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您当前的位置： 叶片卷曲分子标记及其在鉴定玉米叶片卷曲性状中的应用的制作方法
2021-02-02 15:02:32|
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起点商标网 [0001]本发明涉及生物
技术领域：
：中，叶片卷曲分子标记及其在鉴定玉米叶片卷曲性状中的应用。
背景技术：
：：[0002]几十年来，产量的提高一直是作物的主要育种目标之一。光合作用的改善是充分挖掘作物增产潜力的重要途径。叶片是作物光合作用的主要器官和干物质积累的主要来源。叶片功能，例如光合作用、呼吸作用和蒸腾作用，依赖于叶型或叶片的三维结构。卷叶是叶型和株型的关键组成部分，它可以改变群体的光照条件和光合效率。因此，卷叶性状是作物叶型遗传改良的目的之一。例如，在水稻中，叶片适度卷曲可以产生直立的叶冠和更高的光合效率，同时也可以通过减少蒸腾散失的水分和辐射热的吸收来改善应激反应，从而提高产量。[0003]卷叶是一种复杂的数量性状，由多个基因控制。在水稻中，至少有17个卷叶突变体已经被报道，并且已经定位或克隆了超过70个控制卷叶性状的qtl/基因。泡状细胞是一类大的、薄壁的和高度液泡化的细胞，它成组的存在于水稻叶片的近轴表皮上的维管束之间。值得注意的是，水稻中已经克隆了23个卷叶基因，其中18个基因调控卷叶与泡状细胞有关。例如，riceoutermostcell-specificgene5(roc5)，它是hd-zipiv家族的成员，该基因的造成了泡状细胞的数量和大小的增加，从而导致叶片外卷。相反，roc5的过表达导致叶片内卷。semi-rolledleaf1(srl1)编码一个假定的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，它的突变体在叶片近轴面的泡状细胞数目增多，从而表现出叶片内卷。oszhd1(一个锌指同源域家族同源框转录因子)或它最近的同源物oszhd2的过表达可以造成泡状细胞的数目增加和非正常排列，从而导致叶片外卷。因此，这些数据表明，泡状细胞的数目和大小的改变或者异位排列可以导致叶片的内卷或者外卷。[0004]玉米(zeamaysl.)是主要粮食作物之一，也是重要的经济作物和饲料作物，它以独特的产量优势和广泛的适应性在世界各地大面积种植。在实践中，现代玉米育种的产量提高更依赖于较高的种植密度，其中冠层结构对密度耐受性具有重要影响。叶片卷曲可以减少遮挡，改善株型，增加种植密度，已被用于玉米育种中。例如，具有外卷叶片的商业玉米杂交种浚单20具有紧凑的株型，被广泛种植。到目前为止，已经报道了5个卷叶突变体，包括leafbladeless1(lbl1)突变体，rld1突变体，rlae突变体，蜡质玉米杂交种苏糯5670突变体和swl突变体。在这五个突变体中，已经有两个控制卷叶的基因被克隆，包括lbl1和rld1。lbl1是一个suppressorofgenesilencing3蛋白质同源物，参与了叶片和叶状侧生器官中的近轴面细胞特性的限定，它的突变体由于完全丧失了近轴面细胞类型而显示叶片外卷表型。rld1编码一个同源域-亮氨酸拉链家族iii类(hd-zipiii)蛋白，其近轴表达在空间上是由mirna166在远轴侧介导的转录剪接来实现的。半显性的突变体rolledleaf1-original(rld1-o)，在mirna166互补位点存在单核苷酸替换，因此突变体转录本在远轴侧持续表达，从而导致叶片极性的近轴化或部分反转。技术实现要素：[0005]本发明所要解决的技术问题是如何鉴定玉米叶片卷曲性状。[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了叶片卷曲分子标记或检测所述叶片卷曲分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状中的应用；所述叶片卷曲分子标记为序列表中序列1的第69-670位的核苷酸，玉米基因组dna中对应于序列表中序列1所示的dna片段含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸或不含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸。[0007]所述检测所述叶片卷曲分子标记的物质可为引物对，所述引物对由名称分别为indel-1-f和indel-1-r的单链dna组成，所述indel-1-f为在玉米基因组中与序列1的第69位上游特异结合的单链dna，所述indel-1-r为在玉米基因组中与序列1的第670位下游特异结合的单链dna。[0008]所述引物对满足：以玉米基因组dna为模板进行pcr扩增得到的dna片段含有所述叶片卷曲分子标记。