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2021-02-02 13:02:26|
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起点商标网 专利名称：疟疾疫苗的制作方法
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本发明涉及抗疟原虫属(Plasmodium)寄生物感染的疫苗，更具体地说，涉及作为抑制疟原虫感染治疗剂的多肽，该多肽包含来自一个疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域(该区域位于其中央重复区侧面)的致免疫表位决定簇并且含来自该重复区的重复性致免疫决定簇(含量比总数少);本发明还涉及给人医治疟疾感染的方法。
总的来说，本发明涉及一种多肽，该多肽含有一个或多个来自位于疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的中央重复区侧面的第一区域的致免疫决定簇，和一个或多个来自位于该重复区侧面的第二区域的致免疫决定簇，并且也含较少(少于全部总数)来自该中央重复区的重复致免疫决定簇，或者根本不含有。
在一个实施例中，本发明涉及一种多肽，该多肽含有至少一个但不是所有的疟原虫(Plasmodium)属的表面蛋白重复区的重复致免疫决定簇以及一个或多个来自位于该重复区侧面的疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域的致免疫决定簇。
在本发明另一个实施例中，该多肽实质上含有全部来自位于中央重复区的侧面区域的致免疫决定簇，而缺失来自该中央重复区的致免疫决定簇。另一方面，实质上含有来自侧面区域的所有致免疫决定簇的多肽进一步包含至少一个(但不是所有)来自该中央重复区的致免疫决定簇。
用于本发明的多肽的致免疫决定簇优选包括那些存在于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，间日疟原虫(P.Vivax)，三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.Ovale)的表面蛋白中的致免疫决定簇。
而在本发明的又一实施例中，通过遗传手段将该多肽与一载体蛋白融合，优选的载体蛋白或是能加强该多肽的表达或能加强该多肽的免疫原性，或兼有两种作用。
在一个优选实施例中，本发明的多肽包含一个致免疫载体蛋白，例如借助一个合成连接子，流感病毒非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸(NSl81)与疟原虫(Plasmodium)环生子孢子(CS)蛋白的第一侧面区域融合，得到的融合蛋白自身与该CS蛋白的第二个侧面区域融合。
这样的多肽可进一步包括一个以上，但不是所有的来自该CS蛋白中央重复区的致免疫决定簇，例如，含有一个四肽的来自重复区的致免疫决定簇(其氨基酸序列为天氡酰胺-X-Y-脯氨酸，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天冬酰胺或天冬氨酸)。可将来自中央重复区的致免疫决定簇定位，例如，定位于载体蛋白和第一个侧面区域之间或者位于第一个侧面区域和第二个侧面区域之间。
本发明另一方面包括编码该多肽的表达载体，含该多肽的疫苗;纯化该多肽的方法;以及利用该肽对抗人体疟疾感染的治疗方法。
本发明的其他方面和优点公开于下文的详细描述中。
下面的氨基酸缩写用于本专利申请中Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸
Cys胱氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Gly甘氨酸His组氨酸Ile异亮氨酸Leu亮氨酸Lys赖氨酸Met蛋氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val缬氨酸疟原虫原生动物，疟原虫属(Plasmodium)，含有许多阶段-特异性蛋白，存在于它的外侧细胞表面。已发现这些表面蛋白质有三个共同区域，即中央重复表位决定基区(或领域)以及成对的侧面区。配对区的第一个侧面区域与中央重复区的羧基端融合，配对区的第二个侧面区域与该中央重复区的氨基端融合。
本发明多肽来自于疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的一部分，该部分含较少(少于全部总数)，或不含位于第一和第二侧面区域之间的中央重复区的致免疫决定簇，且本发明的多肽被大量充分表达以用作治疗抑制疟原虫感染。
换句话说，本发明的多肽具有的位于第一和第二侧面区域之间的串联重复少于存于野生型重复区域内的此类重复数。因此，对于用作预防人体免受恶性疟原虫(P.falciparum)感染的多肽，可包括完整的第一侧面区域，即恶性疟原虫(P.falciparum)环生子孢子蛋白(PfCSP)的N-末端侧面区域，完整的第二侧面区，即来自PfCSP的C末端侧面区域，以及来自PfCSP的第一和第二侧面区域之间的区域，少于41个串联重复单位，即少于41个通式为Asn-X-Y-Pro的四肽，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天氡氨酸或天氡酰胺。
在一种野生型疟原虫(Plasmodium)表面蛋白中，重复区域呈免疫显性。在本发明多肽中，串联重复的数目和定位或重复单元数的选择以不阻碍对第一和第二侧面区域的免疫应答为准。优选的是，本发明多肽的重复区数目不超过野生型蛋白中存在的重复区数目的一半。更优选的是，本发明多肽的重复区数目不超过野生型蛋白中存在的重复区数目的四分之一。
已知疟原虫(Plasmodium)属的四个种侵染人体，最流行的是恶性疟原虫(P.falciparum)，其次是间日疟原虫(P.Vivax)，更小程度的是三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.Ovale)。
恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)子孢子阶段环生子孢子(CS)蛋白的中央重复区域是由41个四肽串联重复连接组成，其中31个四肽氨基酸序列为天氡酰胺(Asn)-丙氨酸(Ala)-Asn-脯氨酸(Pro)，其中4个四肽氨基酸序列为Asn-缬氨酸(Val)-天氡氨酸(Asp)-Pro。在中央重复区的一侧是含有区域Ⅰ和区域Ⅱ的侧面区域，该CS蛋白的两个区域在氨基酸序列上几乎等同于所有疟原虫种如P.knowlesi(一种猴疟疾)CS蛋白质(Dameetal.，Science，2255931984)的对应区域。
恶性疟原虫(P.falciparum)嗜血阶段的各种表面蛋白质也具有重复抗原决定基，例如，S抗原(Pro-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Gly-Leu-Glu-Asp);RESA抗原(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala);FIRA抗原(Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro);和PF-11抗原(Glu-Glu-Val-Val-Glu-GLu-Val-Val-Pro)。
间日疟原虫(P.Vivax)的环生子孢子蛋白含有重复抗原决定基(Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala)，三间疟原虫(P.malariae)的环生子孢子蛋白含有重复抗原决定基(Asn-Asp-Ala-Gly)和(Asn-Ala-Ala-Gly)本发明多肽包含一个或多个来自疟原虫属(Plasmodium)表面蛋白的位于中央重复区侧面的第一区域的致免疫决定簇，和一个或多个来自位于重复区侧面的第二区域的致免疫决定簇，以及包含较少来自中央重复区的重复致免疫决定簇(数量少于全部总数或者完全不含)。
致免疫决定簇系能诱发一种B细胞或T细胞应答的氨基酸序列。一般地说，致免疫决定簇至少含有6个氨基酸。
利用经典技术包括单克隆抗体图谱分析和/或缺失氨基酸然后活性检测的方法可对一种蛋白质的致免疫决定簇进行精确识别。优选的是，本发明多肽含有来自第一或第二侧面区域的至少各15个氨基酸;更优选的是，至少约30个;最优选的是，整个第一和第二侧面区域，但缺失信号序列。
在一个实施例中，本发明多肽含有至少一个(但不是全部)来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白中央重复区的致免疫决定簇以及一个或多个来自于重复区侧面的表面蛋白的区域的致免疫决定簇。
在另一个实施例中，本发明多肽本质上含有来自位于中央重复区侧面的各区域的所有致免疫决定簇而缺少来自中央重复区的致免疫决定簇，或者含有来自中央重复区的至少一个(但不是全部)致免疫决定簇。“本质上全部”意指实际上采用整个的第一和第二侧面区域，但小于信号序列;优选的是，从每一区域中缺失不超过约20个氨基酸，更优选的是，利用整个第一和第二侧面区域，而小于信号序列。
本发明另一个实施例涉及一种多肽，该多肽包含来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及包含较少(少于全部总数)或不包含来自两侧面之间的重复区的重复致免疫决定簇，其中至少一个来自第一侧面区域的所说的致免疫决定簇具有下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
或者是该序列的功能等同物。
本发明的又一实施例涉及一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及含有较少(不是全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复致免疫决定簇，其中来自第二侧面区域的所说致免疫决定簇中至少一种是由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或是该序列的功能等同物。
本发明的再一实施例涉及一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇。以及含有较少(少于全部)或者不含有来自两侧面之间重复区的重复致免疫决定簇，其中来自第一侧面区域的至少一个所说致免疫决定簇由下列氨基酸编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
以及其中来自第二侧面区域的至少一个所说致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;
或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或其功能等同物。
本发明的更进一步实施例涉及一种多肽，该多肽包含来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的重复区的非全部(或不包含)重复致免疫决定簇以及至少一个由下列氨基酸序列编码的肽Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或该序列的功能等同物。
本发明的再一实施例涉及一种预防人体受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的疫苗，该疫苗含有免疫予防量的本发明多肽和治疗学上可接受的载体。本发明还涉及给需要预防疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的人体免疫的方法，包括给这类人体施用有效的，非毒性量的此种疫苗。
优选的是，本发明多肽是一种杂交多肽，即一种由疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的一部分和一种载体蛋白之间的遗传或化学融合组成的蛋白质。
更优选的杂交多肽含有一种与恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环生子孢子(CS)蛋白的一部分遗传融合的载体蛋白。其中的环生子孢子蛋白含有(不足全部)或缺失含在中央重复区的重复四肽。
特别优选的是那些杂交多肽，其中与之化学融合的载体蛋白是一种增强免疫的大分子，如(但不限于此)已灭活的博德特氏菌(Bordetella)，破伤风类毒素，白喉毒素和霍乱B毒素。
特别优选的是另一些杂交多肽，其中与之遗传融合的载体蛋白不仅加强携带的多肽的免疫原性而且也可通过转化体增强该多肽的表达。该载体蛋白的其他合乎要求的性质包括促进多肽的纯化或配制。这样的载体蛋白的例子有肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)，NSl81〔流感病毒(A/PR/8/34)非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸〕(Baez et al.，Nucleic Acids Research，85845 1980);R32(〔(Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn-Val-Asp-Pro)〕2)(Young et al.，Science，228958 1985);和galk。
根据本文公开的内容，利用常规的遗传工程技术或常规的肽合成技术，本领域内任一熟练技术人员可制备本发明多肽。
本文列举本发明的多肽类型的特异性例子包括NSl81-RLf△9，一种融合多肽，其中含一种流感病毒非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸(NSl81)，含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白的侧面区域但缺失信号序列的区域Ⅰ(18个N-末端氨基酸)以及含有侧面区域但缺失起端的9个N-末端氨基酸的区域Ⅱ(RLf△9)。借助一个编码-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-的合成DNA连接子序列可促进NSl81与RLf△9的融合。
NSl81-RLfAuth，一种融合多肽，其中含NSl81;并含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白质的侧面区域但缺失信号序列的区域Ⅰ以及含有侧面区域的完整区域Ⅱ(RLfAuth)。
NSl81-(Asn-X-Y-Pro)n-RLfAuth，一种融合多肽，其中含NSl81;RLfAuth和(Asn-X-Y-Pro)，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天氡酰胺或天氡氨酸，n是大于或等于1且小于或等于100的一个整数，优选的是小于50。而且，(Asn-X-Y-Pro)定位于NSl81和RLfAuth之间。
NSl81RLfAuth+(Asn-X-Y-Pro)n，一种融合多肽含NSl81;RLfAuth和(Asn-X-Y-Pro)，其中X和Y的定义与上文相同，n小于41;并且这里的(Asn-X-Y-Pro)定位于含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白的侧面区域的区域Ⅰ和含侧面区域的区域Ⅱ之间，即该区域先前是中央重复区所处的位置。
特异性例子还包括下列肽，已鉴定出为恶性疟原虫(P.falciparum)的子孢子中和抗原决定基
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;
Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
仅列出这些多肽作为例证。根据本文提供的公开内容，本领域内任一熟练技术人员将懂得怎样构建和测试属于本发明领域内的其他多肽，例如，含有来自表面蛋白序列的多肽，包括除恶性疟原虫(P.falciparum)以外的各种疟原虫的环生子孢子蛋白、含有或多或少来自表面蛋白的氨基酸的多肽、经化学改性的多肽、以及与其他的或附加的氨基酸或蛋白质序列融合的多肽。利用遗传工程和/或蛋白质合成的标准技术很容易构建这些多肽，且利用基本上如下文描述的方法在动物模型上测试这些多肽。例如，本发明的一种蛋白质可含有来自表面蛋白侧面区域的氨基酸序列，如缺失中央重复区的基本上完整的环生子孢子蛋白，融合于一融合蛋白(可形成杂交HBsAg颗粒)中的肝炎B病毒表面抗原，正如欧洲专利申请，(申请号EP278，940
公开日1988年8月17日)所描述的。
