严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法与流程

[0001]
本发明涉及严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒(virus-like particles，vlps) 的制备、纯化和鉴定方法。


背景技术：

[0002]
自21世纪以来，全球已出现三次冠状病毒爆发流行。相比严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸道冠状病毒(mers-cov)，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)传播更快，传染指数2.6左右，目前对于sars-cov-2引起的冠状病毒病2019(covid-19)没有特效药物，疫苗是预防和控制传染病的最有效和最经济的方法，急需开发针对sars-cov-2的疫苗，以预防和控制该病毒的传播。世界卫生组织估计，目前约有133种疫苗正在研制中。
[0003]
目前冠状病毒疫苗形式多样，包括灭活病毒或减毒活病毒、基于蛋白质的疫苗、核酸疫苗等。灭活病毒或减毒活病毒需要在生物安全等级3(bsl3)条件下大量培养病毒，并需要进行广泛的安全测试，过程昂贵，费力且安全风险高。基于蛋白质的亚单位疫苗由于靶蛋白的不正确折叠或向免疫系统的展示不佳，使得一些亚单位疫苗的免疫原性很差。核酸疫苗无法有效地进入细胞，需要在注射后进行电穿孔，并且mrna不是非常稳定，并需要多次接种。作为一类特定的亚单位疫苗，病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)能够模拟病毒天然形态结构，并具有不含病毒基因组核酸、无法复制、个体重复接种等特性。 vlps由于其强大的免疫原性，引发保护性中和抗体的能力以及可靠的安全性，因此可用于重组疫苗开发，有广阔的市场应用前景。目前已成功上市基于vlps的有hpv疫苗和乙肝疫苗。
[0004]
sars-cov-2基因组的3
′
端编码4种主要结构蛋白，包括刺突(s)蛋白，核衣壳(n) 蛋白，膜(m)蛋白和包膜(e)蛋白，根据以往研究，sars-covvlps、mers-covvlps 的构成同时需要e、m、s三种蛋白。在本发明中，构建了同时表达e、m、s三种蛋白的 ems载体，利用bac to bac杆状病毒昆虫表达系统，在expisf9
tm
细胞内实现e、m、s 三种蛋白的共表达，并在细胞内自组装形成vlps。


技术实现要素：

[0005]
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (sars-cov-2)病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)的制备、纯化和鉴定方法。
[0006]
本发明提供严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]
(1)、将pfastbacdual双表达载体改造为三表达载体，将sars-cov-2的m、s、e 基因进行密码子优化，然后将密码子优化的m、s基因依次分别构建至多角体蛋白启动子后，将e基因构建至pp10启动子后，获得表达ems重组质粒；
[0008]
(2)将ems重组质粒转化至dh10 bac
tm
大肠杆菌中，经蓝白筛选挑取白色阳性克隆，
提取杆粒转染expisf9
tm
细胞，胞内共表达e、m、s结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒。
[0009]
作为优选，所述将pfastbacdual双表达载体改造为三表达载体是依次在pfastbacdual 载体多克隆位点mcs2后，插入pph启动子、多克隆位点mcs3及sv40 polya尾，改造成三表达载体。
[0010]
作为进一步优选，所述多克隆位点mcs2包含bamhi、rsrii、bsshii、ecori酶切位点，多克隆位点mcs3包含酶切位点ndei、hindiii酶切位点。
[0011]
作为再进一步优选，所述多克隆位点mcs2的核苷酸序列为： ggatcccggtccgaagcgcgcggaattc；所述mcs3的核苷酸序列为： catatgaagctt。
[0012]
作为优选，所述密码子优化后的sars-cov-2e基因的核苷酸序列为序列表seq idno.4。
[0013]
作为优选，所述密码子优化后的sars-cov-2m基因的核苷酸序列为序列表seq id no.5。
[0014]
作为优选，所述密码子优化后的sars-cov-2s基因的核苷酸序列为序列表seq idno.6。
[0015]
作为优选，将ems重组质粒先转化入top10感受态细胞，重新提取重组质粒后转化至dh10 bac
tm
大肠杆菌感受态细胞。
[0016]
本发明提供上述的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的纯化方法，将严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，收集30～40wt％之间的白色云雾状条带，用pbs稀释收集物，离心收集沉淀，pbs复溶，收集物为纯化的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒。
[0017]
本发明提供上述的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的鉴定方法，western blot结果显示出现了大小为130kda蛋白条带，则制备得到严重急性呼吸综合征冠状病毒 2病毒样颗粒；或，
[0018]
透射电镜观察到直径80～120nm颗粒物，则制备得到严重急性呼吸综合征冠状病毒2 病毒样颗粒。
[0019]