[0009]所述indel-1-f可为序列表中序列1的第1-20位所示的单链dna；所述indel-1-r可为与序列表中序列1的第780-799位反向互补的单链dna。[0010]本发明中还提供了检测玉米基因型的方法，所述基因型为aa基因型、ab基因型和bb基因型，所述方法包括：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列1的第69-670位的核苷酸，如所述待测玉米两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为ab基因型玉米；[0011]g1)含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸；[0012]g2)不含序列表中序列1的第69-670位的核苷酸。[0013]上述方法中，检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列1的第69-670位的核苷酸可采用所述引物对进行，所述方法包括l1)和l2)：[0014]l1)以待测玉米基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增得到pcr产物；[0015]l2)下述l21)或l22)：[0016]l21)检测步骤l1)得到的pcr产物的序列，根据所述pcr产物序列确定玉米基因型：如所述pcr产物中含有序列1所示的dna片段、且不含有序列表中序列2所示的dna片段，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述pcr产物中含有序列2所示的dna片段、且不含有序列表中序列1所示的dna片段，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述pcr产物中含有序列1和2所示的两种dna片段，所述待测玉米为ab基因型玉米；[0017]l22)检测步骤l1)得到的pcr产物的大小，根据所述pcr产物大小确定玉米基因型：如所述pcr产物中含有799bp的dna片段、且不含有197bp的dna片段，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述pcr产物中含有197bp的dna片段、且不含有799bp的dna片段，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述pcr产物中含有799bp和197bp两种大小的dna片段，所述待测玉米为ab基因型玉米。[0018]利用所述引物对进行pcr扩增，所述indel-1-f和所述indel-1-r在反应体系中的浓度均可为0.15μmol/l。利用所述引物对进行pcr扩增的反应体系具体可为：[0019][0020]所述2×gflexpcrbuffer和所述tksgflexdnapolymerase均可为takara产品。[0021]利用所述引物对进行pcr扩增的退火温度可为60℃。利用所述引物对进行pcr扩增的反应条件具体可为94℃2min；98℃10s，60℃15s，68℃30s，35个循环；68℃10min。[0022]检测所述pcr产物的大小可通过电泳进行，也可通过测序进行。[0023]本发明还提供了下述x1)或x2)或x3)的方法：[0024]x1)鉴定玉米叶片卷曲性状的方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，bb基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于aa基因型玉米叶片卷曲度，bb基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于ab基因型玉米叶片卷曲度，ab基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于aa基因型玉米叶片卷曲度；[0025]x2)鉴定玉米叶片卷曲性状的方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，bb基因型玉米为或候选为叶片卷曲玉米，ab基因型玉米为或候选为叶片半卷曲玉米，aa基因型玉米为或候选为非叶片卷曲玉米；[0026]x3)玉米育种方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测玉米的基因型，选择bb基因型玉米或ab基因型玉米作为亲本进行育种。[0027]所述叶片半卷曲玉米是指：与bb基因型玉米和aa基因型玉米相比，叶片卷曲度显著低于bb基因型玉米并且显著高于aa基因型玉米的玉米。