利用已知技术本领域内任一熟练技术人员很容易获得表面蛋白侧面区域，四肽，合成DNA连接子序列以及载体蛋白的遗传编码序列。这些技术包括合成法，并优选通过信使RNA的逆转录或通过基因组DNA的完整基因直接克隆，以及通过常规的聚合酶链反应(PCR)技术，产生特异性序列。Ellisetal.在Nature，302536(1963)中描述了恶性疟原虫(P.falciparum)信使RNA的逆转录。Dameetal.(引用文献同上文)描述了恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA的完整基因的直接克隆。在欧洲公开专利申请No.86870014，7(申请日1990，2，3，该文公开内容作为本文参考文献)中描述了含有重复区的多肽的克隆和表达。
经克隆整个或部分疟原虫(Plasmodium)DNA，编码整个或部分表面蛋白的该DNA片段可由已知技术制备。
合成DNA的技术是已知的且利用商业上可购买的DNA合成器完全该合成过程。
可将多肽的编码序列插入E.Coli表达载体，许多这样的表达载体是已知的且容易获得。在E.Coli中实施本发明时，将一个编码本发明多肽的DNA序列有效地连接到一个转化大肠杆菌的DNA载体中的调节因子上。许多含有这样的调节因子的革兰氏阴性细菌表达载体可利用。该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可控制的，即可诱导型或可阻遏型启动子。各种有用的启动子可用于在E.Coli中表达异源多肽。这样的启动子包括色氨酸启动子和λPL启动子(例US专利号4，578，355和Courtney et al.，Nature，313149 1985)。下文将对此进行更详细描述，已发现利用E.Coli表达载体pMG-1尤其适用于表达编码本发明多肽的编码序列。编码除NSl81外的载体蛋白，例如R32和galkPMG-1的衍生物也具有优势。
在链霉菌(streptomyces)中实施本发明，将编码本发明多肽的一个DNA编码序列有效地连接到一个转化链霉菌的DNA载体中的调节因子上。该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选可控制的，例如，可诱导型或可阻遏型启动子。各种有用的启动子可有效地在链霉菌(streptomyces)中表达异源多肽。具体例子包括链霉菌(streptomyces)半乳糖操纵子的半乳糖-诱导型启动子(Fornwald，etal.，ProcNatl.Acad.Sci.USA842130(1987))、S.lividansβ-半乳糖苷酶基因(Eckhardt，etal.，J.Bacteriol.1694249(1987)及Brawner，etal.，(美国专利4，717，666)和S.longisporus胰蛋白酶抑制基因(欧洲专利申请号87307260.7)的组成型启动子、或是一个短暂调节启动子如在M.echinospora中报道的(Baum，etal.，J.Bacteriol17071(1988))。链霉菌(streptomyces)转录终止区来源于几种链霉菌(streptomyces)基因的3′末端，例如链霉菌(streptomyces)半乳糖操纵子末端的终止信号，或者在S.fradiae新霉素磷酸转移酶基因末端发现的终止信号(ThompsonandGray，Proc.Natl.Acad.SciUSA805190(1983))。在链霉菌(streptomyces)中蛋白质输出序列包括从S.lividansβ-半乳糖苷酶基因、S.lividansLEP-10基因(欧洲专利申请No.87307260.7)和S.longisporus胰蛋白酶抑制基因中分离到的序列。
将编码本发明多肽的基因整合到一个较大的DNA分子上，该DNA分子含有一个遗传选择性标记系统。该选择性标记系统可以是许多已知标记系统中的任一种，以便标记基因授与已转化的细胞一个可选择的新表型。这些例子有链霉菌(streptomyces)抗药性基因如抗硫链丝菌肽核糖体甲基酶(Thompson，etal.，Gene2051(1982))、新霉素磷酸转移酶(Thompson，etal.，同上文)和抗红霉素核糖体甲基酶(Thompson，etal.，同上)。该DNA分子也可以含有链霉菌(streptomyces)的一个自主复制序列，如pIJ101的衍生物(Keiser，etal.，Mol.Gen.Genet.185223(1982))或一个由SLP1衍生的载体(Bibb，etal.，Mol，Gen.Genet184230(1981))。该DNA分子还可含有一个允许基因扩增的标记。对在链霉菌(streptomyces)中扩增基因拷贝数有用的这样的标记包括壮观霉素抗性基因(Hornemann，etal.，J.Bacteriol1692360(1987))和精氨酸营养缺陷型基因(Altenbuchner，etal.，Mol，Gen.Genet，195134(1984))。
在酵母中实施本发明时，将编码本发明多肽的一个DNA编码序列有效地连接到一个调节因子上，该调节因子位于可转化酵母的一个DNA载体中。可有效地转化，克隆和具表达系统的任何酵母寄主均可使用。特定的例子包括汉逊氏酵母属(Hansenula)毕赤氏酵母属(pichia)，克鲁维酵母属(Kluveromyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和假丝酵母属(Candida)和酵母菌属(Saccharomyces)的酵母。优选的酵母寄主是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可控制的，即可诱导型或可阻遏型启动子。各种有效的启动子可用于在酵母中表达异源多肽。这样的实例有铜诱导性金属硫堇基因(CUP1)启动子和糖解基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)和乙醇脱氢酶(ADH)的组成型启动子。酵母的转录终止区域来源于于几种酵母基因任何一种如异-1-细胞色素C(CYC1)的3′末端。
将编码本发明多肽的基因整合到一个含有一个遗传选择性标记系统的一个较大DNA分子上。该选择性标记系统可以是许多已知的标记系统中的任一种，以便标记基因授与被转化细胞一种可选择的新表型。例子包括编码生物合成酶如磷酸核糖氨茴酸盐异构酶(TRP1)或乳精酶核苷-5′-磷酸脱羧酶(URA3)的酵母基因或异源药物抗性基因如G418抗性或磷酸核糖氨茴酸盐异构酶(TRP1)或磷酸核糖抗性(BEN1)。该DNA分子也可以含有酵母的一个自主复制序列，例如酵母2微米环的ori区域或一个染色体自主复制区(ARS)如ARS1，以及一个酵母的着丝粒(CEN)如CEN3，以便质粒进行自主复制。
另有一些表达系统是已知的且容易利用。例如，各种昆虫细胞及其表达系统可有效地表达异源蛋白，如用于在鳞翅目细胞中表达异源蛋白的杆状病毒表达系统。如果需要在真核表达系统中实现表达时，必须使表面蛋白羧基末端的锚形区域缺失。例如缺失392-412位氨基酸，包含恶性疟原虫(P.falciparum)羧基末端锚形区域的序列是符合要求的。
另一个典型的表达系统涉及一种沙门氏菌属(Salmonella)细菌菌株，该菌株已用与一个E.Coli启动子序列有效连接的一个经选择的异源基因转化，该转化体能以组成型方式表达该异源基因产物。
利用经典蛋白质分离技术从产生的细胞培养物中分离和纯化以这种方式表达的多肽，这些技术是本领域内熟知的。一个典型的有效的纯化方案包括(1)细菌细胞的破碎，(2)澄清细胞碎片，(3)从已澄清的细胞抽提物中存在的其他多肽中分离本发明的多肽，(4)最后纯化步骤除去残留的污染物，包括残留的多肽，碳水化合物、核酸、脂多糖和内毒素。
对于本发明疫苗，可直接利用该多肽的一种水溶液，优选于生理PH中加以缓冲者。另一方面，该多肽也可与许多已知佐剂中任一种混合或吸附。这些佐剂包括，例如，氢氧化铝、胞壁酰二肽和皂甙如QuilA。另一个实例是，可将该多肽包裹于微粒体如脂质体中。在又一实施例中，借助常规技术，可将本发明多肽结合到一种免疫增长性大分子上，如灭活的博德特氏菌属(Bordetella)或破伤风类毒素，白喉毒素或霍乱B毒素。
NewTrendsandDevelopmentsinVaccines，(Volleretal.，Eds.，UniversityParkPress，Baltimore，MD，USA(1978))一书中对疫苗制剂作了一般性描述。在美国专利No.4，235，877中Fullerton描述了脂质体包裹。在Likhite的美国专利No.4，372，945和Armor等人的美国专利No.4，474，757中公开了蛋白质与大分子的结合。QuilA的利用由例如，Dalsgaardetal.，在ActaVet.Scand.，18349(1977)中公开。
在每一疫苗剂量中含有的多肽的量是诱导一种没有明显有害副作用的免疫予防性应答所需的量。该量系根据所用的特异性多肽和该疫苗是否含有佐剂而变化。大体上说，每一剂量需含有1-1000μg的多肽，优选10-200μg。一种特定疫苗的最佳量可通过标准研究法，包括观察抗体滴定度和试验对象产生的某些反应而确定。在第一次接种后，较好是在约4周后，再给试验者加强接种一次，以后只要存在有感染的危险，每过6个月加强接种一次。
一般优选通过肌肉内，皮下或静脉内途径将该试剂施用给病人，虽然在某些情况下，可通过其他途径。例如，当利用重组体沙门氏菌属(Salmonella)菌时，优选的施药途径是通过口服。
下列实施例解释本发明，而不是为了限制本发明。CS蛋白质编码序列由JamesWeber，WalterReed军事研究院提供，该序列作为一个含2337碱基对的λmPF1，EcoRI片段(Dameetal.，Science225593(1984))连接到pUC8的EcoRI位点上，是一种标准的E.Coli克隆载体(例如，可从Bethesda研究实验室，Inc.，GaithersburgMD获得)。得到的pUC8衍生物称为pUC8克隆1。
实施例1pNSl81RLf△9的构建简单说来，可按下述方法构建pNSlRLf△9用限制性核酸内，切酶FokⅠ消化第一等份pCSP(见下文所述)-一个含有编码恶性疟原虫(P.falciparum)环子孢子(CS)蛋白质之大约前18个氨基酸的1216碱基对大肠杆菌表达载体、充填末端(Klenow片段)并用限制性核酸内切酶BamHI消化之。用电洗脱法回收编码CS蛋白质之氨基酸19(Leu)至123(Pro)的318碱基对片段。
用限制性核酸内切酶TthlllⅠ消化第二等份pCSP，充填末端并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码CS蛋白质之氨基酸297(Gly)至412(Asn)的655碱基对片段。(该序列缺少含区域Ⅱ之侧接区的9个N末端氨基酸，即氨基酸288(Pro)至296(Gln))。
将318碱基对和655碱基对CS蛋白质基因片段连接到已用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化的大肠杆菌表达载体pUC18(见下述)中。所得载体定名为pUCRLf△9。
用限制性核酸内切酶BamHI消化pUCRLf△9，充填末端，并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码CS蛋白质氨基酸19至123和297至412的1035碱基对片段。用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化含有编码流感病毒非结构蛋白质1之N末端氨基酸1(Met)至81(Met)的DNA片段和合成DNA接头序列的表达载体pMG-1(详见下文所述)。然后将此前由pUCRLf△9中分离的1035碱基对片段连接到pMG-1中。所得表达载体pNSl81RLf△9编码具有下列序列的蛋白质NSl61-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412
有关pNSl81RLf△9的构建详述如下。
A.pCSP的构建在400μl培养基缓冲液(含有50mM Tris、50mM NaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)、和10mM MgCl2，PH7.5)中，37℃下用限制性核酸内切酶Stu Ⅰ和RsaⅠ(各100单位)将纯化的pUC8克隆1质粒DNA(40μg)消化1.5小时。在6%聚丙烯酰胺凝胶上用PAGE法分离所得到的编码环子孢子(CS)蛋白质大约前18个氨基酸(据信可编码CS蛋白质信号序列)的1216碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在200μl培养基缓冲液(同上所述)中，37℃下用限制性核酸内切酶BamHⅠ(25单位)将10微克表达载体pASl(ATCC 39262，详见Rosenberg的美国专利4，578，355号)消化1.5小时。然后于25℃下用DNA聚合酶Ⅰ，大片段(5单位Klenow片段在20mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、60mM NaCl、6mM2-巯基乙醇和各0.25mM四种脱氧核苷三磷酸中)将切割的质粒处理15分钟以末端充填BamHI位点。
在30μl连接酶缓冲液(含有50mM Tris、1mM DTT、10mM MgCl2、100μM rATP、pH7.5)中用1单位T4 DNA连接酶4℃下处理16小时，使环子孢子蛋白质基因片段(1μg)连接到该载体(100ng)中。
然后将该连接混合物转化到大肠杆菌菌株MM294CⅠ+中。得到并筛选CS基因片段插入pAS1中的氨苄青霉素抗性菌落。鉴定一个有正确构建的质粒(pCSP)。
B.pUCRLfW9的构建在400μl培养基缓冲液(同上所述)中，37℃下用限制性核酸内切酶FoKⅠ(100单位)将纯化的pCSP质粒DNA(100μg)消化3小时。然后用DNA聚合酶Ⅰ大片段(同上所述)处理该质粒，以末端充填FokⅠ位点。继之用BamHI(100单位)在400μl培养基缓冲液(见上述)中37℃下消化3小时。在6%凝胶上以聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)分离所得到的编码CS蛋白质之氨基酸19-123的318碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在400μl培养基缓冲液(见上述)中用限制性核酸内切酶TthlllⅠ(100单位)65℃下将另一等份pCSP(100μg)消化3小时。然后用DNA聚合酶大片段(同上所述)处理以充填TthlllⅠ位点。继之用SalⅠ(100单位)在400μl培养基缓冲液中37℃下消化该质粒3小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以电泳法分离所得到的编码CS蛋白质之氨基酸297-412的655碱基对片段并以电洗脱法回收之。
用BamHI和SalⅠ(各20单位)在200μl培养基缓冲液(同上所述)中37℃下将10微克表达载体pUC18(Yanish-Perronetal.，Gene，33103(1985))(为一标准的大肠杆菌克隆载体，如可得自BethesdaResearchLaboratories，Inc.，GaithersburgMD)消化2小时。然后用1单位T4DNA连接酶在30μl连接酶缓冲液(同上所述)中4℃下处理16小时，使318碱基对BamHI末端充填的/FokⅠ片段(1μg)和655碱基对TthlllⅠ末端充填的/SalⅠ片段(1μg)连接到pUC18中。鉴定有正确构建的质粒(pUCRLf△9)。
C.pMG-1的构建用BamHI和SacⅠ(各50单位)在200μl培养基缓冲液(见上述)中37℃下将10微克表达载体pMG27N-(M.Grossetal.，Mol.Cell.Biol.，51015(1985))消化3小时。
用NcoⅠ和BamHI(各20单位)在200μl高缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，10mM MgCl2和100mM NaCl，PH7.5)中将10微克含有流感病毒(A/PR/8/34)非结构蛋白质1(NSl)编码区(Baez，et al.，Nucleic Acids Research，85845(1980))的表达载体pAPR801(Young et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，806105(1983))37℃消化2小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以PAGE法分离所得到的编码NSl之前81个N末端氨基酸的230碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
连接40毫微克BamHI/SacⅠ切割的pMG27N-(见上所述)与80ng230碱基对NcoⅠ/BamHINS180编码片段和80ng有下列序列的合成接头5'CATGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT3'3'CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC5'