本发明将pfastbacdual双表达载体改造为三表达载体，并将严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的m、s基因分别构建至多角体蛋白启动子(polyhedrinpromotor， pph)后，将e基因构建至pp10启动子后，获得表达ems重组质粒；将重组质粒转化至 dh10 bac
tm
大肠杆菌中，转座后形成ems重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid)，提取杆粒转染expisf9
tm
细胞，胞内共表达e、m、s结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒 (virus-like particles，vlps)；再利用蔗糖密度梯度离心法纯化获得vlps，并用westernblot和透射电镜进行鉴定。结果显示：本发明成功构建三表达载体，并获得ems重组质粒，测序一致。质粒转座后提取杆粒进行pcr鉴定，在预期目标处有清晰条带，测序鉴定一致。杆粒转染expisf9
tm
细胞后共表达e、m、s蛋白，自组装成vlps。经蔗糖密度提取离心，在30wt％-40wt％处获得sars-cov-2vlps，western blot检测可见特异性s条带，利用透射电镜可见直径为80～100nm的颗粒，形态和大小均与sars-cov-2一致。
[0020]
本发明成功构建了ems三表达载体，并利用杆状昆虫系统在expisf9
tm
细胞内成功表达了sars-cov-2vlps，为今后疫苗的开发、发病机制的研究奠定了基础。
附图说明
[0021]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0022]
图1为ems三表达载体构件图。
[0023]
图2为ems三表达质粒转座及二次筛选。
[0024]
图3为重组杆粒pcr鉴定结果。
[0025]
图4为expisf9
tm
细胞病变图。
[0026]
图5为s蛋白wb鉴定结果。
[0027]
图6为ems vlps透射电镜观察结果图。
具体实施方式
[0028]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。“wt％”表示重量百分比。
[0029]
实施例1
[0030]
1材料与方法
[0031]
1.1细胞expisf9
tm
细胞购自赛默飞世尔科技中国有限公司。
[0032]
1.2载体双表达载体pfastbacdual购自赛默飞世尔科技中国有限公司；
[0033]
1.3主要试剂及仪器
[0034]
hifi pcr supermix(全式金，中国)，s全长兔抗(sinobiological，中国)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg(索莱宝，中国)，ecl化学发光显色液，0.4％台盼蓝染液；超净工作台、梯度pcr仪、伯乐公司凝胶成像仪、涡旋振荡器、pcr电泳凝胶成像系统、智诚公司水平轨道摇床、赛默飞培养箱、-80℃冰箱、高速冷冻离心机、小型离心机，超速离心机，fei talos f200c电子显微镜。
[0035]
1.4 ems重组杆状病毒质粒的构建
[0036]
1.4.1双表达载体改造为三表达载体pfastbacdual为双表达载体，依次在 pfastbacdual载体多克隆位点mcs2 ecori酶切位点后，依次插入sv40 polya尾、pph 启动子及多克隆位点mcs3，改造该载体为三表达载体。改造后mcs2多克隆位点包含 bamhi、rsrii、bsshii、ecori酶切位点，mcs3包含酶切位点ndei、hindiii酶切位点。
[0037]
其中，改造后的mcs2的核苷酸序列为：
[0038]
ggatcccggtccgaagcgcgcggaattc
[0039]
bamhi ggatcc；rsrii cggtccg；bsshii gcgcgc；ecori gaattc；
[0040]
mcs3的核苷酸序列为：
[0041]
catatgaagctt
[0042]
ndei catatg；hindiii aagctt；
[0043]
改造后的三表达载体的核苷酸序列为：
[0044]
ttctctgtcacagaatgaaaatttttctgtcatctcttcgttattaatgtttgtaa ttgactgaatatcaacgcttatttgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtag cggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgc cagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctc
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[0045]
1.4.2 e、m、s基因的确定根据肺炎病毒分离株第一株的完整基因组确定sars-cov-2 e、m、s基因，根据基因序列对m、s基因进行密码子优化，以去除常用酶切位点。
[0046]
sars-cov-2e基因的核苷酸序列为：
[0047]
atgtactcattcgtttcggaagagacaggtacgttaatagttaatagcgtacttc tttttcttgctttcgtggtattcttgctagttacactagccatccttactgcgcttcga ttgtgtgcgtactgctgcaatattgttaacgtgagtcttgtaaaaccttctttttacgt ttactctcgtgttaaaaatctgaactcttctagagttcctgatc
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[0048]
密码子优化后的sars-cov-2m基因的核苷酸序列为：
[0049]
