(ab系，基因型：bnms5
e
bnms5
e
和bnms5
a
bnms5
e
)，临保系(基因型：bnms5
c
bnms5
c
)，恢复系(基因型：bnms5
a
bnms5
a
)。即利用不育系与临保系杂交产生100％的不育群体，再利用该全不育群体与恢复系生产杂交种，从而解决了该显性核不育在杂交制种中的须拔除母本行50％可育株的难题。
[0032]
在本发明中，标记snpms5
a-5(kx223882)的大小优选为200bp，其引物对的序列分别为：snpms5
a-5f：5
’-
cattctttaacagagataggtgtc-3
’
(seq id no.1)；
[0033]
snpms5
a-5r：5
’-
agactcttgagtacagtctcacg-3
’
(seq id no.2)；
[0034]
标记snpms5
c-3(kx223881)的大小优选为140bp，其引物对的序列分别为：
[0035]
snpms5
c-3f：5
’-
attgtccccttgtagcgcgg-3
’
(seq id no.3)；
[0036]
snpms5
c-3r：5
’-
atttcgtgaagatgcaagttcg-3
’
(seq id no.4)；
[0037]
标记snpms5
e-1(seq id no.7)的大小优选为150bp，其引物对的序列分别为：
[0038]
snpms5
e-1f：5
’-
tcctcctttgttgttttcgag-3
’
(seq id no.5)；
[0039]
snpms5
e-1r：5
’-
tacattaatccatttattatagttt-3
’
(seq id no.6)。
[0040]
本发明还提供了一种扩增所述分子标记的引物组，所述引物组包括以下引物：snpms5
a-5f、snpms5
a-5r、snpms5
c-3f、snpms5
c-3r、snpms5
e-1f和snpms5
e-1r。
[0041]
本发明所述引物组中各引物的序列与上述的引物序列相同，在此不再赘述。
[0042]
本发明还提供了所述分子标记在鉴定油菜显性细胞核不育相关基因中的应用，所述油菜显性细胞核不育相关基因包括bnms5
a
、bnms5
c
和bnms5
e
。
[0043]
本发明优选通过pcr鉴定所述油菜显性细胞核不育相关基因，所述pcr的程序优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0044]
本发明还提供了所述引物组在鉴定油菜显性细胞核不育相关基因中的应用，所述油菜显性细胞核不育相关基因包括bnms5
a
、bnms5
c
和bnms5
e
。本发明利用所述引物组鉴定所述油菜显性细胞核不育相关基因的pcr方法优选与上述方案相同，在此不再赘述。
[0045]
本发明提供了一种鉴定油菜显性细胞核不育相关基因的试剂盒，所述试剂盒中包括所述分子标记或所述引物组。
[0046]
本发明所述试剂盒中优选还包括taq dnapolymerase、10
×
taq buffer、2.5mm dntp mixture和ddh
2
o。在本发明中，利用所述试剂盒鉴定所述油菜显性细胞核不育相关基因时，优选利用与上述方案相同的pcr程序，pcr的体系优选为15μl：taq dnapolymerase 5u，10
×
taq buffer 2.4μl，2.5mm dntp mixture 0.8μl，10um的正向反向引物各0.2μl，2.5u/μl dna polymerase 0.2μl，模板dna 50ng，补ddh
2
0至15μl。
[0047]
本发明还提供了所述分子标记在选育三系油菜中的应用，所述三系油菜包括：油菜显性细胞核不育系、油菜显性细胞核临保系和油菜显性细胞核恢复系。
[0048]
在本发明中，优选基于油菜显性雄性不育两型系8029ab和油菜恢复系6449为材料构建近等基因系8030ac，从而实现如图1所示的细胞质雄性不育实现三系化制种：两型不育系(ab系，基因型：bnms5
e
bnms5
e
和bnms5
a
bnms5
e
)，临保系(基因型：bnms5
c
bnms5
c
)，恢复系(基因型：bnms5
a
bnms5
a
)。即利用不育系与临保系杂交产生100％的不育群体，再利用该全不育群体与恢复系生产杂交种，从而解决了该显性核不育在杂交制种中的须拔除母本行50％可育株的难题。