鉴定所得到的质粒pMG-1，该质粒应具有连接到pMG27 N-之BamHI位点上的NSl81编码序列的BamHI位点、连接到合成接头之NcoⅠ位点上的NSl81编码序列的NcoⅠ位点，以及连接到pMG27N-之SacⅠ位点上的合成接头的SacⅠ位点。该载体引入独特的限制性位点，以利于在三个读码的任何一个中插入DNA片段，从而在CⅡ核糖体结合位点之ATG起始密码子的所有三个码读下游区插入TGA终止密码子，当被表达时，可由所有这三个读码产生NSl81融合蛋白质。用NdeⅠ消化pMG-1，然后连接上述载体，导致非融合蛋白质(即未与NSl81融合)的表达。
D.pNSl81RLf△9的构建在400μl高缓冲液(同上所述)中用BamHI(100单位)37℃下消化表达载体pUCRLf(100μg)(3小时)。继后用DNA聚合酶I大片段(同上所述)处理被切割的DNA，以在末端充填BamHI位点。然后用SalⅠ(20单位)在400μl培养基缓冲液(同上所述)中37℃下将该质粒消化3小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以PAGE法分离所得到的1035碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在400μl培养基缓冲液(同上所述)用EcoRV和XhoⅠ(各25单位)37℃下将表达载体pMG-1(10μg)消化3小时。然后在30μl连接酶缓冲液中用1单位T4DNA连接酶4℃下处理16小时，将1035碱基对得自pUCRLf的BamHI末端充填的/SalⅠ(400μg)片段连接到该载体(100ng)上。
将连接混合物转化到大肠杆菌菌株MM294CI+中。得到氨苄青霉素抗性菌落并筛选含有以适当方向插入之基因的克隆。鉴定正确构建的质粒(pNSl81RLf△9)，转化到大肠杆菌菌株AR58(cIts857)中并检测环子孢子蛋白质的表达。该蛋白质缺少前18个N末端氨基酸(CS1-18)、中心重复区域，以及含区域Ⅱ之侧翼区(RLf△9)的9个N末端氨基酸(CS248-296)，并通过得自连接到pMG-1表达载体中之合成接头的6个氨基酸(Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp)融合到流感病毒非结构蛋白质1的81个N末端氨基酸(NSl81)上。
NSl81RLf△9具有下列序列NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412将Asp(来自合成接头的C末端)与RLf△9(CS19-123-CS297-412)分隔开的脯氨酸是充填pCSP中BamHI/FokⅠ片段之BamHI位点时人工加入的。
使细胞于32℃下在Luria-Bertani培养液中生长，直到650nm(A650)吸光率为0.6，并于42℃下进行温度诱导3小时，以开通表达质粒之PL启动子的转录过程，继而转译NS81CS蛋白质衍生物。以1ml等份取细胞样品，离心沉淀并悬浮于溶解缓冲液(10mM Tris-HCl，PH7.8，25%(v/v)甘油、2%2-巯基乙醇、2%十二烷基磺酸钠(SDS)0.1%溴酚兰)中，然后在105℃烘箱中保温5分钟。
用SDS-PAGE法(13%丙烯酰胺，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝30∶0.8)分离蛋白质。将蛋白质转移到硝化纤维素滤膜上，并使用可与称为区域I的CS蛋白质(Dame et al.，Science 225593(1984))有反应活性的多克隆抗体及与NSl81蛋白质有反应活性的多克隆抗体，以Western印迹法检测大肠杆菌中产生的NSl81RLf△9蛋白质。结果还表明该大肠杆菌产生的NSl81RLf△9蛋白质与抗恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白质之四肽重复区的5份单克隆抗体合并物无反应活性。
实施例2pNSl81RLfAuth的构建在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶BamHI和FOKI消化大肠杆菌表达载体pCSP(同上所述)。用电洗脱法回收所得到的编码含区域I侧翼区(去掉前18个N末端氨基酸)的DNA片段。
在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶TthlllⅠ和SalⅠ消化第二份pCSP。用电洗脱法回收所得到的编码含区域Ⅱ之侧翼区(少前9个N末端氨基酸)的DNA片段。
在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶BamHI和SalⅠ消化大肠杆菌表达载体pUC18(同上所述)。
为了重新得到含区域Ⅱ的CS蛋白质中心重复区域之C末端侧翼区区的9个N末端氨基酸(CS288-296)(这些氨基酸是在用TthlllⅠ消化的pCSP时丢失的)，制备有下列序列的、含FokⅠ末端和TthlllⅠ末端的合成DNA片段
AspProGlyAsnLysAsnAsnGlnGlyAsnGlyGlnFokI5'ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA3'Tth lll I3'GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT5'将BamHI/FokⅠ片段、TthlllⅠ/SalⅠ片段及该合成片段连接到BamHI/SalⅠ消化的pUC18中。
在培养基缓冲液中，用限制性核酸内切酶BamHI消化所得到的质粒pUCRLfAuth，进行末端充填，并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码缺少前18个N末端氨基酸及中心重复区域之确切环子孢子蛋白质的DNA片段。
然后将分离的BamHI末端充填的/SalⅠ片段连接到编码NSl81的大肠杆菌表达载体pMG-1(同上所述)中，所说的载体先前已用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化过。所得到的表达载体pNSl81RLfAuth表达具有下列序列的蛋白质NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412其中将含区域Ⅰ和区域Ⅱ的CS侧翼区(CS19-123和CS288-412)分隔开的甘氨酸是由合成的FokⅠ/TthlllⅠDNA人工接头序列表达的。
NSl81RLfAuth的完整核苷酸和氨基酸序列可由已公开的欧洲专利申请90304720.7号(申请日为1990年5月1日)中查到，该专利申请整个公开文本已列为本文参考文献。
实施例3pNSl81RLfAuth+(NANP)2的构建在培养基缓冲液(同上所述)中，25℃下用限制性核酸内切酶SmaⅠ将pNSl81RLfAuth(同上所述)消化3小时。
将具有下列序列的人工合成DNA接头连接到SmaⅠ消化的pNSl81RLfAuth中AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro5'AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC3'3'TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG5'该合成DNA接头编码(NANP)2(单字母符号各代表下列不同的氨基酸，N＝天冬酰胺(Asn)、A＝丙氨酸(Ala)、P＝脯氨酸(pro)，即含有所谓CS蛋白质免疫优势重复区域之相符序列的四肽。用限制性核酸内切酶SmaⅠ消化pNSl81RLfAuth，可使由合成DNA接头编码的任何数目的重复四肽连接到CS蛋白质中先前被免疫优势区占据的区域。可依这一方法将其他四肽编码DNA片段连接到载体中。所得到的质粒pNSl81RLfAuth+(NANP)2编码有下列序列的蛋白质NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(NANP)2-Gly-CS*实施例4pNSl81(NANP)4RLfAuth的构建用限制性核酸内切酶BamHI消化表达载体pUCRLfAuth(见上所述)。
将编码(NANP)4的合成DNA片段连接到BamHI消化的pUCRLf中。合成DNA片段具有下列序列ProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro5'GATCCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCTAACCCCAACGCTAACCCC3'3'GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTGCGATTGGGGTTGCGATTGGGGCTAG5'所得到的质粒被定名为PUC18(NANP)4RLfAuth。
用限制性核酸内切酶BamHI消化表达载体pUC18(NANP)4RLfAuth。进行末端充填(Klenow片段)、再用限制性核酸内切酶SalⅠ消化，并以电洗脱法回收所得到的DNA碱基对片段。
将BamHI末端充填的/SalⅠ片段连接到先前已用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化的上述编码NSl81的表达载体pMG1中。所得到的质粒被定名为pNSl81(NANP)4RLfAuth。它所编码的蛋白质中，由合成DNA片段编码的重复四肽被插入到NSl81之氨基酸81(Met)和NcoⅠ/SacⅠ合成DNA接头NSl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412的N末端Asp之间。
实施例5pNSl81(NVDP)4RLfAuth的构建
pNSl(NVDP)4RLfAuth的构建与上述pNSl81(NANP)4RLfAuth的构建方法相似，不同的是所用的编码(NVDP)4(CS蛋白质中心重复区的变异四肽序列)的合成DNA接头具有下示序列AsnValAspProAsnValAspProAsnValAspProAsnVal5'GATCCCAATGTAGACCCCAACGTTGATCCGAACGTAGACCCGAATGTA3'3'GGTTACATCTGGGGTTGCAACTAGGCTTGCATCTGGGCTTACAT5'所得到的质粒编码有下列序列的蛋白质NSl81(NVDP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-GlyCS288-412实施例6由大肠杆菌中分离NSl81RLf△9在温度敏感性λ细胞溶素原(CI857)中诱导NSl81RLf△9合成之后，离心收集细菌细胞并将沉淀的细胞团块置于-70℃下冷冻。在120ml含有50mM Tris(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、10mM己二胺四乙酸(EDTA)、5%甘油和10mM二硫苏糖醇的溶解缓冲溶液(PH8)中稀释，以融解大约12g浓缩并冷冻的细胞。向稀释的细胞内加入溶菌酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)至终浓度为0.2mg/ml，并将溶液于4℃下搅拌30分钟。用Branson超声发生器对细胞进行超声处理，直到溶液完全呈现液化状态。加入脱氧胆酸盐至终浓度为0.1%(v/v)，并于在SorvallRC5B离心机(Dupont)中，以15，600xg将溶液4℃离心30分钟。
弃去上清，并将含蛋白质的沉淀团块悬浮于100ml含有50mM甘氨酸、2mM EDTA和5%甘油的缓冲溶液(pH10)中。按上述方法超声处理该悬浮液并加入Triton
X-100(Sigma)至终浓度为1%(v/v)。将经超声处理的溶液于4℃下搅拌30分钟并按上述方法离心。
向含蛋白质的上清内加入尿素至终浓度为8M，并用50%乙酸溶液滴定至PH5.5。样品在预先用含有20mM乙酸钠、1%Triton X-100和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)中平衡过的25mlQAE Sepharose
Fast Flow柱(pharmacia)上，以300cm/小时的流速层析。收集含蛋白质的未结合部分并加于预先用含有20mM乙酸钠和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)平衡过的10ml SP Sepharose
Fast Flow柱(Pharmacia)上，以120cm/小时的流速层析。监测流出物的280nm吸光率。用含有100mM Tris和8M尿素的缓冲液(PH8)由该柱上洗脱蛋白质。
所得产物的SDS-PAGE分析显示出一条表观分子量为40，000KD的主带，且其纯度约为80%。纯化过程得到了12mg蛋白质，其中每毫克蛋白质约含有14单位内毒素。
实施例7由大肠杆菌中分离NSl81RLf△9在温度敏感性λ细胞溶素原中诱导NSl81RLf△9合成之后，离心收集细菌细胞并于-70℃下冷冻所得细胞团块。在2200ml含有60mMTris、12mMEDTA、6%甘油和12mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲溶液(PH8.0)中稀释约636g浓缩并冷冻的细胞，使之融解。使融解的细胞以6000-7000psi通过MantonGaulin匀浆器两次。加入10%脱氧胆酸盐溶液至终浓度为0.1%(v/v)，溶解物于4℃下搅拌30分钟并在SorvallRC5B离心机(Dupont)中以10，000Xg4℃离心60分钟。
弃去沉淀物并向每毫升含蛋白质上清液内加入25μl1050或2100Biocryl小珠混合物(Supelco)。按上述方法搅拌并离心溶液。
弃去沉淀物并于5分钟时间内加入固体硫酸铵，使含蛋白质上清内的硫酸铵达到20%饱和度。
按上述方法搅拌并离心样品。将沉淀物悬浮于400ml含有20mM乙酸钠、1%Triton
X-100和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)中。离心该悬浮液并使上清对含有100mM Tris和8M尿素的缓冲溶液(pH8.0)透析。将余留物的PH调到5.5并在100ml预先用含20mM乙酸钠、1%Triton X-100和8M尿素的缓冲溶液平衡的SP Sepharose
Fast Flow柱(Pharmacia)上层析(流速10ml/分钟)。先用平衡缓冲液，然后再用含0.1M Tris和8M尿素的缓冲液(PH8)洗柱。用500ml在含0.1M Tris和8M尿素的缓冲液(pH8)中制备的0.0至0.5M氯化钠线性梯度溶液洗脱。
于0.3M氯化钠浓度时洗脱蛋白质。合并含目的产物的各部分，使用YM10滤膜在Amicon搅拌小室内浓缩，并对含20mMTris的缓冲溶液(PH8.0)透析，然后对磷酸盐缓冲盐水(PH7.0)透析。
对所得产物的SDS-PAGE分析显出一条表现分子量约40，000KD的主带和一系列小组分带。纯化过程产生25mg蛋白质，其中每毫克蛋白质含有144内毒素单位。
实施例8由大肠杆菌中分离R16CSP将分离自pUC8克隆1(见上述)的XhoⅡ片段连接已用限制性核酸内切酶BamHI消化的pCsp(见上述)中，以制备在大肠杆菌中表达的R16CSP。按下述方法纯化实施例9中用作ELISA俘获抗原的R16CSP。
诱导大肠杆菌中的R16CSP合成之后，离心收集细菌细胞，并于-20℃下冷冻所得的细胞团块。在1.43升含50mMTris、10mMEDTA、5%甘油和10mM二硫苏糖醇的缓冲液中融解大约373g浓缩并冷冻的细胞。加入10%脱氧胆酸盐(W/V)溶液至终浓度为0.1%(v/v)，然后使细胞以7，000psi两次通过Manton-Gaulin匀浆器。向匀浆内加入在0.5MTris(pH8.0)缓冲液中的10%聚乙烯亚胺(BRL)溶液(w/v)，至终浓度为0.5%。所得溶液于4℃下搅拌1小时，并在SorvallRC2B离心机(Dupont)中以13，000Xg4℃离心45分钟。
弃去沉淀物，向上清内加入固体硫酸铵，使之于5分钟时间达到35%饱和。按前述方法搅拌并离心所得溶液。
将沉淀团块悬浮于300ml含20mMTris和10mMEDTA的缓冲液(pH8.0)中。加入含300ml8M尿素、2.7升10mM乙酸钠和4M尿素的溶液，并直接将pH调到4.0。按前述方法离心样品。
将上清液加于50ml预先用含20mM乙酸钠和4M尿素的缓冲液(pH4.0)平衡过的SP-Sepharose
，，Fast Flow柱(Pharmacia)上。用含20mM乙酸钠的缓冲液(pH5.0)洗柱并用250ml含有0.0至1.0M氯化钠(在洗涤缓冲液中)的线性梯度溶液洗脱。产物于大约0.3M氯化钠时被洗脱。
