用于鉴定百合倍性的微卫星DNA分子标记及其应用的制作方法

用于鉴定百合倍性的微卫星dna分子标记及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及dna分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定百合倍性的微卫星dna分子标记及其应用。


背景技术：

[0002]
百合(lilium spp.)是单子叶植物亚纲百合科(liliaceae)百合属(lilium)所有种类的总称，是世界著名的球根花卉，可用于切花、盆花和园林绿化，而且药用和食用历史十分悠久。
[0003]
百合育种有一百多年的历史，几乎每年都有新品种不断涌现出。百合育种的亲本材料除野生资源外，大量的栽培品种成为主要的亲本材料。国际上通行的百合品种分类主要釆用英国皇家园艺学会(royal horticultural society，rhs)和北美百合学会(north american lily society，nals)指定的分类系统，即根据百合不同栽培品种与其原始亲缘种或杂种的遗传衍生关系、花色、花型、姿态特征等进行分类(龙雅宜,张金政.百合属植物资源的保护与利用[j].植物资源与环境,1998(01):40-44.)。目前百合主要的现代栽培品种群如下：亚洲百合杂种系(asiatic hybrids，简称a)、东方百合杂种系(oriental hybrids，简称o)、麝香百合杂种系(longiflorum hybrids，简称l)、喇叭杂种系(trumpet and aurelian hybrids，简称t)、纯白百合杂种系(candidum hybrids)、美洲百合杂种系(american hybrids)、轮叶百合杂种系(martagon hybrids)、其他杂种系[如麝亚百合杂种系(longiflorum asiatic hybrids，简称la)、东喇百合杂种系ot、麝东百合杂种系lo等]。
[0004]
现代百合商业品种中，各杂种系多起源于组内杂交，亚洲百合杂种系(a)来自于卷瓣组(sinomartagon)，东方百合杂种系来自于具叶柄组(archelirion)，麝香百合杂种系来自于喇叭组(leucolirion)，除了亚百系列部分品种为三倍体或四倍体(zhou s j.aneuploidy in lily breeding[j].acta horticulturae.2014,(1027):149-154.)，这些品种大多为二倍体。近年来，la(亚洲百合
×
麝香百合)、lo(麝香百合
×
东方百合)、ot(东方百合
×
喇叭百合)等组间杂种系越来越受市场青睐，这些杂种多是通过远缘杂交、以及f1加倍或2n配子的诱导后再反复杂交获得的，致使品种的倍性多样。现有研究表明，la杂种系主要为三倍体(李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[j].园艺学报.2011,38(5):970-976；霍辰思,白锦荣,窦晓莹,郎利新,孔滢,尚宏忠.8个la百合品种的核型分析[j].山西农业大学学报(自然科学版).2018,38(3):57-62.)；lo品种现有少数报道为三倍体(李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[j].园艺学报.2011,38(5):970-976；van tuyl j m,arens p.lilium:breeding history of the modern cultivar assortment[j].acta horticulturae.2011,900.)；ot百合既有二倍体、三倍体也有四倍体(emsweller s l,uhring j.lilium
×
'black beauty'—diploid and amphidiploid[j].lily year book.1966,29:45-47.；李克虎,周桂雪,任桂玲,张线线,郭方其,周树军.百合品种染色体倍性观察[j].园艺学报.2011,38(5):970-976；周桂雪.亚洲百合品种倍性调查与倍性间杂交分析[d].浙江大学硕士学位论
文,2011；于雪,张铭芳,封紫,袁晓娜,贾桂霞.6个东方百合品种的染色体核型分析[j].广东农业科学.2012,10:137-144.；)。因此，百合品种的倍性鉴定已成为目前百合育种首要解决的关键问题。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种用于鉴定百合倍性的微卫星dna(ssr)分子标记，本发明的另一目的是提供该微卫星dna分子标记的应用。
[0006]
为实现上述目的，本发明通过对多个品种的百合进行转录组测序，以转录组测序得到的序列为参考，对拼接组装得到的unigenes进行ssr位点的识别定位；对筛选得到的含ssr位点的unigene序列设计引物，保证ssr位点侧翼序列长度≥50bp；进一步对设计得到的引物进行排序和比较，从两万多对引物中，筛选得到151对多态性高的引物。利用15个不同品种的百合对筛选得到的151对引物进行进一步筛选，使用touchdown pcr程序初筛，共筛选得到69对引物，合成含m13接头的引物，进一步复筛，复筛主要利用两步法pcr程序，最终选择了43对多态性较高、较稳定的核心引物进行后续试验。利用筛选得到的43对核心引物、以290个百合不同品种及野生种的基因组dna为模板进行ssr-pcr扩增，筛选得到条带清晰、较稳定、多态性高、可用于百合倍性鉴定的微卫星标记9个，其编号分别为j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123、j9-167，其引物序列分别如seq id no.1-18所示。
