一种嗅前体细胞的制备方法与流程

[0001]
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种嗅前体细胞的制备方法。


背景技术：

[0002]
嗅前体细胞也称嗅神经前体细胞(onps)，起源于嗅基底膜，分布在嗅球和嗅粘膜。因可分化为嗅鞘细胞和嗅神经元，其属于外胚层的一类神经祖前体细胞，具有自我更新和定向分化发育的潜能，可分泌神经营养因子、轴突生长刺激物质，能促进轴突的再生和髓鞘的形成，而这些因子都能支持轴突的延伸，具有神经营养、保护、免疫调控或刺激、抑制胶质增生及瘢痕形成、促髓鞘化和轴突再生等综合神经修复作用。嗅前体细胞这些特性可为损伤神经修复及功能恢复建立很好的内环境，使其成为治疗中枢神经疾病和损伤的理想候选细胞，在临床上具备广泛的应用前景。
[0003]
因此，当前如何对嗅前体细胞进行安全和有效的体外培养、扩增对其广泛用于基础和临床应用研究中具有重要的影响。然而，现有技术中国内外嗅前体细胞研究方面尚存有以下缺陷：
[0004]
1.制备嗅前体细胞时，组织标本取材部位差异大，同时增加成纤维细胞和造血干细胞污染的机会。
[0005]
2.当前的制备方法多使用酶解法消化组织，限制了原代嗅前体细胞的获取量、纯度等。
[0006]
3.当前的制备方法中培养基的选择限制了获得嗅前体细胞的扩增效率和获得的细胞纯度。
[0007]
4.当前的制备方法中，嗅前体细胞的传代培养方式及传代次数影响了得到的嗅前体细胞的存活状态和纯度。
[0008]
基于以上，当前对新的嗅前体细胞的制备方法存在迫切需求。


技术实现要素：

[0009]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种嗅前体细胞的制备方法，本发明提供的方法能在体外培养并高效扩增嗅前体细胞，从而获得高纯度的嗅前体细胞。进一步地，本发明提供的制备方法优化了嗅前体细胞的取材部位和对组织的处理方法。与现有技术相比，本发明的方法突破了当前的技术中关于传代和纯度的技术瓶颈，在国内外的实验和临床应用研究中潜力巨大，拥有广泛应用前景，为临床用细胞研究提供有力的保障。
[0010]
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011]
一方面，本发明提供了一种嗅前体细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]
(1)取上鼻甲和中鼻甲之间处的嗅粘膜组织，并进行无菌处理；
[0013]
(2)在36-38℃下，使用1-2倍体积的浓度为5％(g/100ml)的胰蛋白酶和1-2倍体积的浓度为0.2mmol/l的乙二胺四乙酸(edta)水溶液预处理步骤(1)得到的嗅粘膜组织块5-15分钟；
[0014]
(3)去除经步骤(2)预处理后的嗅粘膜组织块的表膜和底膜松动层，并用磷酸缓冲溶液(pbs)冲洗2-5次，并制备为0.5-1.5mm
3
的小块；
[0015]
(4)使用嗅前体细胞培养基培养步骤(3)处理后的小块，使其贴壁生长；
[0016]
其中，所述嗅前体细胞培养基包含以下组分：
[0017]
基础培养基dmem/df12、表皮细胞生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、n2细胞培养添加剂、b27细胞培养添加剂、牛血清白蛋白(bsa)、谷氨酰胺和neaa细胞培养添加剂；
[0018]
(5)当贴壁生长的细胞生长融合率达到75％-90％，收集单细胞，并加入嗅前体细胞培养基制备成细胞悬液，得到所述嗅前体细胞；
[0019]
其中，上述操作均在严格无菌条件下进行。
[0020]
根据本发明所述的制备方法，其中在步骤(1)中，使用标本组织咬钳取供者上鼻甲和中鼻甲之间处的嗅粘膜组织，并将取得的鼻粘膜组织块放入冰盒中。
[0021]
根据本发明所述的制备方法，其中在步骤(1)中，所述无菌处理采用医学无菌操作。
[0022]
根据本发明所述的制备方法，其中所述步骤(3)在解剖显微镜下进行。
[0023]
根据本发明所述的制备方法，其中步骤(3)还包括以下步骤：
[0024]
将小块制备为0.2-0.4mm
3
的小小块，并使用含有160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基反复洗涤小小块；
