一种针对PD-L1的纳米抗体及其应用的制作方法

一种针对pd-l1的纳米抗体及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及一种针对细胞程序性死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)的纳米抗体及其编码序列与应用。


背景技术：

[0002]
pd-l1是大小为40kda的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，与免疫系统的抑制有关。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性t细胞(cd8+tcell增生)。而细胞程序化死亡受体-1(pd-1)与细胞程式死亡-配体1(pd-l1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，而且pd-1还可以借由调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。
[0003]
pd-1是一种重要的免疫抑制分子，为cd28超家族成员，其最初是从凋亡的小鼠t细胞杂交瘤2b4.11克隆出来。以pd-l1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。pd-1抗体可以阻止pd-l1与pd-1结合用来解除肿瘤细胞抵御功能。一旦肿瘤细胞被pd-1抗体攻击后，免疫细胞就可以击破肿瘤细胞。因而，pd-1抗体的抗肿瘤作用是广谱的。目前，pd-1抗体的临床试验包括肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌和脑肿瘤等。pd-1抗体可以控制50％的皮肤癌病人的癌症进展，治愈10％左右的皮肤癌病人，对于非小细胞肺癌病人也有24％的临床控制效果。但是，目前pd-1抗体主要来自动物细胞制备的单克隆抗体，这样就使得制备成本高，制备过程较为繁琐，同时由于杂交瘤自身的特点会导致每个批次间容易产生差异。
[0004]
纳米抗体是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子，来自于骆驼血液中的天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的单链抗体可变区。最初是由hamers在研究骆驼血液的实验中发新的。纳米抗体的分子量通常只有15kd，化学性质稳定，可溶性高，容易表达，并且能够偶联其他分子(例如核素)，因此应用纳米抗体技术研发抗肿瘤药物具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种针对pd-l1的纳米抗体及其应用。本发明的纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于检测试剂及靶向药物的开发。
[0006]
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]
一种针对pd-l1的纳米抗体的vhh链，包括框架区fr和互补决定区cdr，所述框架区fr包括fr1～fr4的氨基酸序列，互补决定区cdr包括cdr1～cdr3的氨基酸序列，其中：fr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.3所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.4所示，cdr1的氨基酸序列seq id no.5所示，cdr2的氨基酸序列seq id no.6所示，cdr3的氨基酸序列seq id no.7所示。
[0008]
一种针对pd-l1的单域抗体vhh链，其具有seq id no.8所示的核苷酸序列，seq id no.9所示的氨基酸序列。
[0009]
一种pd-l1纳米抗体，其是针对pd-l1表位的纳米抗体，包括两条具有seq id no.9所示的氨基酸序列的vhh链，可应用在制备pd-l1检测实际方面。
[0010]
一种dna分子，其编码选自下组的蛋白质：pd-l1的纳米抗体的vhh链或pd-l1的纳米抗体。
[0011]
一种表达载体，其含有seq id no.8所示的核苷酸序列。
[0012]
一种宿主细胞，其可以表达pd-l1纳米抗体。
[0013]
本发明利用筛选得到的pd-l1抗原特异性纳米抗体用于肿瘤治疗药物中。
[0014]
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
[0015]
纳米体是位于重链上的单可变域抗体，也称为vhh抗体。纳米体与基因工程方法相兼容，允许对纳米抗体框架和氨基酸的改变来改善结合能力。纳米体与传统抗体相比，具有分子质量小、水溶性好、高耐性、稳定性强、低免疫原性、较强的组织穿透力、高表达性、抗原识别能力强、易于生产等特点。并且因纳米抗体分子量小、结构简单，由单一的基因编码，在极端的温度和ph值下仍可保持稳定性，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用，因此在生物技术和医学应用方面比其他抗体具有优越性。
附图说明
[0016]
图1是编码纳米抗体的dna电泳图，m为分子量marker，1为pcr产物，条带约600bp，1-13为pd-l1纳米抗体；n为阴性对照。
[0017]
图2是pd-l1特异性的纳米抗体，经过层析纯化和aktaexpress纯化后的sds-page电泳图(a)和western blot图(b)，其中m为分子量标记，单位kd，1表示pd-l1纳米抗体。
[0018]
图3是应用pd-l1纳米抗识别pd-l1的酶联免疫吸附实验(elisa)结果。
具体实施方式
[0019]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0020]
本发明首先制备及纯化pd-l1抗原，将其免疫骆驼，制备pd-l1特异性的纳米抗体文库，然后将纯化后的pd-l1偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选高亲和力的pd-l1特异性纳米抗体，并将其转入大肠杆菌tg1，建立纳米抗体表达体系。