[0007]
基于上述发现，本发明提供以下技术方案：
[0008]
本发明提供用于鉴定百合倍性的微卫星dna分子标记，其包含微卫星dna分子标记j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123、j9-167中的一个或多个的组合；其中，j1-044由seq id no.1-2所示引物扩增得到，j2-080由seq id no.3-4所示引物扩增得到，j3-091由seq id no.5-6所示引物扩增得到，j4-094由seq id no.7-8所示引物扩增得到，j5-096由seq id no.9-10所示引物扩增得到，j6-098由seq id no.11-12所示引物扩增得到，j7-117由seq id no.13-14所示引物扩增得到，j8-123由seq id no.15-16所示引物扩增得到，j9-167由seq id no.17-18所示引物扩增得到。
[0009]
以上所述的引物序列具体如下：
[0010]
seq id no.1：j1-044f:5'-cagtataattagtgacgtgcctgg-3'
[0011]
seq id no.2：j1-044r:5'-tcaatactctcacaatcctccaaa-3'
[0012]
seq id no.3：j2-080f:5'-ggagggactctcgagtatttatca-3'
[0013]
seq id no.4：j2-080r:5'-gcttcctgtttatctccactgatt-3'
[0014]
seq id no.5：j3-091f:5'-gtcatcacaataccctctctgga-3'
[0015]
seq id no.6：j3-091r:5'-ctcaggtaacagatcctgcacac-3'
[0016]
seq id no.7：j4-094f:5'-gtctctccttccccatacccta-3'
[0017]
seq id no.8：j4-094r:5'-agtacagcgaggatccgtacat-3'
[0018]
seq id no.9：j5-096f:5'-gtctttaaacctcaggcaacaagt-3'
[0019]
seq id no.10：j5-096r:5'-aggaccttgaacatatgtctgtga-3'
[0020]
seq id no.11：j6-098f:5'-gtgttgctgctccatgtatttaac-3'
[0021]
seq id no.12：j6-098r:5'-tacacttctcaatgttcccttcaa-3'
[0022]
seq id no.13：j7-117f:5'-tgtctacaatcgaggaagttgaag-3'
[0023]
seq id no.14：j7-117r:5'-ggttacctacatagaccctgttgc-3'
[0024]
seq id no.15：j8-123f:5'-tttttatctcctcgagactgatcc-3'
[0025]
seq id no.16：j8-123r:5'-atctttctctgctggttctcattt-3'
[0026]
seq id no.17：j9-167f：5'-accacatcagatccaaacaatg-3'
[0027]
seq id no.18：j9-167r:5'-aggtcatgcagagatcttgtgtt-3'。
[0028]
在进行百合倍性鉴定时，可使用微卫星dna分子标记j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123、j9-167中的任意1个，或者任意2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个的组合，或者使用上述9个分子标记的组合。
[0029]
在未知百合品种时，优选使用上述9个微卫星dna分子标记的组合进行倍性鉴定。
[0030]
优选地，本发明所述的用于鉴定百合倍性的微卫星dna分子标记包含j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123和j9-167的组合。
[0031]
以上所述的微卫星dna分子标记的信息如表1所示。
[0032]
表1微卫星dna分子标记的信息
[0033][0034]
具体地，对于岷江百合，微卫星dna分子标记j1-044、j2-080、j6-098的est序列如seq id no.19-20及24所示；对于百合品种
‘
索邦
’
，微卫星dna分子标记j3-091、j5-096、j7-117、j8-123的est序列如seq id no.21、23、25及26所示；对于百合品种
‘
白光二号
’
，微卫星dna分子标记j4-094的est序列如seq id no.22所示；对于百合品种
‘
tiny todd
’
，微卫星dna分子标记j9-167的est序列如seq id no.27所示。
[0035]
本发明还提供用于扩增所述微卫星dna分子标记的引物或引物组合，其为选自seq id no.1-18所示引物的一对或多对的组合。