[0028]所述叶片卷曲分子标记，也属于本发明的保护范围。[0029]本发明还提供了具有如下y1)-y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述引物对：[0030]y1)检测玉米叶片卷曲分子标记；[0031]y2)制备检测玉米叶片卷曲分子标记的产品；[0032]y3)鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状；[0033]y4)制备鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状产品。[0034]所述物质可为所述引物对。[0035]本发明还提供了下述任一应用：[0036]h1)所述叶片卷曲分子标记在玉米育种中的应用；[0037]h2)检测所述叶片卷曲分子标记的物质在玉米育种中的应用；[0038]h3)检测所述叶片卷曲分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状产品中的应用；[0039]h4)所述检测玉米基因型的方法在鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状的应用。[0040]本发明中，所述玉米可为abrl1或abrl1的后代。[0041]所述叶片可为穗位叶、穗上第一叶、穗上第二叶、穗下第一叶、穗下第二叶或穗下第三叶。[0042]所述abrl1的后代包括以abrl1为亲本与其他玉米进行杂交和/或回交得到的各世代。[0043]在本发明的以实施例中，所述abrl1的后代为abrl1与野生型昌7-2的杂交后代。[0044]所述穗位叶是指主穗穗位叶；[0045]所述穗上第一叶是指主穗穗位叶上面邻近的第一片叶；[0046]所述穗上第二叶是指主穗穗位叶上面邻近的第二片叶；[0047]所述穗下第一叶是指主穗穗位叶下面邻近的第一片叶；[0048]所述穗下第二叶是指主穗穗位叶下面邻近的第二片叶；[0049]所述穗下第三叶是指主穗穗位叶下面邻近的第三片叶。[0050]实验证明，本发明的叶片卷曲分子标记与玉米的叶片卷曲度相关，两条染色体均含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的bb基因型玉米和只有一条染色体含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的ab基因型玉米的叶片卷曲度大于两条染色体均不含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的aa基因型玉米，且ab基因型玉米的叶片卷曲度大于aa基因型玉米。本发明的叶片卷曲分子标记可用于玉米分子标记辅助育种。[0051]生物材料保藏说明[0052]生物材料的分类命名：玉米(zeamays)[0053]生物材料的菌株编号：abrl1[0054]生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0055]生物材料的保藏单位简称：cgmcc[0056]生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101[0057]生物材料的保藏日期：2019年06月24日[0058]生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.18000附图说明[0059]图1为野生型昌7-2和突变体abrl1的形态特征。(a)幼苗期；(b)喇叭口期；(c)成熟期；(d)去掉叶片后的植株；(e)穗位叶；(f)穗位叶最宽处横切面；(g)雌穗；(h)雄穗；ad表示近轴面，ab表示远轴面,bar＝2厘米(a、g和h)、10厘米(b和e)、20厘米(c和d)或1厘米(f)。[0060]图2为indel-1的扩增产物在昌7-2和abrl1中pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。[0061]图3为昌7-2和abrl1组配的f2群体中两种基因型穗位叶卷曲度的比较。注：a代表aa基因型，b代表bb基因型，**表示在0.01水平上差异显著(t测验)。具体实施方式[0062]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。[0063]下述实施例中的昌7-2(hlietal.frontplantsci(2017),identificationofheterosis-associatedstableqtlsforear-weight-relatedtraitsinanelitemaizehybridzhengdan958bydesigniii)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0064]下述实施例中的abrl1，为ems诱变昌7-2产生的叶片外卷突变体，该突变体记载在文献已于2019年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18000。