[0021]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的技术方案。
[0022]
实施例1
[0023]
本实施例按照如下步骤构建pd-l1特异性纳米抗体文库：
[0024]
(1)首先表达纯化pd-l1，然后将1mg pd-l1抗原与费氏佐剂等体积混合，免疫一只骆驼，每周一次，共免疫7次，刺激b细胞表达特异性的纳米抗体；
[0025]
(2)经过7次免疫结束后，提取100ml外周血淋巴细胞，并提取mrna；
[0026]
(3)合成cdna扩增vhh；
[0027]
(4)利用限制性内切酶pst i，noti酶切20μg噬菌体展示载体及10μl vhh，连接两个片段；
[0028]
(5)将连接产物转化至感受态tg1，构建pd-l1纳米抗体文库并测定库容，库容大小为8.0
×
10
9
。
[0029]
实施例2
[0030]
本实施例按照如下步骤筛选pd-l1特异性纳米抗体：
[0031]
(1)将溶解在100mm nahco
3
、ph8.2的20μgpd-l1包被在nunc酶标板上，4℃放置过夜；
[0032]
(2)第二天加入100μl 3％milk，室温封闭2h，室温封闭2h，加入100μl 3
×
10
11
滴度的文库噬菌体；
[0033]
(3)第一轮淘选用含有0.05％tween20的tbst洗10遍/第二轮洗20遍/第三轮清洗20遍，清洗掉非特异性结合的噬菌体：
[0034]
(4)用100mmtea洗脱结合的噬菌体，并感染处于对数生长期的tg1，37℃培养1h，产生并纯化用于下一步侵染的噬菌体，继续筛选，逐步得到富集。
[0035]
实施例3
[0036]
本实施例用噬菌体的酶联免疫吸附法诗选特异性的单个阳性克隆，步骤如下：
[0037]
(1)从实施例2中4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单克隆菌并接种于含有100μg/ml的氨苄霉素的lb培养基中，生长到对数生长期后，加入终浓度为1mm的iptg，28℃培养过夜；
[0038]
(2)利用渗透法获得粗提的抗体，并将抗体转移到经过抗包被的elisa板中，室温下放置1h；
[0039]
(3)用tbst洗去未结合的抗体，加入mouse anti-ha抗体，室温下放置1h；
[0040]
(4)用tbst洗去未结合的抗体，加入anti-mouse-hrp；
[0041]
(5)用tbst洗去未结合的抗体，加入tmb显色液，在酶标仪上450nm波长读取吸收值；
[0042]
(6)当样品od值大于对照值2倍以上时，判断为阳性克隆；
[0043]
(7)当阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ml的氨苄霉素的tb培养基，提取质粒进行测序；根据测序结果，应用snapgene软件分析每种克隆，把cdr1、cdr2和cdr3序列相同的株视为同一克隆，而不同的视为不同克隆株。筛选得到的特异性特异性pd-l1纳米抗体的vhh链的核苷酸序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.9所示。vhh链的氨基酸序列由框架区fr和互补决定区cdr组成，所述框架区fr包括seq id no.1所示的fr1，seq id no.2所示的fr2，seq id no.3所示的fr3，seq id no.4所示的fr4；所述互补决定区cdr包括seq id no.5所示的cdr1，seq id no.6所示的cdr2，seq id no.7所示的cdr3。
[0044]
其中fr1～fr4和cdr1～cdr3的序列如下所示：
[0045]
fr1：qvqlqesggglvqagaslrlscatsa。
[0046]
cdr1：kjuebdygdfdy。
[0047]
fr2：qapgkefvarisrsg。
[0048]
cdr2：greyddvvya。
[0049]
fr3：grftisrdtaksvvylqmnslkpedtaiyy。
[0050]
cdr3：caiiddytvaf。
[0051]
fr4：eradywgqgtqvtvss。
[0052]
基于vhh链的核苷酸序列和氨基酸序列，还可以得到以下产物：
[0053]
一种pd-l1纳米抗体，它是针对pd-l1表位的纳米抗体，包括两条具有seq id no.9所示氨基酸序列的vhh链。
[0054]
一种dna分子，它编码选自下组蛋白质：上述针对pd-l1的纳米抗体的vhh链，或上述pd-l1纳米抗体。
[0055]
一种表达载体，它含有seq id no.8所示的核苷酸序列。
[0056]
一种宿主细胞，它可以表达pd-l1纳米抗体。
[0057]
实施例4
[0058]
应用筛选得到的特异性pd-l1纳米抗体进行酶联免疫吸附检测，步骤如下：
[0059]
为检测所筛选得到的特异性pd-l1纳米抗体是否能识别pd-l1抗原，将pd-l1抗原(2μg/ml)加入96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜；用tbst洗3次，后用3％脱脂乳封闭酶标板，37℃作用1h，用tbst洗3次，加入不同稀释浓度的pd-l1纳米抗体，37℃作用2h；tbst洗3次，加入hrp标记的抗ha鼠抗体，作用1h，tbst洗3次，加入tmb后检测，并用构建的纳米抗体作为阴性对照。
[0060]
图1和图2说明本发明成功扩增了pd-l1的dna序列，并通过能够特异性识别pd1抗原的pd1单域抗体。如图3所示，pd-l1纳米抗体可以特异性的识别pd-l1，而阴性对照纳米抗体则与pd-l1无反应，说明本发明提出的pd-l1纳米抗体为进一步开发pd1检测试剂盒和抗肿瘤药物奠定了基础。
[0061]
上述实施例只是对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0062]
[0063]

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