atggcagattccaacggtactattaccgttgaagagcttaaaaagctccttgaacaa tggaacctagtaataggtttcctattccttacatggatttgtcttctacaatttgcctat gccaacaggaataggtttttgtatataattaagttaattttcctctggctgttatggcc agtaactttagcttgttttgtgcttgctgctgtttacagaataaattggatcaccggt ggaattgctatcgcaatggcttgtcttgtaggcttgatgtggctcagctacttcattg cttctttcagactgtttgcgcgtacgcgttccatgtggtcattcaatccagaaactaa cattcttctcaacgtgccactccatggcactattctgaccagaccgcttctagaaagt gaactcgtaatcggagctgtgatccttcgtggacatcttcgtattgctggacaccatc taggacgctgtgacatcaaggacctgcctaaagaaatcactgttgctacatcacgaa cgctttcttattacaaattgggagcttcgcagcgtgtagcaggtgactcaggttttgc tgcatacagtcgctacaggattggcaactataaattaaacacagaccattccagtagc agtgacaatattgctttgcttgtacagtaa
[0050]
密码子优化后的sars-cov-2s基因的核苷酸序列为：
[0051]
atgtttgtttttcttgttttattgccacttgtctctagtcagtgtgttaatcttacaacc agaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctga caaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttctttt ccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtt tgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtcta acataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctact tattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatga tccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagtt cagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttctta tggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaaga atattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatc tccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatc actaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttc ttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggact tttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttg accctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatct atcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatatt acaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatg cttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattc cgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctct gctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaat cgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgatttta caggctgcgttatagcttggaactctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattat aattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttc aactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgt tactttcctttacaatcatacggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccata cagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacct aaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaa caggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttg gcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattc ttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatac ttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgct attcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttt tcaaaca