[0065]在苗期，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片卷曲状态无明显差异，都没有外卷表型(图1中a)。随着植株的不断生长发育，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片逐渐向外卷曲。在成熟期，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片都表现为外卷(图1中b、c、e、f)。在三个环境中(e1-e3)，统计分析表明野生型昌7-2的穗位叶卷曲度(28.41-44.05％)显著低于突变体abrl1(61.59-94.02％)。在e3中，测量野生型昌7-2和突变体abrl1植株所有叶片的卷曲度，并进行了比较。结果表明，突变体abrl1的穗位叶、穗上第一叶和第二叶和穗下第一叶、第二叶和第三叶的卷曲度明显大于野生型昌7-2(表1)。[0066]e1表示2016年，北京；e2表示2016年，海南；e3表示2017年，北京。[0067]叶片卷曲度(lri)＝(lw-ln)/lw×100％，lw为叶片最宽处展开后叶缘间距,ln为叶片最宽处自然卷曲状态下叶缘间距。[0068]表1、三个环境下野生型昌7-2和突变体abrl1各个性状值的比较[0069][0070]注：e1，2016年北京；e2，2016年海南；e3，2017年北京；-代表没有测量表型；*，**，***和****分别表示在0.05，0.01,0.001和0.0001水平上差异显著(t检验)。[0071]实施例1、qlri4是与叶片卷曲度相关的分子标记[0072]一、与叶片卷曲度相关的分子标记的发现[0073]本实施例在玉米中发现了一个与叶片卷曲度相关的分子标记，记为qlri4，其为序列表中序列1的第69-670位所示的dna片段，含有该dna片段的玉米的叶片卷曲度高于不含该dna片段的玉米。将基因组中两条染色体均含有该dna片段的玉米的基因型记为bb基因型，将基因组中两条染色体均不含有该dna片段的玉米的基因型记为aa基因型，将基因组中一条染色体含有该dna片段、一条染色体不含有该dna片段的玉米的基因型记为ab基因型。[0074]在该分子标记的上下游设计一个引物对，记为indel-1，indel-1由indel-1-f和indel-1-r组成，indel-1-f和indel-1-r分别为序列表中序列1的第1-20位所示的单链dna和与序列1的第780-799位反向互补的单链dna。[0075]二、利用qlri4检测叶片卷曲性状[0076]利用昌7-2和abrl1杂交得到f1，f1自交产生f2群体，该群体包括122株玉米，作为待测植株，利用昌7-2和abrl1作为对照。[0077]提取各待测植株的基因组dna，利用步骤一的indel-1进行pcr扩增，pcr反应体系如下：[0078][0079]其中，2×gflexpcrbuffer和tksgflexdnapolymerase均为takara产品。[0080]扩增程序如下：94℃2min；98℃10s，60℃15s，68℃30s，35个循环；68℃10min。[0081]将得到的各植株的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，昌7-2和abrl1的电泳结果如图2所示。将各植株的pcr产物进行测序，根据测序结果确定各植株的基因型：[0082]pcr产物含有序列表中序列1所示的dna片段且不含有序列2所示的dna片段的待测植株为bb基因型玉米，pcr产物含有序列表中序列2所示的dna片段且不含有序列1所示的dna片段的待测植株为aa基因型玉米，pcr产物含有序列表中序列1和2所示的两种dna片段的待测植株为ab基因型玉米。[0083]昌7-2的pcr产物的序列为序列表中序列2；abrl1的pcr产物的序列为序列表中序列1。待测植株的pcr产物序列有三种：第一种植株pcr产物序列均为序列表中序列1，这些植株均为bb基因型玉米；第二种植株pcr产物的序列均为序列表中序列2，这些植株均为aa基因型玉米；第三种植株pcr产物的序列有两种，即序列1和2，这些植株均为ab基因型玉米。[0084]在玉米成熟期，测量各待测植株的穗位叶卷曲度，每个重复测10株，3个生物学重复。[0085]昌7-2的穗位叶卷曲度为29.02±7.46％，abrl1的穗位叶卷曲度为66.08±3.41％，aa基因型玉米的穗位叶卷曲度为39.54±17.43％，bb基因型玉米的穗位叶卷曲度为57.74±25.38％，ab基因型玉米的穗位叶卷曲度为54.76±26.38％。结果显示，bb基因型玉米的穗位叶卷曲度显著高于aa基因型玉米，ab基因型玉米的穗位叶卷曲度低于bb基因型玉米并且高于aa基因型玉米。[0086]表明，qlri4是与玉米穗位叶卷曲度相关的分子标记，可以用于检测玉米穗位叶卷曲度。当前第1页1 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技术领域：