[0025]
优选地，步骤(3)还包括以下步骤：
[0026]
将小块置于加有160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基中，反复冲洗，用眼科组织镊撕成0.2-0.4mm
3
左右，收集小小块置于离心管内，离心机转速为800-2100转/分钟，离心10-30分钟，弃掉上清；重新加入含160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，再次离心10-30分钟，离心机转速为800-2100转/分钟。
[0027]
根据本发明所述的制备方法，其中在步骤(4)中，在细胞培养前，使用血清原液(gibco 16000044)润湿培养装置。
[0028]
根据本发明所述的制备方法，其中在步骤(4)中，所述培养条件为避光、37℃、5％的co
2
。
[0029]
根据本发明所述的制备方法，其中在步骤(4)中，所述嗅前体细胞培养基包含以下组分：
[0030]
90ml的dmem/df12(11320gibco)、80mg egf(pepro tech)、60mg fgf(pepro tech)、2ml 1％的n2细胞培养添加剂(gibco 17502-048))、3ml 2％的b27细胞培养添加剂(gibco 17504-044)、150mg bsa(sigma)、0.2mmol/ml谷氨酰胺(gibco)和2ml neaa细胞培养添加剂(100x，11140050)；
[0031]
优选地，所述嗅前体细胞培养基还包含以下组分：
[0032]
p63、p53抑制剂pifithrin-αhydrobromide(63208-82-2)/pifithrin-μ(64984-31-2)，使用浓度范围为5-20μmol/l，以在细胞生产过快时抑制其生长；
[0033]
或p63、p53激动剂prima-1met(19980)/tenovin-1(13423)，使用浓度范围为1-10μmol/l，以在细胞生产过慢时促进其生长。
[0034]
根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤(4)中和步骤(5)中，每三天更换一次嗅
前体细胞培养基。
[0035]
根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，当贴壁生长的细胞生长融合率在55％-85％时，收集小块，并转移到新的培养装置中重复培养；
[0036]
优选地，所述小块重复使用5-7次，以制备5-7批嗅前体细胞。
[0037]
根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤(5)中，所述收集单细胞包括以下步骤：
[0038]
使用dmem/f12溶液冲洗培养装置，用0.05％(g/100ml)胰蛋白酶和0.2mmol/l乙二胺四乙酸(edta)水溶液使贴壁的单个细胞脱落，离心收集单细胞，加入嗅前体细胞培养基制成细胞悬液；
[0039]
优选地，所述单细胞悬液的细胞密度为1
×
10
5
/ml-1
×
10
6
/ml。
[0040]
根据本发明所述的制备方法，其中，在步骤(5)中，所述嗅前体细胞每2-3天传代一次，进行1-3代传代培养。
[0041]
本发明还提供了根据本发明的方法获得的嗅前体细胞，其中所述嗅前体细胞的单个细胞可连续传11代以上。
[0042]
本发明提供的嗅前体细胞可以制备为嗅鞘细胞或嗅神经元细胞，详见中国发明专利201510935540.3或201510516055.2，其全部内容通过引用并入本文。
[0043]
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
[0044]
1.本发明的方法优化了组织标本取材部位，并结合培养前对取材组织使用多酶预处理方案，以及在后续的培养过程中去除，可减少造血干细胞和成纤维细胞的污染，提高细胞纯度。
[0045]
2.本发明的方法可以反复植块培养并获得嗅前体细胞，从而节约了组织标本的来源。
[0046]
3.使用本发明的方法，嗅前体细胞培养基对细胞扩增率、生物活性、纯度等均有提高。
[0047]
4.使用0.05％胰蛋白酶，0.2mmol/l edta的酶解传代消化，降低对细胞的损伤程度。
[0048]