用10%三氟乙酸(TFA)(v/v)将50ml等份的离子交换产物调到pH2.3并在已用0.1%TFA平衡的C4反相柱(Vydac，1×25cm)上层析。用在0.1%TFA中的0至60%乙腈(ACN)的线性梯度过柱45分钟并在约60%ACN处洗脱产物。加入1M碳酸氢铵(至25μl/ml)，以中和反相层析产物。
约45ml反相层析产物对含2M盐酸胍的缓冲液(pH5.0)透析，并在YM30膜(Amicon)上浓缩到20ml。取10ml样品，在预先用含2.0M盐酸胍之缓冲液(pH5.0)平衡的Superose
12柱(Pharmacia)(2.5×50cm)上层析。将洗脱的表观分子量约358KD的产物对含有20mM乙酸钠的缓冲液(pH4.5)透析。
上述层析产物经考马斯染色SDS-PAGE分析后，显示出两条分子量约72KD和70KD的带。对终产物的N末端氨基酸序列分析，结果在15%预期值之内。
实施例9小鼠对NSl81RLf△9的抗体反应为了估计其免疫原性，将纯化的NSl81RLf△9抗原接种到三个品系，即C57BL/6(H-2b);BALB/C(H-2d)和C3H/HEN(H-2k)小鼠体内。先前已经证明，只有那些H-2b单倍体的小鼠才产生抗恶性疟原虫CS蛋白质之重复性抗原决定基的抗体。将抗原与弗氏佐剂一起注射并以酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选被免疫动物的血清样品。用R32tet32(一种含有CS蛋白质之重复四肽的抗原)免疫对照组动物。用NSl81RLf△9接种的所有三个品系的小鼠均产生了与CS蛋白质之非重复区有反应活性的抗体。免疫原性试验的具体方法及结果如下所述。
将三个品系的小鼠各分成两组，每组包括四至五只动物。用NSl81RLf△9免疫第一组动物，用R32tet32(J.Young et al.，Science，228958(1985))免疫第二组动物。R32tet32含有两个XhoⅡ片段，各片段编码-具有序列[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)]2的肽。tet32是由读码外的四环素抗性基因编码的32氨基酸肽。
给药之前将按实施例6所述方法纯化的NSl81RLf△9抗原与完全弗氏佐剂混合。每只小鼠(6至8周令)右后肢皮下注射50μg抗原(200μl)。共免疫两次，第一次注射与完全弗氏佐剂混合的50μg抗原(200μl)。4周后按第一次免疫的相似方法进行加强注射，不同的是抗原加不完全弗氏佐剂一起乳化。
第二次免疫后7天放血。合并每组动物的全血，4℃过夜使血液凝固，然后离心分离血清并于-70℃下储存。用ELISA法检测各份合并之血清中的抗R32tet32、NSl81RLf△9或R16CSP抗体。
“夹心”ELISA法中掺入了R32tet32、R16CSP和NSl81RLf△9，作为俘获抗原被吸附到微量滴定板的小井壁上。
向各小井内加入50μl含0.75μg俘获抗原和0.2μg煮沸之酪蛋白的PBS溶液，而使俘获抗原吸附到微量滴定板的小井壁上。该溶液是向2.5ml含4μl0.5%煮沸之酪蛋白溶液(见下文所述)内加入8μl(3.76μg)俘获抗原，然后再加到5ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)(为含有0.8%NaCl、0.217%Na2HPO4-7H2O、0.02%KH2PO4和0.02%KCl的水溶液，PH＝7.4)中而制成的。
室温下保温过夜后，吸出小井内容物并用煮沸的0.5%酪蛋白溶液(5g/L酪蛋白(J.TBakerChemicalCo.)、0.1g/LThimersol(SigmaChemicalCo.)、0.02g/L酚红(SigmaChemicalCo.)、900mlPBS(PH7.4)和100ml0.1NNaOH)与1%吐温20(聚氧乙烯山梨糖醇酐-月桂酸酯，SigmaChemicalCo.)的混合物(99∶1)封闭滴定板上余留的活性结合部位。
用含有0.025%吐温20的0.5%煮沸酪蛋白溶液，以1∶100、1∶1000、1∶10，000、1∶100，000和1∶1000，000倍稀释小鼠血清样品。将试验血清加到小井内，保温2小时后除去血清并用含0.05%吐温20的PBS溶液将各小井洗2次。将抗小鼠IgGAb结合到过氧化物酶上，用稀释血清的同一稀释剂稀释2，000倍，然后加到小井内。保温1小时后，吸出小井内容物，用含有0.05%吐温20的PBS溶液洗3次，并加入澄清的过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard&Perry，按厂商推荐的方法制备)。过氧化物酶与底物反应后生成一种暗绿色产物，其颜色的强度与存在于血清样品中的抗体量成比例。15分钟后使用ELISA平板读出器读出405-414nm的吸光率，并以光密度(O.D.)单位记录结果。
所有接种NSl81RLf△9抗原的三个品系的小鼠(C3H/HEN(H-2k)、BALB/C(H-2d)和C3H/HEN(H-2b))均产生了与环子孢子蛋白质的非重复区有强反应活性的抗体。与NSl81RLf△9俘获抗原的反应性仅稍大于R16CSP(R16CSP俘获抗原只可检测抗CS蛋白之非重复部分的抗体，而NSl81RLf△9俘获抗原则可检测抗NSl81和抗RLf△9抗体)。如所期望的，C3H/HEN小鼠并没有产生抗R32tet32抗体，而C57BL/6小鼠则产生了这种抗体。虽然比在C57BL/6小鼠观察到的抗体反应弱得多(差1个数量级)，但BALB/C小鼠对R32tet32的抗体反应并不象所预略的那样，而且与文献中报导的这种单倍体小鼠对(NANP)40的阴性反应相反(Del Giudice et al.，J.Immunol.，1372952(1986)，用没有载体蛋白的(NANP)40免疫包括BALB/C(H-2d)在内的14个品系以上之携带9个不同H-2单倍体的小鼠，其中只有H-2b小鼠有抗(NANP)40抗体反应。H-2d小鼠(BALB/C)完全没有反应。用偶联钥孔
血兰蛋白(作为载体蛋白)的(NANP)40免疫的BALB/C小鼠没有产生抗(NANP)40抗体)。
实施例10子孢子侵入抑制作用(ISI)该项研究中，试验了用NSl81RLf△9免疫的兔血清抑制恶性疟原虫子孢子进入肝细胞(子孢子发育成熟为红细胞外阶段的部位)的能力。
用NSl81RLf△9(与完全弗氏佐剂或氢氧化铝混合注射)免疫三个小鼠品系(BALB/C、C57BL/6和A/J)，而产生高滴度抗CS蛋白非重复区的抗体。但按照Hollingdale，M.R.等人(J.Immunol.，132(7)909(1984))所述的子孢子侵入抑制(ISI)试验法检测时，发现这些小鼠的血清不能阻断子孢子侵入培养的人肝癌细胞(HepG2-A16)内。
相反，于0.3和7周时用100μg NSl81RLf△9免疫(与完全弗氏佐剂混合注射)的新西兰白兔则产生了升高滴度的抗CS蛋白非重复区抗体(尽管比在小鼠体内测得的滴度低)。但按照Hollingdale ISI检测法检测时，证明用NSl81RLf△9免疫的兔血清可显著地抑制(一只动物为98%，平均抑制率为大约60%)子孢子侵入肝癌细胞。
恶性疟原虫氯奎抗性株(7G8株)和恶性疟原虫氯硅敏感株(NF54株)的子孢子均可明显地受到用NSl81RLf△9免疫之兔血清的抑制，而不能进入肝癌细胞内。对7G8株恶性疟原虫子孢子侵入肝癌细胞的抑制率(平均85%)高于用ISI方法测得的对NF54恶性疟原虫株子孢子进入肝癌细胞的抑制率(平均60%)。
在用正常人肝细胞代替人肝癌细胞的ISI试验中，可见用NSl81RLf△9免疫的兔血清能够抑制NF54恶性疟原虫株子孢子进入肝细胞(其中一只兔的血清抑制率为89%，平均抑制率约为45%)。
这些研究提示NSl81RLf△9抗原上存在子孢子中和抗原决定基。
实施例11子孢子中和抗原决定基的鉴定简单地说，用在完全弗氏佐剂或氢氧化铝中乳化的NSl81RLf△9免疫三个品系(即BALB/C、C57BL/6和A/J)的小鼠，以产生高滴度抗CS蛋白质非重复区的抗体。但按照Hollingdale，M.R.et al.，J.Immunol.，132(7)909(1984)中所述的子孢子侵入抑制检测法进行试验时，证明这些小鼠的血清不能阻止子孢子侵入培养的人肝癌细胞(HepG2-A16)。
然后用Geysen等人(“StrategiesforEpitopeAnalysisUsingPeptideSynthesis”，J.Immunol.Methods，102259-274(1987))的pepscan分析法进一步分析小鼠和兔血清。简单地说，合成制备一整套同整个恶性疟原虫CS蛋白质序列同源的交迭六肽，各六肽均偶联到聚丙烯小棒上。以1∶500倍稀释按实施例9所述用RLf△9免疫之小鼠和兔的血清，并与上述小棒一起于4℃下保温过夜。重复洗涤小棒并用结合到种间抗体上的碱性磷酸酶检测被结合的抗体。洗涤几次后，使小棒与底物接触1小时。读出414nm吸光率并将结果描绘在有其相关序列的适当点上。分析六肽反应可鉴定出下述5个子孢子中和抗原决定基。
使用上述方法，鉴定出本发明的下述肽，以作为恶性疟原虫的子孢子中和抗原决定基肽1Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys肽2Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys肽3Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn肽4Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala肽5Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp可使用本申请提供的方案以常规合成技术制备上述的任何一种肽。
肽1至5中的任何一个均可偶联到免疫增强大分子如包括但不仅限于破伤风类毒素、白喉毒素和霍乱B毒素上。最好通过有助于使肽偶联到载体蛋白上的氨基酸残基，如包括但又仅限于半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸进行偶联。也可通过偶联剂，即可使肽接到载体蛋白上的试剂进行偶联。有用的偶联剂包括但不只限于戊二醛。最好通过一种促进剂和偶联剂进行偶联。
例如，可以其N末端为半胱氨酸合成肽4并通过其N末端的半胱氨酸，使用戊二醛作偶联剂将所得到的序列偶联到破伤风类毒素上(下文将所得到的杂合蛋白质称为肽101)。也可以其N末端和C末端均为半胱氨酸的合成肽4，使用戊二醛作偶联剂，通过其N末端半胱氨酸和C末端半胱氨酸，将所得序列偶联到破伤风类毒素上(下文将所得到的杂合蛋白质称为肽106)。
例如，可按1mg/ml的浓度将肽4(其N和C末端均为半胱氨酸)悬浮于PBS(pH7.4)中。加入破伤风类毒素，达到终浓度1mg/ml。在搅拌肽和蛋白质的同时加入戊二醛至终浓度为3%。反应于室温下进行1小时。所得到的杂合蛋白质(肽106)对PBS透析以除去游离肽和戊二醛。
用偶联的肽(即肽101和106)免疫(加弗氏完全佐剂和不完全佐剂)兔，并对血清作ISI试验。所得结果如下血清%ISI抗肽1017150抗肽10699.289ISI是试验血清对子孢子侵入的百分降低率与预免疫或未免疫血清存在下之百分降低率相比较的值。从上示结果可以看出，肽101和106显然可引发ISI活性。肽106特别有活性。
可以通过常规技术，以相似方法将肽1-5中的任何肽或所有肽，以任何次序或任何组合方式偶联在一起，然后通过所得N末端和/或C末端上的氨基酸残基(如半胱氨酸残基)以及偶联剂(如戊二醛)，偶联到免疫增强大分子(如破伤风类毒素)上。所得杂合多肽可用作本发明的疫苗。
应特别提到的是，可通过常规技术，将肽反向转译成DNA序列，从而通过常规重组技术以单体或聚合物的形式表达蛋白质，以产生由肽1至5的任何一个氨基酸序列编码的任何蛋白质。还应特别提到的是，可通过常规技术将肽反向转译成DNA序列，从而可利用遗传工程技术将所得的DNA序列融合到所需的免疫增强编码序列(如破伤风毒素)和/或表达增强序列上，然后可通过常规DNA重组技术表达所得到的杂合氨基酸编码序列，以产生由肽1至5衍生的任何所需之杂合肽。
因此，在某些具体实例中，本发明的多肽包括一个或多个上面鉴定的免疫原性抗原决定基。可以推想，用本领域内已知的常规技术可以制得上述肽的功能性等同物，即加工子孢子中和活性的衍生分子。例如，当与已鉴定的氨基酸序列相比较时，这些功能等同物可在保留子孢子中和活性的前题下有一个或多个氨基酸缺失、置换和/或加入。
权利要求
1.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Piasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Piasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇以及含有较少(少于全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中来自第一侧面区域的所说致免疫决定簇中至少有一个是由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys；Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys；或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn；或是该序列的功能等同物。
2.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇以及含有较少(少于全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中来自第二侧面区域的所说的致免疫决定簇中至少有一个是由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或该序列的功能等同物。
3.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及含有较少(少于全部总数)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中至少有一个来自第一侧面区域的所说的致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;且其中至少有一种来自第二侧面区域的所说致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或者它们的功能等同物。
4.一种多肽，该多肽含有少于全部或不含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白重复区的重复性致免疫决定簇，且至少一个肽由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或该序列的功能等同物。
5.根据权利要求1-4所说的任一种多肽，它是一种杂交多肽。
6.根据权利要求5所说的多肽，该杂交多肽是通过肽与一种载体蛋白化学融合得到的。
7.根据权利要求6所说的多肽，其中载体蛋白是破伤风类毒素，白喉毒素或霍乱B毒素。
8.根据权利要求7所说的多肽，其中的化学融合是通过戊二醛作为偶联剂介导的。
9.根据权利要求7所说的多肽，其中与破伤风类毒素的融合是以该肽N-末端的半胱氨酸残基介导。
10.根据权利要求7所说的多肽，其中与破伤风类毒素的融合是以肽N-末端的一个半胱氨酸残基及肽的C-末端的一个半胱氨酸残基介导。
11.根据权利要求10所说的多肽，该多肽是通过偶联剂戊二醛将氨基酸序列Cys-Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Cys与破伤风类毒素偶合得到的。
12.一种编码权利要求1-11中任一项所说的多肽的表达载体。
13.一种预防人体受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的疫苗，该疫苗包含一种免疫予防量的权利要求1-11中任一项所说的多肽和一种药物学上可接受的载体。
14.给需要预防免受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的人体免疫接种的方法，该方法包括给这样的人体施用有效的、无毒量的权利要求13所说的疫苗。
全文摘要
抗疟原虫(Plasmodium)属寄生虫感染的疫苗，为抑制疟原虫感染的作为治疗剂用多肽，该多肽含有来自位于一个中央重复区侧面的一种疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域的致免疫决定簇以及含有较少(少于全部总数)来自重复区的重复性致免疫决定簇；以及给人体医治疟疾感染的方法。
文档编号C07K19/00GK1053814SQ9011012
公开日1991年8月14日 申请日期1990年12月8日 优先权日1989年12月8日