：中，叶片卷曲分子标记及其在鉴定玉米叶片卷曲性状中的应用。
背景技术：
：：[0002]几十年来，产量的提高一直是作物的主要育种目标之一。光合作用的改善是充分挖掘作物增产潜力的重要途径。叶片是作物光合作用的主要器官和干物质积累的主要来源。叶片功能，例如光合作用、呼吸作用和蒸腾作用，依赖于叶型或叶片的三维结构。卷叶是叶型和株型的关键组成部分，它可以改变群体的光照条件和光合效率。因此，卷叶性状是作物叶型遗传改良的目的之一。例如，在水稻中，叶片适度卷曲可以产生直立的叶冠和更高的光合效率，同时也可以通过减少蒸腾散失的水分和辐射热的吸收来改善应激反应，从而提高产量。[0003]卷叶是一种复杂的数量性状，由多个基因控制。在水稻中，至少有17个卷叶突变体已经被报道，并且已经定位或克隆了超过70个控制卷叶性状的qtl/基因。泡状细胞是一类大的、薄壁的和高度液泡化的细胞，它成组的存在于水稻叶片的近轴表皮上的维管束之间。值得注意的是，水稻中已经克隆了23个卷叶基因，其中18个基因调控卷叶与泡状细胞有关。例如，riceoutermostcell-specificgene5(roc5)，它是hd-zipiv家族的成员，该基因的造成了泡状细胞的数量和大小的增加，从而导致叶片外卷。相反，roc5的过表达导致叶片内卷。semi-rolledleaf1(srl1)编码一个假定的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，它的突变体在叶片近轴面的泡状细胞数目增多，从而表现出叶片内卷。oszhd1(一个锌指同源域家族同源框转录因子)或它最近的同源物oszhd2的过表达可以造成泡状细胞的数目增加和非正常排列，从而导致叶片外卷。因此，这些数据表明，泡状细胞的数目和大小的改变或者异位排列可以导致叶片的内卷或者外卷。[0004]玉米(zeamaysl.)是主要粮食作物之一，也是重要的经济作物和饲料作物，它以独特的产量优势和广泛的适应性在世界各地大面积种植。在实践中，现代玉米育种的产量提高更依赖于较高的种植密度，其中冠层结构对密度耐受性具有重要影响。叶片卷曲可以减少遮挡，改善株型，增加种植密度，已被用于玉米育种中。例如，具有外卷叶片的商业玉米杂交种浚单20具有紧凑的株型，被广泛种植。到目前为止，已经报道了5个卷叶突变体，包括leafbladeless1(lbl1)突变体，rld1突变体，rlae突变体，蜡质玉米杂交种苏糯5670突变体和swl突变体。在这五个突变体中，已经有两个控制卷叶的基因被克隆，包括lbl1和rld1。lbl1是一个suppressorofgenesilencing3蛋白质同源物，参与了叶片和叶状侧生器官中的近轴面细胞特性的限定，它的突变体由于完全丧失了近轴面细胞类型而显示叶片外卷表型。rld1编码一个同源域-亮氨酸拉链家族iii类(hd-zipiii)蛋白，其近轴表达在空间上是由mirna166在远轴侧介导的转录剪接来实现的。半显性的突变体rolledleaf1-original(rld1-o)，在mirna166互补位点存在单核苷酸替换，因此突变体转录本在远轴侧持续表达，从而导致叶片极性的近轴化或部分反转。技术实现要素：[0005]本发明所要解决的技术问题是如何鉴定玉米叶片卷曲性状。[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了叶片卷曲分子标记或检测所述叶片卷曲分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状中的应用；所述叶片卷曲分子标记为序列表中序列1的第69-670位的核苷酸，玉米基因组dna中对应于序列表中序列1所示的dna片段含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸或不含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸。[0007]所述检测所述叶片卷曲分子标记的物质可为引物对，所述引物对由名称分别为indel-1-f和indel-1-r的单链dna组成，所述indel-1-f为在玉米基因组中与序列1的第69位上游特异结合的单链dna，所述indel-1-r为在玉米基因组中与序列1的第670位下游特异结合的单链dna。