[0049]
在本发明中，当选育油菜显性细胞核不育系时，优选以具有油菜显性细胞核不育基因bnms5
e
的不育材料为母本，以其他材料为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
e-1分子标记的后代，得基因型为bnms5
e
bnms5
e
或bnms5
c
bnms5
e
的不育系。
[0050]
本发明所述父本优选为基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系，在选育油菜显性细胞核不育系时，优选具体包括：(1)以具有油菜显性细胞核不育基因bnms5
e
的不育材料为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系为父本进行杂交，收取不育株上的种子，得f
1
代；
[0051]
(2)筛选f
1
代中可利用标记snpms5
e-1扩增出产物大小为150bp的dna分子的不育单株为母本，与步骤(1)所述父本进行回交，获得bc
1
f
1
代种子；
[0052]
(3)筛选bc
1
f
1
代种子中可利用标记snpms5
e-1扩增出产物大小为150bp的dna分子的不育单株为母本，与步骤(1)所述父本再次回交，获得bc
2
f
1
代种子；
[0053]
(4)对bc
2
f
1
代种子进行连续回交2～5次，获得性状与步骤(1)中的父本材料相似的不育株。
[0054]
在本发明中，利用标记snpms5
e-1扩增出产物大小为150bp的体系和程序优选与上述方案相同，在此不再赘述。
[0055]
在本发明中，获得的与步骤(1)中的父本材料相似的不育株，基因型为bnms5
e
bnms5
e
或bnms5
c
bnms5
e
。
[0056]
在本发明中，当选育油菜显性细胞核临保系时，优选以具有油菜显性细胞核可育基因bnms5
c
的可育材料为母本，以其他材料为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
c-3分子标记的后代，得基因型为bnms5
c
bnms5
c
的临保系。
[0057]
本发明所述父本优选为基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系，在选育油菜显性细胞核临保系时，优选具体包括：1)以具有油菜显性细胞核可育基因bnms5
c
的可育材料为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的保持系为父本进行杂交，收取不育株上的种子，得f
1
代；
[0058]
2)筛选f
1
代中可利用标记snpms5
a-5能扩增出产物大小为200bp的dna分子的单株做母本，与步骤1)所述父本进行回交，获得bc
1
f
1
代种子；
[0059]
3)筛选bc
1
f
1
代种子中可利用标记snpms5
a-5能扩增出产物大小为200bp的dna分子的单株做母本，与步骤1)所述父本进行回交，获得bc
2
f
1
代种子；
[0060]
4)对bc
2
f
1
代种子进行连续1～4次回交，选取能扩增出产物大小为200bp的dna分子的单株进行挂牌标记，并套袋自交；
[0061]
5)以上述方案得到的不育系为母本，以步骤4)的自交后代为父本进行杂交，得杂交f
1
代；
[0062]
6)筛选杂交f
1
代中利用标记snpms5
a-5和snpns5
e-1分别可得到200bp和150bp的单株进行自交，得自交后代；
[0063]
7)筛选自交后代中利用标记snpms5
a-5和snpns5
e-1分别可得到200bp和150bp的单株，即为临保系，只能得到150bp的单株即为纯合不育系。
[0064]
在本发明中，当选育油菜显性细胞核恢复系时，优选以具有油菜显性细胞核恢复基因bnms5
a
的可育材料为母本，以其他材料为父本杂交，通过回交、杂交或者组织培养的方法，选择具有snpms5
a-5分子标记的后代，得基因型为bnms5
a
bnms5
a
或bnms5
a
bnms5
c
的恢复系。
[0065]
本发明在选育油菜显性细胞核恢复系时，优选包括以下步骤：
①
以带有恢复基因bnms5
a
的材料单株为母本，以基因型为bnms5
c
bnms5
c
的材料为父本，进行人工杂交，得杂交f
1
代；
[0066]
②