发明者米歇尔·S·格罗斯, 丹尼尔·M·戈登, 迈克尔·R·霍林代尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 美国陆军部, 生物医学研究院
技术领域：
本发明涉及抗疟原虫属(Plasmodium)寄生物感染的疫苗，更具体地说，涉及作为抑制疟原虫感染治疗剂的多肽，该多肽包含来自一个疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域(该区域位于其中央重复区侧面)的致免疫表位决定簇并且含来自该重复区的重复性致免疫决定簇(含量比总数少);本发明还涉及给人医治疟疾感染的方法。
总的来说，本发明涉及一种多肽，该多肽含有一个或多个来自位于疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的中央重复区侧面的第一区域的致免疫决定簇，和一个或多个来自位于该重复区侧面的第二区域的致免疫决定簇，并且也含较少(少于全部总数)来自该中央重复区的重复致免疫决定簇，或者根本不含有。
在一个实施例中，本发明涉及一种多肽，该多肽含有至少一个但不是所有的疟原虫(Plasmodium)属的表面蛋白重复区的重复致免疫决定簇以及一个或多个来自位于该重复区侧面的疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域的致免疫决定簇。
在本发明另一个实施例中，该多肽实质上含有全部来自位于中央重复区的侧面区域的致免疫决定簇，而缺失来自该中央重复区的致免疫决定簇。另一方面，实质上含有来自侧面区域的所有致免疫决定簇的多肽进一步包含至少一个(但不是所有)来自该中央重复区的致免疫决定簇。
用于本发明的多肽的致免疫决定簇优选包括那些存在于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，间日疟原虫(P.Vivax)，三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.Ovale)的表面蛋白中的致免疫决定簇。
而在本发明的又一实施例中，通过遗传手段将该多肽与一载体蛋白融合，优选的载体蛋白或是能加强该多肽的表达或能加强该多肽的免疫原性，或兼有两种作用。
在一个优选实施例中，本发明的多肽包含一个致免疫载体蛋白，例如借助一个合成连接子，流感病毒非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸(NSl81)与疟原虫(Plasmodium)环生子孢子(CS)蛋白的第一侧面区域融合，得到的融合蛋白自身与该CS蛋白的第二个侧面区域融合。
这样的多肽可进一步包括一个以上，但不是所有的来自该CS蛋白中央重复区的致免疫决定簇，例如，含有一个四肽的来自重复区的致免疫决定簇(其氨基酸序列为天氡酰胺-X-Y-脯氨酸，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天冬酰胺或天冬氨酸)。可将来自中央重复区的致免疫决定簇定位，例如，定位于载体蛋白和第一个侧面区域之间或者位于第一个侧面区域和第二个侧面区域之间。
本发明另一方面包括编码该多肽的表达载体，含该多肽的疫苗;纯化该多肽的方法;以及利用该肽对抗人体疟疾感染的治疗方法。
本发明的其他方面和优点公开于下文的详细描述中。
下面的氨基酸缩写用于本专利申请中Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸
Cys胱氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Gly甘氨酸His组氨酸Ile异亮氨酸Leu亮氨酸Lys赖氨酸Met蛋氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val缬氨酸疟原虫原生动物，疟原虫属(Plasmodium)，含有许多阶段-特异性蛋白，存在于它的外侧细胞表面。已发现这些表面蛋白质有三个共同区域，即中央重复表位决定基区(或领域)以及成对的侧面区。配对区的第一个侧面区域与中央重复区的羧基端融合，配对区的第二个侧面区域与该中央重复区的氨基端融合。
本发明多肽来自于疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的一部分，该部分含较少(少于全部总数)，或不含位于第一和第二侧面区域之间的中央重复区的致免疫决定簇，且本发明的多肽被大量充分表达以用作治疗抑制疟原虫感染。
换句话说，本发明的多肽具有的位于第一和第二侧面区域之间的串联重复少于存于野生型重复区域内的此类重复数。因此，对于用作预防人体免受恶性疟原虫(P.falciparum)感染的多肽，可包括完整的第一侧面区域，即恶性疟原虫(P.falciparum)环生子孢子蛋白(PfCSP)的N-末端侧面区域，完整的第二侧面区，即来自PfCSP的C末端侧面区域，以及来自PfCSP的第一和第二侧面区域之间的区域，少于41个串联重复单位，即少于41个通式为Asn-X-Y-Pro的四肽，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天氡氨酸或天氡酰胺。
在一种野生型疟原虫(Plasmodium)表面蛋白中，重复区域呈免疫显性。在本发明多肽中，串联重复的数目和定位或重复单元数的选择以不阻碍对第一和第二侧面区域的免疫应答为准。优选的是，本发明多肽的重复区数目不超过野生型蛋白中存在的重复区数目的一半。更优选的是，本发明多肽的重复区数目不超过野生型蛋白中存在的重复区数目的四分之一。
已知疟原虫(Plasmodium)属的四个种侵染人体，最流行的是恶性疟原虫(P.falciparum)，其次是间日疟原虫(P.Vivax)，更小程度的是三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.Ovale)。
恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)子孢子阶段环生子孢子(CS)蛋白的中央重复区域是由41个四肽串联重复连接组成，其中31个四肽氨基酸序列为天氡酰胺(Asn)-丙氨酸(Ala)-Asn-脯氨酸(Pro)，其中4个四肽氨基酸序列为Asn-缬氨酸(Val)-天氡氨酸(Asp)-Pro。在中央重复区的一侧是含有区域Ⅰ和区域Ⅱ的侧面区域，该CS蛋白的两个区域在氨基酸序列上几乎等同于所有疟原虫种如P.knowlesi(一种猴疟疾)CS蛋白质(Dameetal.，Science，2255931984)的对应区域。
恶性疟原虫(P.falciparum)嗜血阶段的各种表面蛋白质也具有重复抗原决定基，例如，S抗原(Pro-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Gly-Leu-Glu-Asp);RESA抗原(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala);FIRA抗原(Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro);和PF-11抗原(Glu-Glu-Val-Val-Glu-GLu-Val-Val-Pro)。
间日疟原虫(P.Vivax)的环生子孢子蛋白含有重复抗原决定基(Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala)，三间疟原虫(P.malariae)的环生子孢子蛋白含有重复抗原决定基(Asn-Asp-Ala-Gly)和(Asn-Ala-Ala-Gly)本发明多肽包含一个或多个来自疟原虫属(Plasmodium)表面蛋白的位于中央重复区侧面的第一区域的致免疫决定簇，和一个或多个来自位于重复区侧面的第二区域的致免疫决定簇，以及包含较少来自中央重复区的重复致免疫决定簇(数量少于全部总数或者完全不含)。
致免疫决定簇系能诱发一种B细胞或T细胞应答的氨基酸序列。一般地说，致免疫决定簇至少含有6个氨基酸。
利用经典技术包括单克隆抗体图谱分析和/或缺失氨基酸然后活性检测的方法可对一种蛋白质的致免疫决定簇进行精确识别。优选的是，本发明多肽含有来自第一或第二侧面区域的至少各15个氨基酸;更优选的是，至少约30个;最优选的是，整个第一和第二侧面区域，但缺失信号序列。
在一个实施例中，本发明多肽含有至少一个(但不是全部)来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白中央重复区的致免疫决定簇以及一个或多个来自于重复区侧面的表面蛋白的区域的致免疫决定簇。
在另一个实施例中，本发明多肽本质上含有来自位于中央重复区侧面的各区域的所有致免疫决定簇而缺少来自中央重复区的致免疫决定簇，或者含有来自中央重复区的至少一个(但不是全部)致免疫决定簇。“本质上全部”意指实际上采用整个的第一和第二侧面区域，但小于信号序列;优选的是，从每一区域中缺失不超过约20个氨基酸，更优选的是，利用整个第一和第二侧面区域，而小于信号序列。
本发明另一个实施例涉及一种多肽，该多肽包含来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及包含较少(少于全部总数)或不包含来自两侧面之间的重复区的重复致免疫决定簇，其中至少一个来自第一侧面区域的所说的致免疫决定簇具有下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
或者是该序列的功能等同物。
本发明的又一实施例涉及一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及含有较少(不是全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复致免疫决定簇，其中来自第二侧面区域的所说致免疫决定簇中至少一种是由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或是该序列的功能等同物。
本发明的再一实施例涉及一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇。以及含有较少(少于全部)或者不含有来自两侧面之间重复区的重复致免疫决定簇，其中来自第一侧面区域的至少一个所说致免疫决定簇由下列氨基酸编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
以及其中来自第二侧面区域的至少一个所说致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;
或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或其功能等同物。
本发明的更进一步实施例涉及一种多肽，该多肽包含来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的重复区的非全部(或不包含)重复致免疫决定簇以及至少一个由下列氨基酸序列编码的肽Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
或该序列的功能等同物。
本发明的再一实施例涉及一种预防人体受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的疫苗，该疫苗含有免疫予防量的本发明多肽和治疗学上可接受的载体。本发明还涉及给需要预防疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的人体免疫的方法，包括给这类人体施用有效的，非毒性量的此种疫苗。
优选的是，本发明多肽是一种杂交多肽，即一种由疟原虫(Plasmodium)表面蛋白的一部分和一种载体蛋白之间的遗传或化学融合组成的蛋白质。
更优选的杂交多肽含有一种与恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环生子孢子(CS)蛋白的一部分遗传融合的载体蛋白。其中的环生子孢子蛋白含有(不足全部)或缺失含在中央重复区的重复四肽。
特别优选的是那些杂交多肽，其中与之化学融合的载体蛋白是一种增强免疫的大分子，如(但不限于此)已灭活的博德特氏菌(Bordetella)，破伤风类毒素，白喉毒素和霍乱B毒素。
特别优选的是另一些杂交多肽，其中与之遗传融合的载体蛋白不仅加强携带的多肽的免疫原性而且也可通过转化体增强该多肽的表达。该载体蛋白的其他合乎要求的性质包括促进多肽的纯化或配制。这样的载体蛋白的例子有肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)，NSl81〔流感病毒(A/PR/8/34)非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸〕(Baez et al.，Nucleic Acids Research，85845 1980);R32(〔(Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn-Val-Asp-Pro)〕2)(Young et al.，Science，228958 1985);和galk。
根据本文公开的内容，利用常规的遗传工程技术或常规的肽合成技术，本领域内任一熟练技术人员可制备本发明多肽。
本文列举本发明的多肽类型的特异性例子包括NSl81-RLf△9，一种融合多肽，其中含一种流感病毒非结构蛋白1的81个N-末端氨基酸(NSl81)，含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白的侧面区域但缺失信号序列的区域Ⅰ(18个N-末端氨基酸)以及含有侧面区域但缺失起端的9个N-末端氨基酸的区域Ⅱ(RLf△9)。借助一个编码-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-的合成DNA连接子序列可促进NSl81与RLf△9的融合。
NSl81-RLfAuth，一种融合多肽，其中含NSl81;并含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白质的侧面区域但缺失信号序列的区域Ⅰ以及含有侧面区域的完整区域Ⅱ(RLfAuth)。
NSl81-(Asn-X-Y-Pro)n-RLfAuth，一种融合多肽，其中含NSl81;RLfAuth和(Asn-X-Y-Pro)，其中X是丙氨酸或缬氨酸，Y是天氡酰胺或天氡氨酸，n是大于或等于1且小于或等于100的一个整数，优选的是小于50。而且，(Asn-X-Y-Pro)定位于NSl81和RLfAuth之间。
NSl81RLfAuth+(Asn-X-Y-Pro)n，一种融合多肽含NSl81;RLfAuth和(Asn-X-Y-Pro)，其中X和Y的定义与上文相同，n小于41;并且这里的(Asn-X-Y-Pro)定位于含有恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白的侧面区域的区域Ⅰ和含侧面区域的区域Ⅱ之间，即该区域先前是中央重复区所处的位置。
特异性例子还包括下列肽，已鉴定出为恶性疟原虫(P.falciparum)的子孢子中和抗原决定基
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;
Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
仅列出这些多肽作为例证。根据本文提供的公开内容，本领域内任一熟练技术人员将懂得怎样构建和测试属于本发明领域内的其他多肽，例如，含有来自表面蛋白序列的多肽，包括除恶性疟原虫(P.falciparum)以外的各种疟原虫的环生子孢子蛋白、含有或多或少来自表面蛋白的氨基酸的多肽、经化学改性的多肽、以及与其他的或附加的氨基酸或蛋白质序列融合的多肽。利用遗传工程和/或蛋白质合成的标准技术很容易构建这些多肽，且利用基本上如下文描述的方法在动物模型上测试这些多肽。例如，本发明的一种蛋白质可含有来自表面蛋白侧面区域的氨基酸序列，如缺失中央重复区的基本上完整的环生子孢子蛋白，融合于一融合蛋白(可形成杂交HBsAg颗粒)中的肝炎B病毒表面抗原，正如欧洲专利申请，(申请号EP278，940
公开日1988年8月17日)所描述的。
利用已知技术本领域内任一熟练技术人员很容易获得表面蛋白侧面区域，四肽，合成DNA连接子序列以及载体蛋白的遗传编码序列。这些技术包括合成法，并优选通过信使RNA的逆转录或通过基因组DNA的完整基因直接克隆，以及通过常规的聚合酶链反应(PCR)技术，产生特异性序列。Ellisetal.在Nature，302536(1963)中描述了恶性疟原虫(P.falciparum)信使RNA的逆转录。Dameetal.(引用文献同上文)描述了恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA的完整基因的直接克隆。在欧洲公开专利申请No.86870014，7(申请日1990，2，3，该文公开内容作为本文参考文献)中描述了含有重复区的多肽的克隆和表达。