[0036]
为便于检测，以上所述的引物可采用荧光标记。可选的荧光标记包括但不限于rox、trama、fam等。
[0037]
本发明还提供包含所述引物或引物组合的试剂盒。该试剂盒可用于百合的倍性鉴定。
[0038]
优选地，所述试剂盒包含seq id no.1-18所示的引物。
[0039]
以上所述的试剂盒还可包括用于pcr扩增的其他成分，包括但不限于pcr反应缓冲液、dntp、dna聚合酶、阴性对照、阳性对照等。
[0040]
本发明提供所述微卫星dna分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合倍性鉴定中的应用。
[0041]
本发明提供所述微卫星dna分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合遗传育种中的应用。
[0042]
本发明提供所述微卫星dna分子标记或所述引物或引物组合或所述试剂盒在百合种质资源多样性分析或种质资源改良中的应用。
[0043]
本发明提供一种鉴定百合倍性的方法，其为以百合的基因组dna为模板，对所述微卫星dna分子标记进行基因分型，根据基因分型结果判断百合倍性。
[0044]
具体地，以百合的基因组dna为模板，采用所述引物或引物组合进行pcr扩增，根据pcr扩增产物的条带类型判断百合为二倍体或多倍体。
[0045]
优选地，以seq id no.1-18所示的引物进行pcr扩增。
[0046]
优选地，所述pcr扩增的反应程序包括：第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，15-20个循环；72℃10min；第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
[0047]
所述pcr扩增的反应体系如下：第一步(10μl)：2
×
power taq pcr mastermix 5μl，正向引物0.1μl(10μm)，反向引物0.1μl(10μm)，基因组dna 1μl，ddh
2
o补足；第二步(20μl)：2
×
power taq pcr mastermix 5.6μl，反向引物0.15μl，m13荧光标记引物0.15μl，第一步反应产物10μl，ddh
2
o补足。
[0048]
以上所述的方法中，根据待测样品各dna多态性位点对应扩增片段的条带数判断待测样品为多倍体或二倍体，若1个dna多态性位点获得的条带数多于两个，则待测样品判断为多倍体，若1个dna多态性位点获得的条带数为两个，则待测样品判断为二倍体。
[0049]
本发明的有益效果在于：本发明提供了9个百合的微卫星位点以及用于扩增这9个微卫星位点的引物，并建立了利用百合的微卫星dna分子标记鉴定百合倍性的方法。利用本发明提供的9个微卫星dna分子标记对百合的倍性进行鉴定，准确率较高，且重复性较好，为百合多倍体育种提供了有效的技术支撑。
附图说明
[0050]
图1、图2和图3为本发明实施例2中样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、ot60、o1及o3的百合材料的j2-080位点扩增产物检测结果。
[0051]
图4、图5和图6为本发明实施例2中样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、ot60、o1及o3的百合材料的j5-096位点扩增产物检测结果。
[0052]
图7、图8和图9为本发明实施例2中样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、o1及o3的百合材料的j7-117位点扩增产物检测结果。
[0053]
图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9中，横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。
具体实施方式
[0054]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0055]
实施例1百合转录组序列中ssr位点的鉴别及微卫星分子标记引物的设计
[0056]
本发明通过对多个品种的百合进行转录组测序，以转录组测序得到的序列为参
考，对拼接组装得到的unigenes进行ssr位点的识别定位；对筛选得到的含ssr位点的unigene序列设计引物并进行引物的逐步筛选，最终确定了非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富、可用于百合倍性鉴定的微卫星分子标记，具体方法如下：
[0057]
1、以三组百合转录组测序得到的大量序列为参考，利用misa(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对拼接组装得到的unigenes进行ssr位点的识别定位。筛选标准为：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在5次或5次以上，三核苷酸重复的次数在4次或4次以上，四至六核苷酸重复的次数在3次或3次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的ssr。
[0058]