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[0052]
1.4.3重组质粒ems质粒的构建将e基因插入pp10启动子后多克隆位点mcs1 kpni、 xhoi双酶切位点之间，m基因插入pph启动子后多克隆位点mcs2 bamhi、ecori双酶切位点之间，s基因插入pph启动子后多克隆位点mcs3 ndei、hindiii双酶切位点之间，形成e-m-s结构，构建ems三表达质粒。以上三表达载体改造、设计由本申请发明人完成，基因合成、插入载体由华大基因完成。
[0053]
1.4.4杆粒获得及鉴定获得ems质粒后，将其转化入top10感受态细胞。重新提取重组质粒，42℃、60s进一步转化至dh10 bac
tm
大肠杆菌感受态细胞，37℃、250rpm培养3h后涂至含卡那霉素50ug/ml、庆大霉素7ug/ml、四环素10ug/ml、x-gal 200ug/ml、 iptg 40ug/ml的lb固体平板，48h后平板长出蓝白斑，挑选白色、大菌落重新在上述平板上进行第2次涂板筛选，挑选白色阳性克隆，过夜培养后1：100接种至新培养基继续培养12h，提取重组杆粒。ems重组杆粒进行pcr鉴定及测序鉴定，所用引物见表1。
[0054]
表1重组杆粒pcr鉴定引物
挑选白色、大菌落经2次筛选，获得白色转座菌落(图2b)。挑选阳性菌落培养后提取杆粒，对e、m、s基因及插入片段进行pcr鉴定，可在相应位置获得目的条带(图3)，并送华大测序，序列一致。
[0070]
图2为ems三表达质粒转座及二次筛选。其中，a为ems三表达质粒转座；b为转座后二次筛选。
[0071]
图3为重组杆粒pcr鉴定结果。其中，a图1，2，3e基因pcr；4，5，6m基因 pcr；b图1，2s基因pcr；c图1，2s
’
段pcr鉴定。
[0072]
2.3 ems转染，感染，表达过程中细胞变化
[0073]
在病毒加入到细胞后，细胞会出现肿胀，细胞核变大(图4)，台盼蓝染色后观察细胞死亡率，与正常细胞相比可以看到细胞出现感染状态，荷包蛋样形态，表明重组杆状病毒包装成功。
[0074]
图4为expisf9
tm
细胞病变图。其中，a：正常expisf9
tm
昆虫细胞(
×
10)；b：感染杆状病毒expisf9
tm
昆虫细胞(
×
10)；c：感染杆状病毒expisf9
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昆虫细胞(
×
40)。
[0075]
2.4 western blot和透射电镜鉴定ems表达结果
[0076]
western blot结果显示，ems vlp与s全长兔抗发生免疫反应，并且出现了大小为 130kda蛋白条带(图5)。为了鉴定ems是否形成病毒样颗粒，通过透射电镜观察，结果观察到直径约80～120nm颗粒物(图6)，转染后的ems成功装配成sars-cov-2病毒vlps。
[0077]
图5为s蛋白wb鉴定结果。其中，1为s蛋白wb鉴定；m蛋白maker。
[0078]
图6为ems vlps透射电镜观察结果图。
[0079]
讨论
[0080]
sars-cov-2病毒在肆虐全球，急需开发疫苗遏制病毒传播。目前，sars-cov-2相关传统疫苗及新一代疫苗均在研发中，但还未有一种有效的疫苗批准使用。
[0081]
vlps由于其独特的优势在疫苗开发中越来越受到重视。sars-cov-2、sars-cov、 mers-cov均属于β冠状病毒，其基因组结构相似，并编码4种主要结构蛋白n、e、m、 s，其中e、m、s蛋白可形成vlps。eduardo mortola等通过杆状病毒-昆虫表达系统在 sf9细胞内共表达e、m、s蛋白后，自主装形成vlps，在大小和颗粒形态上与sars-cov 非常相似。xinya lu等证实sars-cov vlps具有免疫原性，可以在小鼠中引起强烈的 sars-cov vlps特定的体液和细胞免疫反应。同样昆虫细胞中mers cov e、m和s重组杆状病毒的共感染产生与mers-cov病毒粒子相似的形态的vlps。mers-cov vlp 在恒河猴中具有出色的免疫原性，接种了mers-covvlp和明矾佐剂的恒河猴诱导高效价的病毒中和抗体，mers-covvlp还引发了t辅助1细胞(th1)介导的免疫。
[0082]
本发明将双表达载体pfastbacdual改造为三表达载体，并将e、m、s基因插入三表达载体，通过测序鉴定。将ems载体转化入dh10 bac
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感受态细胞，转座后获得重组杆粒，提取杆粒后进行pcr鉴定，并测序成功。重组杆粒转染expisf9
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后获得重组杆状病毒，病毒感染expisf9
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后同时表达e、m、s蛋白，经胞内自组装形成vlps，western blot 证实vlps正确表达，透射电镜证实其形态、大小，本发明获得vlps大小、形态与 sars-cov-2病毒相似。目前，国内外尚未见到sars-cov-2vlps研究，通过本发明首次成功获得了sars-cov-2vlps。建立了sars-cov-2vlps制备和鉴定方法，为重组 sars-cov-2vlps疫苗的开发建立了技术平台。
[0083]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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