筛选杂交f
1
代中可利用标记snpms5
a-5扩增出产物大小为200bp片段的单株做母本，以步骤
①
中的父本材料为父本进行回交，获得bc
1
f
1
代种子；
[0067]
③
筛选bc
1
f
1
后代中可利用标记snpms5
a-5扩增出产物大小为200bp片段的单株做母本，以步骤
①
中的父本材料为父本进行回交，获得bc
2
f
1
代种子；
[0068]
④
对bc
2
f
1
代种子进行连续回交1～4次，筛选出可利用标记snpms5
a-5扩增出产物大小为200bp片段的单株进行套袋自交或小孢子培养；
[0069]
⑤
利用步骤
④
收获的的单株或小孢子苗，筛选出可利用标记snpms5
a-5扩增出产物大小为200bp片段，且无法利用snpms5
c-3扩增出片段的单株，即为基因型为bnms5
a
bnms5
a
的恢复系。
[0070]
本发明还提供了所述的分子标记或所述引物组在油菜轮回选择育种中的应用。
[0071]
下面结合实施例对本发明提供的与油菜显性细胞核不育相关的基因辅助育种的分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0072]
实施例1
[0073]
油菜细胞核显性不育材料8029ab遗传规律分析
[0074]
1、实验材料
[0075]
本实验所用的材料为油菜细胞核显性三系8029ab，其中不育株称为8029a，可育株称为8029b，恢复系为6449，上述材料均来源于中国农业科学院油料作物研究所。
[0076]
油菜细胞核显性三型系8029ab材料来源：在油菜自交系8029中获得3株不育单株，将不育单株与油菜自交系中双11号杂交，杂交一代f1再用中双11号作为轮回亲本回交获得近等基因系。
[0077]
2、细胞核显性不育材料遗传规律
[0078]
采用经典遗传学方法，以不育材料8029a为母本与育性正常油菜中双11号的杂交获得f1和回交分离群体进行分析。测验结果表明(表1)：不育材料8029a的不育性状受一对显性细胞核基因控制。
[0079]
表1显性细胞核雄性不育系8029a遗传分析
[0080][0081]
实施例2
[0082]
油菜细胞核显性不育材料8029a恢复系的遗传规律分析
[0083]
以不育材料8029a为母本与恢复系6449杂交获得f1、f2和回交分离群体进行分析。测验结果表明(表2)：不育材料8029a的恢复系受一对细胞核基因控制，并与不育基因紧密联锁。
[0084]
表2显性细胞核雄性不育材料8029a恢复系的遗传分析
[0085][0086]
实施例3
[0087]
油菜细胞核显性三系8029ab辅助育种分子标记的获得
[0088]
1、引物设计根据bnms5
a
(kx223882)、bnms5
c
(kx223881)以及bnms5
e
(seq id no：7)基因序列及其附近两侧的snp位点进行挖掘。挑选出的snp位点，并利用引物设计软件对其进行引物设计，每组标记设计两条引物。引物委托擎科公司合成。
[0089]
2、pcr反应检测
[0090]
以实施例1和实施例2中bc1分离群体部分不育株与可育株的dna为模板，分别以引物snpms5
a-5f/r、snpms5
c-3f/r、snpms5
e-1f/r进行pcr扩增。
[0091]
pcr的反应体系为：taq dnapolymerase 5u，10
×
taqbuffer2.4μl，2.5mm dntp mixture 0.8μl，10um的正向反向引物各0.2μl，2.5u/μl dna polymerase 0.2μl，模板dna50ng，补ddh
2
0至15μl；
[0092]
pcr的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，循环32次；充分延伸72℃5min。最后4℃保存。
[0093]
结果如图3所示，引物组合snpms5
e-1f/r在实施例1中的不育单株中仅扩增出一条150bp的带，在可育单株中不能扩增出条带；引物snpms5
e-1f/r在实施例2中的不育单株和可育单株中均能扩增出一条150bp的带；说明用引物snpms5
e-1f/r扩增所得dna片段与不育基因连锁紧密，可作为核不育基因bnms5
e
的分子标记。引物组合snpms5
c-3f/r在实施例1中的不育单株和可育单株中均中均能扩增出一条140bp的带；引物snpms5