经克隆整个或部分疟原虫(Plasmodium)DNA，编码整个或部分表面蛋白的该DNA片段可由已知技术制备。
合成DNA的技术是已知的且利用商业上可购买的DNA合成器完全该合成过程。
可将多肽的编码序列插入E.Coli表达载体，许多这样的表达载体是已知的且容易获得。在E.Coli中实施本发明时，将一个编码本发明多肽的DNA序列有效地连接到一个转化大肠杆菌的DNA载体中的调节因子上。许多含有这样的调节因子的革兰氏阴性细菌表达载体可利用。该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可控制的，即可诱导型或可阻遏型启动子。各种有用的启动子可用于在E.Coli中表达异源多肽。这样的启动子包括色氨酸启动子和λPL启动子(例US专利号4，578，355和Courtney et al.，Nature，313149 1985)。下文将对此进行更详细描述，已发现利用E.Coli表达载体pMG-1尤其适用于表达编码本发明多肽的编码序列。编码除NSl81外的载体蛋白，例如R32和galkPMG-1的衍生物也具有优势。
在链霉菌(streptomyces)中实施本发明，将编码本发明多肽的一个DNA编码序列有效地连接到一个转化链霉菌的DNA载体中的调节因子上。该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选可控制的，例如，可诱导型或可阻遏型启动子。各种有用的启动子可有效地在链霉菌(streptomyces)中表达异源多肽。具体例子包括链霉菌(streptomyces)半乳糖操纵子的半乳糖-诱导型启动子(Fornwald，etal.，ProcNatl.Acad.Sci.USA842130(1987))、S.lividansβ-半乳糖苷酶基因(Eckhardt，etal.，J.Bacteriol.1694249(1987)及Brawner，etal.，(美国专利4，717，666)和S.longisporus胰蛋白酶抑制基因(欧洲专利申请号87307260.7)的组成型启动子、或是一个短暂调节启动子如在M.echinospora中报道的(Baum，etal.，J.Bacteriol17071(1988))。链霉菌(streptomyces)转录终止区来源于几种链霉菌(streptomyces)基因的3′末端，例如链霉菌(streptomyces)半乳糖操纵子末端的终止信号，或者在S.fradiae新霉素磷酸转移酶基因末端发现的终止信号(ThompsonandGray，Proc.Natl.Acad.SciUSA805190(1983))。在链霉菌(streptomyces)中蛋白质输出序列包括从S.lividansβ-半乳糖苷酶基因、S.lividansLEP-10基因(欧洲专利申请No.87307260.7)和S.longisporus胰蛋白酶抑制基因中分离到的序列。
将编码本发明多肽的基因整合到一个较大的DNA分子上，该DNA分子含有一个遗传选择性标记系统。该选择性标记系统可以是许多已知标记系统中的任一种，以便标记基因授与已转化的细胞一个可选择的新表型。这些例子有链霉菌(streptomyces)抗药性基因如抗硫链丝菌肽核糖体甲基酶(Thompson，etal.，Gene2051(1982))、新霉素磷酸转移酶(Thompson，etal.，同上文)和抗红霉素核糖体甲基酶(Thompson，etal.，同上)。该DNA分子也可以含有链霉菌(streptomyces)的一个自主复制序列，如pIJ101的衍生物(Keiser，etal.，Mol.Gen.Genet.185223(1982))或一个由SLP1衍生的载体(Bibb，etal.，Mol，Gen.Genet184230(1981))。该DNA分子还可含有一个允许基因扩增的标记。对在链霉菌(streptomyces)中扩增基因拷贝数有用的这样的标记包括壮观霉素抗性基因(Hornemann，etal.，J.Bacteriol1692360(1987))和精氨酸营养缺陷型基因(Altenbuchner，etal.，Mol，Gen.Genet，195134(1984))。
在酵母中实施本发明时，将编码本发明多肽的一个DNA编码序列有效地连接到一个调节因子上，该调节因子位于可转化酵母的一个DNA载体中。可有效地转化，克隆和具表达系统的任何酵母寄主均可使用。特定的例子包括汉逊氏酵母属(Hansenula)毕赤氏酵母属(pichia)，克鲁维酵母属(Kluveromyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和假丝酵母属(Candida)和酵母菌属(Saccharomyces)的酵母。优选的酵母寄主是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
该调节因子含有一个实现RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可控制的，即可诱导型或可阻遏型启动子。各种有效的启动子可用于在酵母中表达异源多肽。这样的实例有铜诱导性金属硫堇基因(CUP1)启动子和糖解基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)和乙醇脱氢酶(ADH)的组成型启动子。酵母的转录终止区域来源于于几种酵母基因任何一种如异-1-细胞色素C(CYC1)的3′末端。
将编码本发明多肽的基因整合到一个含有一个遗传选择性标记系统的一个较大DNA分子上。该选择性标记系统可以是许多已知的标记系统中的任一种，以便标记基因授与被转化细胞一种可选择的新表型。例子包括编码生物合成酶如磷酸核糖氨茴酸盐异构酶(TRP1)或乳精酶核苷-5′-磷酸脱羧酶(URA3)的酵母基因或异源药物抗性基因如G418抗性或磷酸核糖氨茴酸盐异构酶(TRP1)或磷酸核糖抗性(BEN1)。该DNA分子也可以含有酵母的一个自主复制序列，例如酵母2微米环的ori区域或一个染色体自主复制区(ARS)如ARS1，以及一个酵母的着丝粒(CEN)如CEN3，以便质粒进行自主复制。
另有一些表达系统是已知的且容易利用。例如，各种昆虫细胞及其表达系统可有效地表达异源蛋白，如用于在鳞翅目细胞中表达异源蛋白的杆状病毒表达系统。如果需要在真核表达系统中实现表达时，必须使表面蛋白羧基末端的锚形区域缺失。例如缺失392-412位氨基酸，包含恶性疟原虫(P.falciparum)羧基末端锚形区域的序列是符合要求的。
另一个典型的表达系统涉及一种沙门氏菌属(Salmonella)细菌菌株，该菌株已用与一个E.Coli启动子序列有效连接的一个经选择的异源基因转化，该转化体能以组成型方式表达该异源基因产物。
利用经典蛋白质分离技术从产生的细胞培养物中分离和纯化以这种方式表达的多肽，这些技术是本领域内熟知的。一个典型的有效的纯化方案包括(1)细菌细胞的破碎，(2)澄清细胞碎片，(3)从已澄清的细胞抽提物中存在的其他多肽中分离本发明的多肽，(4)最后纯化步骤除去残留的污染物，包括残留的多肽，碳水化合物、核酸、脂多糖和内毒素。
对于本发明疫苗，可直接利用该多肽的一种水溶液，优选于生理PH中加以缓冲者。另一方面，该多肽也可与许多已知佐剂中任一种混合或吸附。这些佐剂包括，例如，氢氧化铝、胞壁酰二肽和皂甙如QuilA。另一个实例是，可将该多肽包裹于微粒体如脂质体中。在又一实施例中，借助常规技术，可将本发明多肽结合到一种免疫增长性大分子上，如灭活的博德特氏菌属(Bordetella)或破伤风类毒素，白喉毒素或霍乱B毒素。
NewTrendsandDevelopmentsinVaccines，(Volleretal.，Eds.，UniversityParkPress，Baltimore，MD，USA(1978))一书中对疫苗制剂作了一般性描述。在美国专利No.4，235，877中Fullerton描述了脂质体包裹。在Likhite的美国专利No.4，372，945和Armor等人的美国专利No.4，474，757中公开了蛋白质与大分子的结合。QuilA的利用由例如，Dalsgaardetal.，在ActaVet.Scand.，18349(1977)中公开。
在每一疫苗剂量中含有的多肽的量是诱导一种没有明显有害副作用的免疫予防性应答所需的量。该量系根据所用的特异性多肽和该疫苗是否含有佐剂而变化。大体上说，每一剂量需含有1-1000μg的多肽，优选10-200μg。一种特定疫苗的最佳量可通过标准研究法，包括观察抗体滴定度和试验对象产生的某些反应而确定。在第一次接种后，较好是在约4周后，再给试验者加强接种一次，以后只要存在有感染的危险，每过6个月加强接种一次。
一般优选通过肌肉内，皮下或静脉内途径将该试剂施用给病人，虽然在某些情况下，可通过其他途径。例如，当利用重组体沙门氏菌属(Salmonella)菌时，优选的施药途径是通过口服。
下列实施例解释本发明，而不是为了限制本发明。CS蛋白质编码序列由JamesWeber，WalterReed军事研究院提供，该序列作为一个含2337碱基对的λmPF1，EcoRI片段(Dameetal.，Science225593(1984))连接到pUC8的EcoRI位点上，是一种标准的E.Coli克隆载体(例如，可从Bethesda研究实验室，Inc.，GaithersburgMD获得)。得到的pUC8衍生物称为pUC8克隆1。
实施例1pNSl81RLf△9的构建简单说来，可按下述方法构建pNSlRLf△9用限制性核酸内，切酶FokⅠ消化第一等份pCSP(见下文所述)-一个含有编码恶性疟原虫(P.falciparum)环子孢子(CS)蛋白质之大约前18个氨基酸的1216碱基对大肠杆菌表达载体、充填末端(Klenow片段)并用限制性核酸内切酶BamHI消化之。用电洗脱法回收编码CS蛋白质之氨基酸19(Leu)至123(Pro)的318碱基对片段。
用限制性核酸内切酶TthlllⅠ消化第二等份pCSP，充填末端并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码CS蛋白质之氨基酸297(Gly)至412(Asn)的655碱基对片段。(该序列缺少含区域Ⅱ之侧接区的9个N末端氨基酸，即氨基酸288(Pro)至296(Gln))。
将318碱基对和655碱基对CS蛋白质基因片段连接到已用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化的大肠杆菌表达载体pUC18(见下述)中。所得载体定名为pUCRLf△9。
用限制性核酸内切酶BamHI消化pUCRLf△9，充填末端，并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码CS蛋白质氨基酸19至123和297至412的1035碱基对片段。用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化含有编码流感病毒非结构蛋白质1之N末端氨基酸1(Met)至81(Met)的DNA片段和合成DNA接头序列的表达载体pMG-1(详见下文所述)。然后将此前由pUCRLf△9中分离的1035碱基对片段连接到pMG-1中。所得表达载体pNSl81RLf△9编码具有下列序列的蛋白质NSl61-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412
有关pNSl81RLf△9的构建详述如下。
A.pCSP的构建在400μl培养基缓冲液(含有50mM Tris、50mM NaCl、1mM二硫苏糖醇(DTT)、和10mM MgCl2，PH7.5)中，37℃下用限制性核酸内切酶Stu Ⅰ和RsaⅠ(各100单位)将纯化的pUC8克隆1质粒DNA(40μg)消化1.5小时。在6%聚丙烯酰胺凝胶上用PAGE法分离所得到的编码环子孢子(CS)蛋白质大约前18个氨基酸(据信可编码CS蛋白质信号序列)的1216碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在200μl培养基缓冲液(同上所述)中，37℃下用限制性核酸内切酶BamHⅠ(25单位)将10微克表达载体pASl(ATCC 39262，详见Rosenberg的美国专利4，578，355号)消化1.5小时。然后于25℃下用DNA聚合酶Ⅰ，大片段(5单位Klenow片段在20mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、60mM NaCl、6mM2-巯基乙醇和各0.25mM四种脱氧核苷三磷酸中)将切割的质粒处理15分钟以末端充填BamHI位点。
在30μl连接酶缓冲液(含有50mM Tris、1mM DTT、10mM MgCl2、100μM rATP、pH7.5)中用1单位T4 DNA连接酶4℃下处理16小时，使环子孢子蛋白质基因片段(1μg)连接到该载体(100ng)中。
然后将该连接混合物转化到大肠杆菌菌株MM294CⅠ+中。得到并筛选CS基因片段插入pAS1中的氨苄青霉素抗性菌落。鉴定一个有正确构建的质粒(pCSP)。
B.pUCRLfW9的构建在400μl培养基缓冲液(同上所述)中，37℃下用限制性核酸内切酶FoKⅠ(100单位)将纯化的pCSP质粒DNA(100μg)消化3小时。然后用DNA聚合酶Ⅰ大片段(同上所述)处理该质粒，以末端充填FokⅠ位点。继之用BamHI(100单位)在400μl培养基缓冲液(见上述)中37℃下消化3小时。在6%凝胶上以聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)分离所得到的编码CS蛋白质之氨基酸19-123的318碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在400μl培养基缓冲液(见上述)中用限制性核酸内切酶TthlllⅠ(100单位)65℃下将另一等份pCSP(100μg)消化3小时。然后用DNA聚合酶大片段(同上所述)处理以充填TthlllⅠ位点。继之用SalⅠ(100单位)在400μl培养基缓冲液中37℃下消化该质粒3小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以电泳法分离所得到的编码CS蛋白质之氨基酸297-412的655碱基对片段并以电洗脱法回收之。
用BamHI和SalⅠ(各20单位)在200μl培养基缓冲液(同上所述)中37℃下将10微克表达载体pUC18(Yanish-Perronetal.，Gene，33103(1985))(为一标准的大肠杆菌克隆载体，如可得自BethesdaResearchLaboratories，Inc.，GaithersburgMD)消化2小时。然后用1单位T4DNA连接酶在30μl连接酶缓冲液(同上所述)中4℃下处理16小时，使318碱基对BamHI末端充填的/FokⅠ片段(1μg)和655碱基对TthlllⅠ末端充填的/SalⅠ片段(1μg)连接到pUC18中。鉴定有正确构建的质粒(pUCRLf△9)。
C.pMG-1的构建用BamHI和SacⅠ(各50单位)在200μl培养基缓冲液(见上述)中37℃下将10微克表达载体pMG27N-(M.Grossetal.，Mol.Cell.Biol.，51015(1985))消化3小时。
用NcoⅠ和BamHI(各20单位)在200μl高缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，10mM MgCl2和100mM NaCl，PH7.5)中将10微克含有流感病毒(A/PR/8/34)非结构蛋白质1(NSl)编码区(Baez，et al.，Nucleic Acids Research，85845(1980))的表达载体pAPR801(Young et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，806105(1983))37℃消化2小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以PAGE法分离所得到的编码NSl之前81个N末端氨基酸的230碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
连接40毫微克BamHI/SacⅠ切割的pMG27N-(见上所述)与80ng230碱基对NcoⅠ/BamHINS180编码片段和80ng有下列序列的合成接头5'CATGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT3'3'CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC5'