[0008]所述引物对满足：以玉米基因组dna为模板进行pcr扩增得到的dna片段含有所述叶片卷曲分子标记。[0009]所述indel-1-f可为序列表中序列1的第1-20位所示的单链dna；所述indel-1-r可为与序列表中序列1的第780-799位反向互补的单链dna。[0010]本发明中还提供了检测玉米基因型的方法，所述基因型为aa基因型、ab基因型和bb基因型，所述方法包括：检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列1的第69-670位的核苷酸，如所述待测玉米两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述待测玉米两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为ab基因型玉米；[0011]g1)含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸；[0012]g2)不含序列表中序列1的第69-670位的核苷酸。[0013]上述方法中，检测待测玉米染色体中对应于序列表中序列1的第69-670位的核苷酸可采用所述引物对进行，所述方法包括l1)和l2)：[0014]l1)以待测玉米基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增得到pcr产物；[0015]l2)下述l21)或l22)：[0016]l21)检测步骤l1)得到的pcr产物的序列，根据所述pcr产物序列确定玉米基因型：如所述pcr产物中含有序列1所示的dna片段、且不含有序列表中序列2所示的dna片段，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述pcr产物中含有序列2所示的dna片段、且不含有序列表中序列1所示的dna片段，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述pcr产物中含有序列1和2所示的两种dna片段，所述待测玉米为ab基因型玉米；[0017]l22)检测步骤l1)得到的pcr产物的大小，根据所述pcr产物大小确定玉米基因型：如所述pcr产物中含有799bp的dna片段、且不含有197bp的dna片段，所述待测玉米为bb基因型玉米；如所述pcr产物中含有197bp的dna片段、且不含有799bp的dna片段，所述待测玉米为aa基因型玉米；如所述pcr产物中含有799bp和197bp两种大小的dna片段，所述待测玉米为ab基因型玉米。[0018]利用所述引物对进行pcr扩增，所述indel-1-f和所述indel-1-r在反应体系中的浓度均可为0.15μmol/l。利用所述引物对进行pcr扩增的反应体系具体可为：[0019][0020]所述2×gflexpcrbuffer和所述tksgflexdnapolymerase均可为takara产品。[0021]利用所述引物对进行pcr扩增的退火温度可为60℃。利用所述引物对进行pcr扩增的反应条件具体可为94℃2min；98℃10s，60℃15s，68℃30s，35个循环；68℃10min。[0022]检测所述pcr产物的大小可通过电泳进行，也可通过测序进行。[0023]本发明还提供了下述x1)或x2)或x3)的方法：[0024]x1)鉴定玉米叶片卷曲性状的方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，bb基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于aa基因型玉米叶片卷曲度，bb基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于ab基因型玉米叶片卷曲度，ab基因型玉米叶片卷曲度大于或候选大于aa基因型玉米叶片卷曲度；[0025]x2)鉴定玉米叶片卷曲性状的方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型，bb基因型玉米为或候选为叶片卷曲玉米，ab基因型玉米为或候选为叶片半卷曲玉米，aa基因型玉米为或候选为非叶片卷曲玉米；[0026]x3)玉米育种方法，包括：按照所述检测玉米基因型的方法检测玉米的基因型，选择bb基因型玉米或ab基因型玉米作为亲本进行育种。[0027]所述叶片半卷曲玉米是指：与bb基因型玉米和aa基因型玉米相比，叶片卷曲度显著低于bb基因型玉米并且显著高于aa基因型玉米的玉米。[0028]所述叶片卷曲分子标记，也属于本发明的保护范围。