5.根据本发明的方法得到的嗅前体细胞具有很强的靶向性、再生能力。并且原代培养获得的嗅前体细胞均可按1分3传11代以上，且纯度较高。可以进行异体移植。降低制备成本，增加应用研究的安全性和有效性。从而拥有广泛的应用前景。
[0049]
基于以上，本发明的嗅前体细胞制备方法效果优良，可获得大量的嗅前体细胞，而且简单易行，成本低，安全性好，在国内外具有良好的应用前景。
附图说明
[0050]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0051]
图1为根据本发明的方法制备的嗅前体细胞的形态。
具体实施方式
[0052]
以下结合实施例对本发明做具体说明，但本发明并不限于下述实施例，在本领域内人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出培养基、冻存保护液、原代培养时间、传代时间、多批次获得等多种变化。
[0053]
实施例1根据本发明的方法制备嗅前体细胞
[0054]
其中，用含90ml的dmem/df12(11320gibco)、80mg egf(pepro tech))、60mg fgf(pepro tech)、2ml 1％的n2细胞培养添加剂(gibco17502-048)、3ml 2％的b27细胞培养添加剂(gibco 17504-044)、150mg bsa(sigma)、0.2mmol/ml谷氨酰胺(gibco)和2ml neaa细胞培养添加剂(100x，11140050)配置成嗅前体细胞培养基；然后用血清原液(gibco16000044)提前24小时包被培养瓶。
[0055]
具体地，所述方法包括以下步骤：
[0056]
(1)鼻嗅粘膜获取：使用标本组织咬钳取供者上鼻甲和中鼻甲之间处的嗅粘膜组织块，并将取得的嗅粘膜组织块放入冰盒上的玻璃皿中，即刻送培养室进行无菌处理；
[0057]
(2)在36℃下，用1倍体积的5％(g/100ml)胰蛋白酶、1倍体积的浓度为0.2mmol/l的edta水溶液预处理得到的嗅粘膜组织块15分钟；
[0058]
(3)在解剖显微镜下，去除嗅粘膜组织块的表膜和底膜松动层，用pbs冲洗3次，剪成1mm
3
的小块；。
[0059]
将小块置于加有160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基中，反复冲洗3次，用眼科组织镊撕成0.4mm
3
左右，收集组织块置于10ml离心管内，高速离心，离心机转速为1100转/分钟，离心20分钟，弃掉上清，重新加入含160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，再高速离心，离心机转速为1100转/分钟，离心20分钟。
[0060]
(4)将组织块加入适量培养基混匀，接种至事先包被的培养瓶中使其贴壁，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养3天。该步骤用以最大量的去除成纤维细胞和造血细胞。
[0061]
(5)培养3天后，轻轻摇晃培养瓶收集组织块并加入适量嗅前体细胞培养基，接种至事先包被的培养瓶中，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养；
[0062]
将获得的单个细胞继续培养，每3天，半量换嗅前体细胞培养基。3天在显微镜下可见双极和三极样多级样细胞生长；
[0063]
待单个细胞生长融合率在60％左右时。轻轻摇晃收集组织块，接种至事先包被的培养瓶中，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养。原细胞培养瓶中贴壁的单个细胞继续加嗅前体细胞培养基继续培养。
[0064]
(6)待单个细胞生长融合率在75％-90％左右时。先用dmem/f12溶液反复轻轻冲洗培养瓶2次，用含0.05％胰蛋白酶/0.2mmol/l edta水溶液使贴壁的单个细胞脱落，1100转/分钟，离心20分钟，收集单个细胞。加入嗅前体细胞培养基制成细胞悬液，根据细胞数量分为3份，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％co
2
培养箱中培养；
[0065]