鉴定所得到的质粒pMG-1，该质粒应具有连接到pMG27 N-之BamHI位点上的NSl81编码序列的BamHI位点、连接到合成接头之NcoⅠ位点上的NSl81编码序列的NcoⅠ位点，以及连接到pMG27N-之SacⅠ位点上的合成接头的SacⅠ位点。该载体引入独特的限制性位点，以利于在三个读码的任何一个中插入DNA片段，从而在CⅡ核糖体结合位点之ATG起始密码子的所有三个码读下游区插入TGA终止密码子，当被表达时，可由所有这三个读码产生NSl81融合蛋白质。用NdeⅠ消化pMG-1，然后连接上述载体，导致非融合蛋白质(即未与NSl81融合)的表达。
D.pNSl81RLf△9的构建在400μl高缓冲液(同上所述)中用BamHI(100单位)37℃下消化表达载体pUCRLf(100μg)(3小时)。继后用DNA聚合酶I大片段(同上所述)处理被切割的DNA，以在末端充填BamHI位点。然后用SalⅠ(20单位)在400μl培养基缓冲液(同上所述)中37℃下将该质粒消化3小时。用6%聚丙烯酰胺凝胶以PAGE法分离所得到的1035碱基对片段，并以电洗脱法回收之。
在400μl培养基缓冲液(同上所述)用EcoRV和XhoⅠ(各25单位)37℃下将表达载体pMG-1(10μg)消化3小时。然后在30μl连接酶缓冲液中用1单位T4DNA连接酶4℃下处理16小时，将1035碱基对得自pUCRLf的BamHI末端充填的/SalⅠ(400μg)片段连接到该载体(100ng)上。
将连接混合物转化到大肠杆菌菌株MM294CI+中。得到氨苄青霉素抗性菌落并筛选含有以适当方向插入之基因的克隆。鉴定正确构建的质粒(pNSl81RLf△9)，转化到大肠杆菌菌株AR58(cIts857)中并检测环子孢子蛋白质的表达。该蛋白质缺少前18个N末端氨基酸(CS1-18)、中心重复区域，以及含区域Ⅱ之侧翼区(RLf△9)的9个N末端氨基酸(CS248-296)，并通过得自连接到pMG-1表达载体中之合成接头的6个氨基酸(Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp)融合到流感病毒非结构蛋白质1的81个N末端氨基酸(NSl81)上。
NSl81RLf△9具有下列序列NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412将Asp(来自合成接头的C末端)与RLf△9(CS19-123-CS297-412)分隔开的脯氨酸是充填pCSP中BamHI/FokⅠ片段之BamHI位点时人工加入的。
使细胞于32℃下在Luria-Bertani培养液中生长，直到650nm(A650)吸光率为0.6，并于42℃下进行温度诱导3小时，以开通表达质粒之PL启动子的转录过程，继而转译NS81CS蛋白质衍生物。以1ml等份取细胞样品，离心沉淀并悬浮于溶解缓冲液(10mM Tris-HCl，PH7.8，25%(v/v)甘油、2%2-巯基乙醇、2%十二烷基磺酸钠(SDS)0.1%溴酚兰)中，然后在105℃烘箱中保温5分钟。
用SDS-PAGE法(13%丙烯酰胺，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝30∶0.8)分离蛋白质。将蛋白质转移到硝化纤维素滤膜上，并使用可与称为区域I的CS蛋白质(Dame et al.，Science 225593(1984))有反应活性的多克隆抗体及与NSl81蛋白质有反应活性的多克隆抗体，以Western印迹法检测大肠杆菌中产生的NSl81RLf△9蛋白质。结果还表明该大肠杆菌产生的NSl81RLf△9蛋白质与抗恶性疟原虫(P.falciparum)CS蛋白质之四肽重复区的5份单克隆抗体合并物无反应活性。
实施例2pNSl81RLfAuth的构建在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶BamHI和FOKI消化大肠杆菌表达载体pCSP(同上所述)。用电洗脱法回收所得到的编码含区域I侧翼区(去掉前18个N末端氨基酸)的DNA片段。
在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶TthlllⅠ和SalⅠ消化第二份pCSP。用电洗脱法回收所得到的编码含区域Ⅱ之侧翼区(少前9个N末端氨基酸)的DNA片段。
在培养基缓冲液中用限制性核酸内切酶BamHI和SalⅠ消化大肠杆菌表达载体pUC18(同上所述)。
为了重新得到含区域Ⅱ的CS蛋白质中心重复区域之C末端侧翼区区的9个N末端氨基酸(CS288-296)(这些氨基酸是在用TthlllⅠ消化的pCSP时丢失的)，制备有下列序列的、含FokⅠ末端和TthlllⅠ末端的合成DNA片段
AspProGlyAsnLysAsnAsnGlnGlyAsnGlyGlnFokI5'ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA3'Tth lll I3'GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT5'将BamHI/FokⅠ片段、TthlllⅠ/SalⅠ片段及该合成片段连接到BamHI/SalⅠ消化的pUC18中。
在培养基缓冲液中，用限制性核酸内切酶BamHI消化所得到的质粒pUCRLfAuth，进行末端充填，并用限制性核酸内切酶SalⅠ消化之。用电洗脱法回收所得到的编码缺少前18个N末端氨基酸及中心重复区域之确切环子孢子蛋白质的DNA片段。
然后将分离的BamHI末端充填的/SalⅠ片段连接到编码NSl81的大肠杆菌表达载体pMG-1(同上所述)中，所说的载体先前已用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化过。所得到的表达载体pNSl81RLfAuth表达具有下列序列的蛋白质NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412其中将含区域Ⅰ和区域Ⅱ的CS侧翼区(CS19-123和CS288-412)分隔开的甘氨酸是由合成的FokⅠ/TthlllⅠDNA人工接头序列表达的。
NSl81RLfAuth的完整核苷酸和氨基酸序列可由已公开的欧洲专利申请90304720.7号(申请日为1990年5月1日)中查到，该专利申请整个公开文本已列为本文参考文献。
实施例3pNSl81RLfAuth+(NANP)2的构建在培养基缓冲液(同上所述)中，25℃下用限制性核酸内切酶SmaⅠ将pNSl81RLfAuth(同上所述)消化3小时。
将具有下列序列的人工合成DNA接头连接到SmaⅠ消化的pNSl81RLfAuth中AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro5'AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC3'3'TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG5'该合成DNA接头编码(NANP)2(单字母符号各代表下列不同的氨基酸，N＝天冬酰胺(Asn)、A＝丙氨酸(Ala)、P＝脯氨酸(pro)，即含有所谓CS蛋白质免疫优势重复区域之相符序列的四肽。用限制性核酸内切酶SmaⅠ消化pNSl81RLfAuth，可使由合成DNA接头编码的任何数目的重复四肽连接到CS蛋白质中先前被免疫优势区占据的区域。可依这一方法将其他四肽编码DNA片段连接到载体中。所得到的质粒pNSl81RLfAuth+(NANP)2编码有下列序列的蛋白质NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(NANP)2-Gly-CS*实施例4pNSl81(NANP)4RLfAuth的构建用限制性核酸内切酶BamHI消化表达载体pUCRLfAuth(见上所述)。
将编码(NANP)4的合成DNA片段连接到BamHI消化的pUCRLf中。合成DNA片段具有下列序列ProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro5'GATCCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCTAACCCCAACGCTAACCCC3'3'GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTGCGATTGGGGTTGCGATTGGGGCTAG5'所得到的质粒被定名为PUC18(NANP)4RLfAuth。
用限制性核酸内切酶BamHI消化表达载体pUC18(NANP)4RLfAuth。进行末端充填(Klenow片段)、再用限制性核酸内切酶SalⅠ消化，并以电洗脱法回收所得到的DNA碱基对片段。
将BamHI末端充填的/SalⅠ片段连接到先前已用限制性核酸内切酶EcoRV和XhoⅠ消化的上述编码NSl81的表达载体pMG1中。所得到的质粒被定名为pNSl81(NANP)4RLfAuth。它所编码的蛋白质中，由合成DNA片段编码的重复四肽被插入到NSl81之氨基酸81(Met)和NcoⅠ/SacⅠ合成DNA接头NSl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412的N末端Asp之间。
实施例5pNSl81(NVDP)4RLfAuth的构建
pNSl(NVDP)4RLfAuth的构建与上述pNSl81(NANP)4RLfAuth的构建方法相似，不同的是所用的编码(NVDP)4(CS蛋白质中心重复区的变异四肽序列)的合成DNA接头具有下示序列AsnValAspProAsnValAspProAsnValAspProAsnVal5'GATCCCAATGTAGACCCCAACGTTGATCCGAACGTAGACCCGAATGTA3'3'GGTTACATCTGGGGTTGCAACTAGGCTTGCATCTGGGCTTACAT5'所得到的质粒编码有下列序列的蛋白质NSl81(NVDP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-GlyCS288-412实施例6由大肠杆菌中分离NSl81RLf△9在温度敏感性λ细胞溶素原(CI857)中诱导NSl81RLf△9合成之后，离心收集细菌细胞并将沉淀的细胞团块置于-70℃下冷冻。在120ml含有50mM Tris(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、10mM己二胺四乙酸(EDTA)、5%甘油和10mM二硫苏糖醇的溶解缓冲溶液(PH8)中稀释，以融解大约12g浓缩并冷冻的细胞。向稀释的细胞内加入溶菌酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)至终浓度为0.2mg/ml，并将溶液于4℃下搅拌30分钟。用Branson超声发生器对细胞进行超声处理，直到溶液完全呈现液化状态。加入脱氧胆酸盐至终浓度为0.1%(v/v)，并于在SorvallRC5B离心机(Dupont)中，以15，600xg将溶液4℃离心30分钟。
弃去上清，并将含蛋白质的沉淀团块悬浮于100ml含有50mM甘氨酸、2mM EDTA和5%甘油的缓冲溶液(pH10)中。按上述方法超声处理该悬浮液并加入Triton
X-100(Sigma)至终浓度为1%(v/v)。将经超声处理的溶液于4℃下搅拌30分钟并按上述方法离心。
向含蛋白质的上清内加入尿素至终浓度为8M，并用50%乙酸溶液滴定至PH5.5。样品在预先用含有20mM乙酸钠、1%Triton X-100和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)中平衡过的25mlQAE Sepharose
Fast Flow柱(pharmacia)上，以300cm/小时的流速层析。收集含蛋白质的未结合部分并加于预先用含有20mM乙酸钠和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)平衡过的10ml SP Sepharose
Fast Flow柱(Pharmacia)上，以120cm/小时的流速层析。监测流出物的280nm吸光率。用含有100mM Tris和8M尿素的缓冲液(PH8)由该柱上洗脱蛋白质。
所得产物的SDS-PAGE分析显示出一条表观分子量为40，000KD的主带，且其纯度约为80%。纯化过程得到了12mg蛋白质，其中每毫克蛋白质约含有14单位内毒素。
实施例7由大肠杆菌中分离NSl81RLf△9在温度敏感性λ细胞溶素原中诱导NSl81RLf△9合成之后，离心收集细菌细胞并于-70℃下冷冻所得细胞团块。在2200ml含有60mMTris、12mMEDTA、6%甘油和12mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲溶液(PH8.0)中稀释约636g浓缩并冷冻的细胞，使之融解。使融解的细胞以6000-7000psi通过MantonGaulin匀浆器两次。加入10%脱氧胆酸盐溶液至终浓度为0.1%(v/v)，溶解物于4℃下搅拌30分钟并在SorvallRC5B离心机(Dupont)中以10，000Xg4℃离心60分钟。
弃去沉淀物并向每毫升含蛋白质上清液内加入25μl1050或2100Biocryl小珠混合物(Supelco)。按上述方法搅拌并离心溶液。
弃去沉淀物并于5分钟时间内加入固体硫酸铵，使含蛋白质上清内的硫酸铵达到20%饱和度。
按上述方法搅拌并离心样品。将沉淀物悬浮于400ml含有20mM乙酸钠、1%Triton
X-100和8M尿素的缓冲溶液(PH5.5)中。离心该悬浮液并使上清对含有100mM Tris和8M尿素的缓冲溶液(pH8.0)透析。将余留物的PH调到5.5并在100ml预先用含20mM乙酸钠、1%Triton X-100和8M尿素的缓冲溶液平衡的SP Sepharose
Fast Flow柱(Pharmacia)上层析(流速10ml/分钟)。先用平衡缓冲液，然后再用含0.1M Tris和8M尿素的缓冲液(PH8)洗柱。用500ml在含0.1M Tris和8M尿素的缓冲液(pH8)中制备的0.0至0.5M氯化钠线性梯度溶液洗脱。
于0.3M氯化钠浓度时洗脱蛋白质。合并含目的产物的各部分，使用YM10滤膜在Amicon搅拌小室内浓缩，并对含20mMTris的缓冲溶液(PH8.0)透析，然后对磷酸盐缓冲盐水(PH7.0)透析。
对所得产物的SDS-PAGE分析显出一条表现分子量约40，000KD的主带和一系列小组分带。纯化过程产生25mg蛋白质，其中每毫克蛋白质含有144内毒素单位。
实施例8由大肠杆菌中分离R16CSP将分离自pUC8克隆1(见上述)的XhoⅡ片段连接已用限制性核酸内切酶BamHI消化的pCsp(见上述)中，以制备在大肠杆菌中表达的R16CSP。按下述方法纯化实施例9中用作ELISA俘获抗原的R16CSP。
诱导大肠杆菌中的R16CSP合成之后，离心收集细菌细胞，并于-20℃下冷冻所得的细胞团块。在1.43升含50mMTris、10mMEDTA、5%甘油和10mM二硫苏糖醇的缓冲液中融解大约373g浓缩并冷冻的细胞。加入10%脱氧胆酸盐(W/V)溶液至终浓度为0.1%(v/v)，然后使细胞以7，000psi两次通过Manton-Gaulin匀浆器。向匀浆内加入在0.5MTris(pH8.0)缓冲液中的10%聚乙烯亚胺(BRL)溶液(w/v)，至终浓度为0.5%。所得溶液于4℃下搅拌1小时，并在SorvallRC2B离心机(Dupont)中以13，000Xg4℃离心45分钟。
弃去沉淀物，向上清内加入固体硫酸铵，使之于5分钟时间达到35%饱和。按前述方法搅拌并离心所得溶液。
将沉淀团块悬浮于300ml含20mMTris和10mMEDTA的缓冲液(pH8.0)中。加入含300ml8M尿素、2.7升10mM乙酸钠和4M尿素的溶液，并直接将pH调到4.0。按前述方法离心样品。
将上清液加于50ml预先用含20mM乙酸钠和4M尿素的缓冲液(pH4.0)平衡过的SP-Sepharose
，，Fast Flow柱(Pharmacia)上。用含20mM乙酸钠的缓冲液(pH5.0)洗柱并用250ml含有0.0至1.0M氯化钠(在洗涤缓冲液中)的线性梯度溶液洗脱。产物于大约0.3M氯化钠时被洗脱。
用10%三氟乙酸(TFA)(v/v)将50ml等份的离子交换产物调到pH2.3并在已用0.1%TFA平衡的C4反相柱(Vydac，1×25cm)上层析。用在0.1%TFA中的0至60%乙腈(ACN)的线性梯度过柱45分钟并在约60%ACN处洗脱产物。加入1M碳酸氢铵(至25μl/ml)，以中和反相层析产物。
约45ml反相层析产物对含2M盐酸胍的缓冲液(pH5.0)透析，并在YM30膜(Amicon)上浓缩到20ml。取10ml样品，在预先用含2.0M盐酸胍之缓冲液(pH5.0)平衡的Superose
12柱(Pharmacia)(2.5×50cm)上层析。将洗脱的表观分子量约358KD的产物对含有20mM乙酸钠的缓冲液(pH4.5)透析。
上述层析产物经考马斯染色SDS-PAGE分析后，显示出两条分子量约72KD和70KD的带。对终产物的N末端氨基酸序列分析，结果在15%预期值之内。