2、利用primer 3.0引物批量设计程序对筛选得到的含ssr位点的unigene序列设计引物，并且保证ssr位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计主要参数：引物序列长度18～24bp之间，pcr产物长度100～300bp之间，gc含量45％～65％之间，tm值55～75℃之间，尽量避免出现发夹结构、二聚体、错配和引物二聚体。
[0059]
3、参照文献(chen c,bock clive h,beckman tom g.sequence analysis reveals genomic factors affecting est-ssr primer performance and polymorphism[j].mol genet genomics.2014,289:1147
–
1156)的方法，在microsoft excel中将设计得到的三个数据组的引物序列进行排序和比较，首先删除来自于三个数据组，具有相同重复基序、相同扩增子的相同引物序列。其次，比较重复基序、产物长度，可能出现的三种类型如下：(1)重复基序一样，产物长度不一样，推断其具有多态性，入选；(2)产物长度一样，重复基序不一样，推断其具有多态性，入选；(3)如果两者一样就不选。例如，分别来自于新铁炮和岷江数据组的一对上下游相同引物，新铁炮的重复基序是(cccggc)
4
，产物长度是242，岷江的重复基序是(cccggc)
3
，产物长度是236，这样的类型就是上述提到的重复基序一样，产物长度不一样，推断其具有多态性，作为入选引物。用此方法，大大缩小了引物筛选范围，最终选出微卫星标记151个。
[0060]
4、百合微卫星引物的进一步筛选：
[0061]
(1)引物的初筛主要使用touchdown pcr程序，复筛主要用两步法pcr程序。扩增体系如表2所示。
[0062]
touchdown pcr程序：95℃5min；95℃30s，65～55℃30s(每循环降1℃)，72℃30s，10个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，最后4℃保温。
[0063]
两步法pcr程序：
[0064]
第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，最后4℃保温。
[0065]
第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，最后4℃保温。
[0066]
表2 pcr扩增反应体系配方
[0067][0068]
(2)使用两种方法对pcr扩增产物进行检测：8％非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳，分别对引物进行的初筛和复筛。初筛以15个百合品种基因组dna为模板进行ssr-pcr扩增，将各pcr产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上检测各引物多态性，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星标记69个。进一步复筛，复筛主要利用两步法pcr程序，最终选择了43对多态性较高、较稳定的核心引物进行后续试验。利用筛选得到的43对核心引物、以290个百合不同品种及野生种的基因组dna为模板进行ssr-pcr扩增，采用荧光毛细管电泳法，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星dna分子标记9个，其编号分别为j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123、j9-167，其扩增引物依次分别如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18所示，这9个微卫星dna分子标记适合用于百合倍性的鉴定。
[0069]
实施例2利用百合微卫星dna分子标记鉴定百合不同品种的倍性
[0070]
利用实施例1筛选得到的9个微卫星dna分子标记对不同品种百合的倍性进行鉴定，具体方法如下：
[0071]
(1)提取116个百合不同品种的基因组dna(新型植物基因组dna快速提取试剂盒dn15，购自北京艾德莱生物科技有限公司)；
[0072]
(2)分别用j1-044、j2-080、j3-091、j4-094、j5-096、j6-098、j7-117、j8-123、j9-167位点的特异性引物，以116个百合品种的基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系如表3所示：
[0073]
表3 pcr扩增反应体系配方
[0074][0075]
两步法pcr程序如下：
[0076]
第一步：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，20个循环；72℃10min，最后4℃保温。
[0077]
第二步：95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，最后4℃保温。
[0078]
所使用的正向引物和反向引物的序列如下：
[0079]
seq id no.1：j1-044f:5'-cagtataattagtgacgtgcctgg-3'
[0080]
seq id no.2：j1-044r:5'-tcaatactctcacaatcctccaaa-3'