[0029]本发明还提供了具有如下y1)-y4)中任一用途的物质，所述物质包括所述引物对：[0030]y1)检测玉米叶片卷曲分子标记；[0031]y2)制备检测玉米叶片卷曲分子标记的产品；[0032]y3)鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状；[0033]y4)制备鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状产品。[0034]所述物质可为所述引物对。[0035]本发明还提供了下述任一应用：[0036]h1)所述叶片卷曲分子标记在玉米育种中的应用；[0037]h2)检测所述叶片卷曲分子标记的物质在玉米育种中的应用；[0038]h3)检测所述叶片卷曲分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状产品中的应用；[0039]h4)所述检测玉米基因型的方法在鉴定或辅助鉴定玉米叶片卷曲性状的应用。[0040]本发明中，所述玉米可为abrl1或abrl1的后代。[0041]所述叶片可为穗位叶、穗上第一叶、穗上第二叶、穗下第一叶、穗下第二叶或穗下第三叶。[0042]所述abrl1的后代包括以abrl1为亲本与其他玉米进行杂交和/或回交得到的各世代。[0043]在本发明的以实施例中，所述abrl1的后代为abrl1与野生型昌7-2的杂交后代。[0044]所述穗位叶是指主穗穗位叶；[0045]所述穗上第一叶是指主穗穗位叶上面邻近的第一片叶；[0046]所述穗上第二叶是指主穗穗位叶上面邻近的第二片叶；[0047]所述穗下第一叶是指主穗穗位叶下面邻近的第一片叶；[0048]所述穗下第二叶是指主穗穗位叶下面邻近的第二片叶；[0049]所述穗下第三叶是指主穗穗位叶下面邻近的第三片叶。[0050]实验证明，本发明的叶片卷曲分子标记与玉米的叶片卷曲度相关，两条染色体均含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的bb基因型玉米和只有一条染色体含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的ab基因型玉米的叶片卷曲度大于两条染色体均不含有序列表中序列1的第69-670位的核苷酸的aa基因型玉米，且ab基因型玉米的叶片卷曲度大于aa基因型玉米。本发明的叶片卷曲分子标记可用于玉米分子标记辅助育种。[0051]生物材料保藏说明[0052]生物材料的分类命名：玉米(zeamays)[0053]生物材料的菌株编号：abrl1[0054]生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0055]生物材料的保藏单位简称：cgmcc[0056]生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101[0057]生物材料的保藏日期：2019年06月24日[0058]生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.18000附图说明[0059]图1为野生型昌7-2和突变体abrl1的形态特征。(a)幼苗期；(b)喇叭口期；(c)成熟期；(d)去掉叶片后的植株；(e)穗位叶；(f)穗位叶最宽处横切面；(g)雌穗；(h)雄穗；ad表示近轴面，ab表示远轴面,bar＝2厘米(a、g和h)、10厘米(b和e)、20厘米(c和d)或1厘米(f)。[0060]图2为indel-1的扩增产物在昌7-2和abrl1中pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。[0061]图3为昌7-2和abrl1组配的f2群体中两种基因型穗位叶卷曲度的比较。注：a代表aa基因型，b代表bb基因型，**表示在0.01水平上差异显著(t测验)。具体实施方式[0062]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。[0063]下述实施例中的昌7-2(hlietal.frontplantsci(2017),identificationofheterosis-associatedstableqtlsforear-weight-relatedtraitsinanelitemaizehybridzhengdan958bydesigniii)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。[0064]下述实施例中的abrl1，为ems诱变昌7-2产生的叶片外卷突变体，该突变体记载在文献已于2019年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18000。[0065]在苗期，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片卷曲状态无明显差异，都没有外卷表型(图1中a)。