实施例9小鼠对NSl81RLf△9的抗体反应为了估计其免疫原性，将纯化的NSl81RLf△9抗原接种到三个品系，即C57BL/6(H-2b);BALB/C(H-2d)和C3H/HEN(H-2k)小鼠体内。先前已经证明，只有那些H-2b单倍体的小鼠才产生抗恶性疟原虫CS蛋白质之重复性抗原决定基的抗体。将抗原与弗氏佐剂一起注射并以酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选被免疫动物的血清样品。用R32tet32(一种含有CS蛋白质之重复四肽的抗原)免疫对照组动物。用NSl81RLf△9接种的所有三个品系的小鼠均产生了与CS蛋白质之非重复区有反应活性的抗体。免疫原性试验的具体方法及结果如下所述。
将三个品系的小鼠各分成两组，每组包括四至五只动物。用NSl81RLf△9免疫第一组动物，用R32tet32(J.Young et al.，Science，228958(1985))免疫第二组动物。R32tet32含有两个XhoⅡ片段，各片段编码-具有序列[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)]2的肽。tet32是由读码外的四环素抗性基因编码的32氨基酸肽。
给药之前将按实施例6所述方法纯化的NSl81RLf△9抗原与完全弗氏佐剂混合。每只小鼠(6至8周令)右后肢皮下注射50μg抗原(200μl)。共免疫两次，第一次注射与完全弗氏佐剂混合的50μg抗原(200μl)。4周后按第一次免疫的相似方法进行加强注射，不同的是抗原加不完全弗氏佐剂一起乳化。
第二次免疫后7天放血。合并每组动物的全血，4℃过夜使血液凝固，然后离心分离血清并于-70℃下储存。用ELISA法检测各份合并之血清中的抗R32tet32、NSl81RLf△9或R16CSP抗体。
“夹心”ELISA法中掺入了R32tet32、R16CSP和NSl81RLf△9，作为俘获抗原被吸附到微量滴定板的小井壁上。
向各小井内加入50μl含0.75μg俘获抗原和0.2μg煮沸之酪蛋白的PBS溶液，而使俘获抗原吸附到微量滴定板的小井壁上。该溶液是向2.5ml含4μl0.5%煮沸之酪蛋白溶液(见下文所述)内加入8μl(3.76μg)俘获抗原，然后再加到5ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)(为含有0.8%NaCl、0.217%Na2HPO4-7H2O、0.02%KH2PO4和0.02%KCl的水溶液，PH＝7.4)中而制成的。
室温下保温过夜后，吸出小井内容物并用煮沸的0.5%酪蛋白溶液(5g/L酪蛋白(J.TBakerChemicalCo.)、0.1g/LThimersol(SigmaChemicalCo.)、0.02g/L酚红(SigmaChemicalCo.)、900mlPBS(PH7.4)和100ml0.1NNaOH)与1%吐温20(聚氧乙烯山梨糖醇酐-月桂酸酯，SigmaChemicalCo.)的混合物(99∶1)封闭滴定板上余留的活性结合部位。
用含有0.025%吐温20的0.5%煮沸酪蛋白溶液，以1∶100、1∶1000、1∶10，000、1∶100，000和1∶1000，000倍稀释小鼠血清样品。将试验血清加到小井内，保温2小时后除去血清并用含0.05%吐温20的PBS溶液将各小井洗2次。将抗小鼠IgGAb结合到过氧化物酶上，用稀释血清的同一稀释剂稀释2，000倍，然后加到小井内。保温1小时后，吸出小井内容物，用含有0.05%吐温20的PBS溶液洗3次，并加入澄清的过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard&Perry，按厂商推荐的方法制备)。过氧化物酶与底物反应后生成一种暗绿色产物，其颜色的强度与存在于血清样品中的抗体量成比例。15分钟后使用ELISA平板读出器读出405-414nm的吸光率，并以光密度(O.D.)单位记录结果。
所有接种NSl81RLf△9抗原的三个品系的小鼠(C3H/HEN(H-2k)、BALB/C(H-2d)和C3H/HEN(H-2b))均产生了与环子孢子蛋白质的非重复区有强反应活性的抗体。与NSl81RLf△9俘获抗原的反应性仅稍大于R16CSP(R16CSP俘获抗原只可检测抗CS蛋白之非重复部分的抗体，而NSl81RLf△9俘获抗原则可检测抗NSl81和抗RLf△9抗体)。如所期望的，C3H/HEN小鼠并没有产生抗R32tet32抗体，而C57BL/6小鼠则产生了这种抗体。虽然比在C57BL/6小鼠观察到的抗体反应弱得多(差1个数量级)，但BALB/C小鼠对R32tet32的抗体反应并不象所预略的那样，而且与文献中报导的这种单倍体小鼠对(NANP)40的阴性反应相反(Del Giudice et al.，J.Immunol.，1372952(1986)，用没有载体蛋白的(NANP)40免疫包括BALB/C(H-2d)在内的14个品系以上之携带9个不同H-2单倍体的小鼠，其中只有H-2b小鼠有抗(NANP)40抗体反应。H-2d小鼠(BALB/C)完全没有反应。用偶联钥孔
血兰蛋白(作为载体蛋白)的(NANP)40免疫的BALB/C小鼠没有产生抗(NANP)40抗体)。
实施例10子孢子侵入抑制作用(ISI)该项研究中，试验了用NSl81RLf△9免疫的兔血清抑制恶性疟原虫子孢子进入肝细胞(子孢子发育成熟为红细胞外阶段的部位)的能力。
用NSl81RLf△9(与完全弗氏佐剂或氢氧化铝混合注射)免疫三个小鼠品系(BALB/C、C57BL/6和A/J)，而产生高滴度抗CS蛋白非重复区的抗体。但按照Hollingdale，M.R.等人(J.Immunol.，132(7)909(1984))所述的子孢子侵入抑制(ISI)试验法检测时，发现这些小鼠的血清不能阻断子孢子侵入培养的人肝癌细胞(HepG2-A16)内。
相反，于0.3和7周时用100μg NSl81RLf△9免疫(与完全弗氏佐剂混合注射)的新西兰白兔则产生了升高滴度的抗CS蛋白非重复区抗体(尽管比在小鼠体内测得的滴度低)。但按照Hollingdale ISI检测法检测时，证明用NSl81RLf△9免疫的兔血清可显著地抑制(一只动物为98%，平均抑制率为大约60%)子孢子侵入肝癌细胞。
恶性疟原虫氯奎抗性株(7G8株)和恶性疟原虫氯硅敏感株(NF54株)的子孢子均可明显地受到用NSl81RLf△9免疫之兔血清的抑制，而不能进入肝癌细胞内。对7G8株恶性疟原虫子孢子侵入肝癌细胞的抑制率(平均85%)高于用ISI方法测得的对NF54恶性疟原虫株子孢子进入肝癌细胞的抑制率(平均60%)。
在用正常人肝细胞代替人肝癌细胞的ISI试验中，可见用NSl81RLf△9免疫的兔血清能够抑制NF54恶性疟原虫株子孢子进入肝细胞(其中一只兔的血清抑制率为89%，平均抑制率约为45%)。
这些研究提示NSl81RLf△9抗原上存在子孢子中和抗原决定基。
实施例11子孢子中和抗原决定基的鉴定简单地说，用在完全弗氏佐剂或氢氧化铝中乳化的NSl81RLf△9免疫三个品系(即BALB/C、C57BL/6和A/J)的小鼠，以产生高滴度抗CS蛋白质非重复区的抗体。但按照Hollingdale，M.R.et al.，J.Immunol.，132(7)909(1984)中所述的子孢子侵入抑制检测法进行试验时，证明这些小鼠的血清不能阻止子孢子侵入培养的人肝癌细胞(HepG2-A16)。
然后用Geysen等人(“StrategiesforEpitopeAnalysisUsingPeptideSynthesis”，J.Immunol.Methods，102259-274(1987))的pepscan分析法进一步分析小鼠和兔血清。简单地说，合成制备一整套同整个恶性疟原虫CS蛋白质序列同源的交迭六肽，各六肽均偶联到聚丙烯小棒上。以1∶500倍稀释按实施例9所述用RLf△9免疫之小鼠和兔的血清，并与上述小棒一起于4℃下保温过夜。重复洗涤小棒并用结合到种间抗体上的碱性磷酸酶检测被结合的抗体。洗涤几次后，使小棒与底物接触1小时。读出414nm吸光率并将结果描绘在有其相关序列的适当点上。分析六肽反应可鉴定出下述5个子孢子中和抗原决定基。
使用上述方法，鉴定出本发明的下述肽，以作为恶性疟原虫的子孢子中和抗原决定基肽1Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys肽2Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys肽3Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn肽4Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala肽5Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp可使用本申请提供的方案以常规合成技术制备上述的任何一种肽。
肽1至5中的任何一个均可偶联到免疫增强大分子如包括但不仅限于破伤风类毒素、白喉毒素和霍乱B毒素上。最好通过有助于使肽偶联到载体蛋白上的氨基酸残基，如包括但又仅限于半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸进行偶联。也可通过偶联剂，即可使肽接到载体蛋白上的试剂进行偶联。有用的偶联剂包括但不只限于戊二醛。最好通过一种促进剂和偶联剂进行偶联。
例如，可以其N末端为半胱氨酸合成肽4并通过其N末端的半胱氨酸，使用戊二醛作偶联剂将所得到的序列偶联到破伤风类毒素上(下文将所得到的杂合蛋白质称为肽101)。也可以其N末端和C末端均为半胱氨酸的合成肽4，使用戊二醛作偶联剂，通过其N末端半胱氨酸和C末端半胱氨酸，将所得序列偶联到破伤风类毒素上(下文将所得到的杂合蛋白质称为肽106)。
例如，可按1mg/ml的浓度将肽4(其N和C末端均为半胱氨酸)悬浮于PBS(pH7.4)中。加入破伤风类毒素，达到终浓度1mg/ml。在搅拌肽和蛋白质的同时加入戊二醛至终浓度为3%。反应于室温下进行1小时。所得到的杂合蛋白质(肽106)对PBS透析以除去游离肽和戊二醛。
用偶联的肽(即肽101和106)免疫(加弗氏完全佐剂和不完全佐剂)兔，并对血清作ISI试验。所得结果如下血清%ISI抗肽1017150抗肽10699.289ISI是试验血清对子孢子侵入的百分降低率与预免疫或未免疫血清存在下之百分降低率相比较的值。从上示结果可以看出，肽101和106显然可引发ISI活性。肽106特别有活性。
可以通过常规技术，以相似方法将肽1-5中的任何肽或所有肽，以任何次序或任何组合方式偶联在一起，然后通过所得N末端和/或C末端上的氨基酸残基(如半胱氨酸残基)以及偶联剂(如戊二醛)，偶联到免疫增强大分子(如破伤风类毒素)上。所得杂合多肽可用作本发明的疫苗。
应特别提到的是，可通过常规技术，将肽反向转译成DNA序列，从而通过常规重组技术以单体或聚合物的形式表达蛋白质，以产生由肽1至5的任何一个氨基酸序列编码的任何蛋白质。还应特别提到的是，可通过常规技术将肽反向转译成DNA序列，从而可利用遗传工程技术将所得的DNA序列融合到所需的免疫增强编码序列(如破伤风毒素)和/或表达增强序列上，然后可通过常规DNA重组技术表达所得到的杂合氨基酸编码序列，以产生由肽1至5衍生的任何所需之杂合肽。
因此，在某些具体实例中，本发明的多肽包括一个或多个上面鉴定的免疫原性抗原决定基。可以推想，用本领域内已知的常规技术可以制得上述肽的功能性等同物，即加工子孢子中和活性的衍生分子。例如，当与已鉴定的氨基酸序列相比较时，这些功能等同物可在保留子孢子中和活性的前题下有一个或多个氨基酸缺失、置换和/或加入。
权利要求
1.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Piasmodium)表面蛋白的第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Piasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇以及含有较少(少于全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中来自第一侧面区域的所说致免疫决定簇中至少有一个是由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys；Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys；或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn；或是该序列的功能等同物。
2.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇以及含有较少(少于全部)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中来自第二侧面区域的所说的致免疫决定簇中至少有一个是由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或该序列的功能等同物。
3.一种多肽，该多肽含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第一侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，和来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白第二侧面区域的一个或多个致免疫决定簇，以及含有较少(少于全部总数)或不含有来自两侧面区域之间的重复区的重复性致免疫决定簇，其中至少有一个来自第一侧面区域的所说的致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;或Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;且其中至少有一种来自第二侧面区域的所说致免疫决定簇由下列氨基酸序列编码Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或者它们的功能等同物。
4.一种多肽，该多肽含有少于全部或不含有来自疟原虫(Plasmodium)表面蛋白重复区的重复性致免疫决定簇，且至少一个肽由下列氨基酸序列编码Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys;Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala;或Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;或该序列的功能等同物。
5.根据权利要求1-4所说的任一种多肽，它是一种杂交多肽。
6.根据权利要求5所说的多肽，该杂交多肽是通过肽与一种载体蛋白化学融合得到的。
7.根据权利要求6所说的多肽，其中载体蛋白是破伤风类毒素，白喉毒素或霍乱B毒素。
8.根据权利要求7所说的多肽，其中的化学融合是通过戊二醛作为偶联剂介导的。
9.根据权利要求7所说的多肽，其中与破伤风类毒素的融合是以该肽N-末端的半胱氨酸残基介导。
10.根据权利要求7所说的多肽，其中与破伤风类毒素的融合是以肽N-末端的一个半胱氨酸残基及肽的C-末端的一个半胱氨酸残基介导。
11.根据权利要求10所说的多肽，该多肽是通过偶联剂戊二醛将氨基酸序列Cys-Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Cys与破伤风类毒素偶合得到的。
12.一种编码权利要求1-11中任一项所说的多肽的表达载体。
13.一种预防人体受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的疫苗，该疫苗包含一种免疫予防量的权利要求1-11中任一项所说的多肽和一种药物学上可接受的载体。
14.给需要预防免受疟原虫(Plasmodium)子孢子感染的人体免疫接种的方法，该方法包括给这样的人体施用有效的、无毒量的权利要求13所说的疫苗。
全文摘要
抗疟原虫(Plasmodium)属寄生虫感染的疫苗，为抑制疟原虫感染的作为治疗剂用多肽，该多肽含有来自位于一个中央重复区侧面的一种疟原虫(Plasmodium)表面蛋白区域的致免疫决定簇以及含有较少(少于全部总数)来自重复区的重复性致免疫决定簇；以及给人体医治疟疾感染的方法。
文档编号C07K19/00GK1053814SQ9011012
公开日1991年8月14日 申请日期1990年12月8日 优先权日1989年12月8日
发明者米歇尔·S·格罗斯, 丹尼尔·M·戈登, 迈克尔·R·霍林代尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 美国陆军部, 生物医学研究院
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