c-1f/r在实施例2中的不育单株和可育单株中均不能扩增出条带；说明用引物snpms5
c-3f/r扩增所得dna片段与保持基因连锁紧密，可作为核不育保持bnms5
c
的分子标记。snpms5
a-5f/r在实施例1中的不育单株和可育单株中均不能扩增出条带；引物snpms5
a-1f/r在实施例2中的不育单株中不能扩增出条带，在可育单株中能扩增出一条200bp的带；说明用引物snpms5
a-5f/r扩增所得dna片段与恢复基因连锁紧密，可作为核不育恢复基因bnms5
a
的分子标记。
[0094]
实施例4
[0095]
油菜细胞核显性三系8029ab的分子标记验证试验
[0096]
1、试验方法
[0097]
(1)群体构建
[0098]
以不育材料8029a为母本与保持系中双11杂交获得f1，以中双11为轮回亲本与不育株回交，最终得到(8029a
×
中双11)bc
4
分离群体。
[0099]
以不育材料8029a为母本与恢复系6449杂交获得f
1
，再自交得f
2
，以可育株为父本与不育株兄妹交，经过多代兄妹交最终得到(8029a
×
6449)分离群体。
[0100]
(2)在苗期对分离群体的育性基因型进行鉴定
[0101]
在苗期，(8029a
×
中双11)bc
4
分离群体的单株取5g左右新鲜叶片，采用ctab法提取基因组dna。以提取基因组dna为模板，以snpms5
e-1f/r和snpms5
c-3f/r为引物进行pcr扩增；根据扩增产物结果对单株进行标记。
[0102]
在苗期，(8029a
×
6449)分离群体的单株取5g左右新鲜叶片，采用ctab法提取基因组dna。以提取基因组dna为模板，以snpms5
e-1f/r和snpms5
a-5f/r为引物进行pcr扩增；根据扩增产物结果对单株进行标记。
[0103]
pcr的反应体系为：taq dnapolymerase 5u，10
×
taqbuffer2.4μl，2.5mm dntp mixture 0.8μl，10um的正向反向引物各0.2μl，2.5u/μl dna polymerase 0.2μl，模板dna 50ng，补ddh
2
0至15μl；pcr的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，循环32次；充分延伸72℃5min。最后4℃保存。
[0104]
(3)育性田间调查
[0105]
在盛花期，对(8029a
×
中双11)bc
4
和(8029a
×
6449)分离群体的每一个单株进行育性调查。
[0106]
(4)分离群体中部分单株的基因型鉴定
[0107]
分别从(8029a
×
中双11)bc
4
和(8029a
×
6449)分离群体中各选择100个单株利用引物snpms5
a-5f/r、snpms5
c-3f/r和snpms5
e-1f/r进行pcr扩增。
[0108]
(5)结果
[0109]
对(8029a
×
中双11)bc
4
分离群体100株单株的检测结果为：有52个单株可利用引物snpms5
e-1f/r扩增出一条150bp的带；所有单株(100株)都可利用引物snpms5
c-3f/r扩增出一条140bp的带；所有单株都不能利用引物snpms5
a-5f/r扩增出条带。田间育性调查发现只能利用引物snpms5
e-1f/r扩增出一条150bp带的52个单株均为不育株，其它单株均为可育株。
[0110]
对(8029a
×
6449)分离群体100株单株的检测结果为，有47个单株可利用引物snpms5
a-5f/r扩增出一条200bp的带；所有单株都能利用引物snpms5
e-1f/r扩增出一条150bp的带；所有单株都不能利用引物snpms5
c-3f/r扩增出条带。田间育性调查发现只能利用引物snpms5
a-5f/r扩增出一条200bp带的47个单株均为可育株，其它单株均为不育株。
[0111]
上述结果说明本发明分子标记snpms5
a-5与核不育基因恢复基因紧密连锁，分子标记snpms5
c-3与核不育基因保持基因紧密连锁，分子标记snpms5
e-1与核不育基因紧密连锁，用本发明分子标记鉴定8029ab材料的育性基因型准确、可靠，可以作为核不育三系8029ab的分子标记。
[0112]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除