随着植株的不断生长发育，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片逐渐向外卷曲。在成熟期，野生型昌7-2和突变体abrl1叶片都表现为外卷(图1中b、c、e、f)。在三个环境中(e1-e3)，统计分析表明野生型昌7-2的穗位叶卷曲度(28.41-44.05％)显著低于突变体abrl1(61.59-94.02％)。在e3中，测量野生型昌7-2和突变体abrl1植株所有叶片的卷曲度，并进行了比较。结果表明，突变体abrl1的穗位叶、穗上第一叶和第二叶和穗下第一叶、第二叶和第三叶的卷曲度明显大于野生型昌7-2(表1)。[0066]e1表示2016年，北京；e2表示2016年，海南；e3表示2017年，北京。[0067]叶片卷曲度(lri)＝(lw-ln)/lw×100％，lw为叶片最宽处展开后叶缘间距,ln为叶片最宽处自然卷曲状态下叶缘间距。[0068]表1、三个环境下野生型昌7-2和突变体abrl1各个性状值的比较[0069][0070]注：e1，2016年北京；e2，2016年海南；e3，2017年北京；-代表没有测量表型；*，**，***和****分别表示在0.05，0.01,0.001和0.0001水平上差异显著(t检验)。[0071]实施例1、qlri4是与叶片卷曲度相关的分子标记[0072]一、与叶片卷曲度相关的分子标记的发现[0073]本实施例在玉米中发现了一个与叶片卷曲度相关的分子标记，记为qlri4，其为序列表中序列1的第69-670位所示的dna片段，含有该dna片段的玉米的叶片卷曲度高于不含该dna片段的玉米。将基因组中两条染色体均含有该dna片段的玉米的基因型记为bb基因型，将基因组中两条染色体均不含有该dna片段的玉米的基因型记为aa基因型，将基因组中一条染色体含有该dna片段、一条染色体不含有该dna片段的玉米的基因型记为ab基因型。[0074]在该分子标记的上下游设计一个引物对，记为indel-1，indel-1由indel-1-f和indel-1-r组成，indel-1-f和indel-1-r分别为序列表中序列1的第1-20位所示的单链dna和与序列1的第780-799位反向互补的单链dna。[0075]二、利用qlri4检测叶片卷曲性状[0076]利用昌7-2和abrl1杂交得到f1，f1自交产生f2群体，该群体包括122株玉米，作为待测植株，利用昌7-2和abrl1作为对照。[0077]提取各待测植株的基因组dna，利用步骤一的indel-1进行pcr扩增，pcr反应体系如下：[0078][0079]其中，2×gflexpcrbuffer和tksgflexdnapolymerase均为takara产品。[0080]扩增程序如下：94℃2min；98℃10s，60℃15s，68℃30s，35个循环；68℃10min。[0081]将得到的各植株的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，昌7-2和abrl1的电泳结果如图2所示。将各植株的pcr产物进行测序，根据测序结果确定各植株的基因型：[0082]pcr产物含有序列表中序列1所示的dna片段且不含有序列2所示的dna片段的待测植株为bb基因型玉米，pcr产物含有序列表中序列2所示的dna片段且不含有序列1所示的dna片段的待测植株为aa基因型玉米，pcr产物含有序列表中序列1和2所示的两种dna片段的待测植株为ab基因型玉米。[0083]昌7-2的pcr产物的序列为序列表中序列2；abrl1的pcr产物的序列为序列表中序列1。待测植株的pcr产物序列有三种：第一种植株pcr产物序列均为序列表中序列1，这些植株均为bb基因型玉米；第二种植株pcr产物的序列均为序列表中序列2，这些植株均为aa基因型玉米；第三种植株pcr产物的序列有两种，即序列1和2，这些植株均为ab基因型玉米。[0084]在玉米成熟期，测量各待测植株的穗位叶卷曲度，每个重复测10株，3个生物学重复。[0085]昌7-2的穗位叶卷曲度为29.02±7.46％，abrl1的穗位叶卷曲度为66.08±3.41％，aa基因型玉米的穗位叶卷曲度为39.54±17.43％，bb基因型玉米的穗位叶卷曲度为57.74±25.38％，ab基因型玉米的穗位叶卷曲度为54.76±26.38％。结果显示，bb基因型玉米的穗位叶卷曲度显著高于aa基因型玉米，ab基因型玉米的穗位叶卷曲度低于bb基因型玉米并且高于aa基因型玉米。[0086]表明，qlri4是与玉米穗位叶卷曲度相关的分子标记，可以用于检测玉米穗位叶卷曲度。当前第1页1 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