[0081]
seq id no.3：j2-080f:5'-ggagggactctcgagtatttatca-3'
[0082]
seq id no.4：j2-080r:5'-gcttcctgtttatctccactgatt-3'
[0083]
seq id no.5：j3-091f:5'-gtcatcacaataccctctctgga-3'
[0084]
seq id no.6：j3-091r:5'-ctcaggtaacagatcctgcacac-3'
[0085]
seq id no.7：j4-094f:5'-gtctctccttccccatacccta-3'
[0086]
seq id no.8：j4-094r:5'-agtacagcgaggatccgtacat-3'
[0087]
seq id no.9：j5-096f:5'-gtctttaaacctcaggcaacaagt-3'
[0088]
seq id no.10：j5-096r:5'-aggaccttgaacatatgtctgtga-3'
[0089]
seq id no.11：j6-098f:5'-gtgttgctgctccatgtatttaac-3'
[0090]
seq id no.12：j6-098r:5'-tacacttctcaatgttcccttcaa-3'
[0091]
seq id no.13：j7-117f:5'-tgtctacaatcgaggaagttgaag-3'
[0092]
seq id no.14：j7-117r:5'-ggttacctacatagaccctgttgc-3'
[0093]
seq id no.15：j8-123f:5'-tttttatctcctcgagactgatcc-3'
[0094]
seq id no.16：j8-123r:5'-atctttctctgctggttctcattt-3'
[0095]
seq id no.17：j9-167f：5'-accacatcagatccaaacaatg-3'
[0096]
seq id no.18：j9-167r:5'-aggtcatgcagagatcttgtgtt-3'；
[0097]
(3)将pcr产物用abi3730xl遗传分析仪(applied biosystem公司)进行str基因分型，使用genemarker2.0软件判读等位基因的具体数值；
[0098]
(4)使用popgen 1.32计算等位基因数、多态信息量的值来描述百合dna多态位点的特征，结果如表4所示：
[0099]
表4 9个百合微卫星多态位点的特征
[0100][0101]
(5)结果判定：对于9个微卫星dna分子标记，若检测出的等位基因多于两个，则判断该个体可能为多倍体，否则，则为二倍体。
[0102]
116份百合不同品种材料的名称及其所属杂种系信息见表5，利用9个微卫星dna分子标记对这116份百合品种材料进行扩增的结果见表6、表7、表8和表9所示，其中，样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、ot60、o1及o3的百合材料的j2-080位点扩增产物检测结果如图1、图2和图3所示；样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、ot60、o1及o3的百合材料的j5-096位点扩增产物检测结果如图4、图5和图6所示；样本编号为a1、a25、a28、la27、la28、la30、at5、at8、ot10、ot11、ot12、ot23、ot24、ot53、o1及o3的百合材料的j7-117位点
扩增产物检测结果如图7、图8和图9所示。
[0103]
结果显示，116份百合材料中有78份材料至少有1次检测出3或4个等位基因，判断为多倍体，38份材料只检测出1或2个等位基因，判断为二倍体。
[0104]
表5 116份百合不同品种材料的名称
[0105]
[0106][0107]
注：a表示亚洲百合杂种系(asiatic hybirds)，ap表示盆栽亚洲百合杂种系，at表示tiger系列及pearl系列亚洲百合杂种系(asiatic-tiger hybrids，asiatic-pearl hybrids，)；o表示东方百合杂种系(oriental hybirids)；lo表示麝香百合杂种系与东方百合杂种系的杂交后代；la表示麝香百合杂种系与亚洲百合杂种系的杂交后代；m表示轮叶百合杂种系(martagon hybrids)；f代表新铁炮百合杂种系；sp为原生种的驯化品种；w表示原生种(species)。
[0108]
表6 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)
[0109][0110]
表7 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)
[0111][0112]
表8 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)
[0113][0114]
表9 9对引物在116个种质材料中的扩增情况(仅统计扩增产物为3条及3条以上)
319-90698-0_20。
[0128]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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