其中，在步骤(5)和(6)中，根据培养情况观察，添加适量的p63、p53抑制剂或p63、p53激动剂。细胞生长缓慢时，适量加入p63、p53激动剂。待细胞生长过快时，适量加入p63、p53抑制剂。确保单个细胞2-3天可进行传代一次。确保组织块3-5天可以分离出原代细胞
[0066]
重复步骤(5)和(6)。待组织块生长重复使用5-7次时，即可弃去组织块。可获得5-7批原代嗅前体细胞，每批嗅前体细胞经反复1分3传代培养，细胞扩增10～11代，可获得大量高纯度嗅前体细胞。
[0067]
实施例2根据本发明的方法制备嗅前体细胞
[0068]
其中，用含90ml的dmem/df12(11320gibco)、80mg egf(pepro tech)、60mg fgf(pepro tech)、2ml 1％的n2细胞培养添加剂(gibco)、3ml 2％的b27细胞培养添加剂(gibco)、150mg bsa(sigma)、0.2mmol/ml谷氨酰胺(gibco)、2ml非必需氨基酸(11140050gibco)配置成嗅前体细胞培养基；然后用血清(gibco 16000044)提前24小时包被培养瓶；
[0069]
具体地，所述方法包括以下步骤：
[0070]
(1)鼻嗅粘膜获取：使用标本组织咬钳取供者上鼻甲和中鼻甲之间处的嗅粘膜组织块，并将取得的嗅粘膜组织块放入冰盒上的玻璃皿中，即刻送培养室进行无菌处理；
[0071]
(2)在38℃下，用1倍体积的5％(g/100ml)胰蛋白酶、1倍体积的浓度为0.2mmol/l的edta处理得到的嗅粘膜组织块15分钟；
[0072]
(3)在解剖显微镜下，去除嗅粘膜组织块的表膜和底膜松动层，用pbs冲洗3次，剪成1mm
3
的小块；
[0073]
将小块置于加有160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基中，反复冲洗3次，用眼科组织镊撕成0.4mm
3
左右，收集组织块置于10ml离心管内，高速离心，离心机转速为2100转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含160u/ml的庆大霉素的嗅前体细胞培养基，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，再高速离心，离心机转速为2100转/分钟，离心30分钟。
[0074]
(4)将组织块加入适量培养基混匀，接种至事先包被的培养瓶中使其贴壁，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养3天。该步骤用以最大量的去除成纤维细胞和造血细胞。
[0075]
(5)培养3天后，轻轻摇晃培养瓶收集组织块并加入适量嗅前体细胞培养基，接种至事先包被的培养瓶中，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养；
[0076]
将获得的单个细胞继续培养，每3天，半量换嗅前体细胞培养基。5天在显微镜下可见双极和三极样多级样细胞生长；
[0077]
待单个细胞生长融合率在85％左右时。轻轻摇晃收集组织块，接种至事先包被的培养瓶中，各组织块相互距离为4mm-6mm左右为宜，在避光37℃、5％co
2
培养箱中培养。原细胞培养瓶中贴壁的单个细胞继续加嗅前体细胞培养基继续培养。
[0078]
(6)待单个细胞生长融合率在75％-90％左右时。先用dmem/f12溶液反复轻轻冲洗培养瓶2次，用含0.05％胰蛋白酶/0.2mmol/l edta水溶液使贴壁的单个细胞脱落，2100转/分钟，离心5分钟，收集单个细胞。加入嗅前体细胞培养基制成细胞悬液，根据细胞数量分为3份，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％co
2
培养箱中培养；
[0079]
其中，在步骤(5)和(6)中，根据培养情况观察，添加适量的p63、p53抑制剂或p63、p53激动剂。细胞生长缓慢时，适量加入p63、p53激动剂。待细胞生长过快时，适量加入p63、p53抑制剂。确保单个细胞2-3天可进行传代一次。确保组织块3-5天可以分离出原代细胞
[0080]
重复步骤(5)和(6)。待组织块生长重复使用5-7次时，即可弃去组织块。可获得5-7批原代嗅前体细胞，每批嗅前体细胞经反复1分3传代培养，细胞扩增10～11代，可获得大量高纯度嗅前体细胞。
[0081]
实施例3根据本发明的方法得到的嗅前体细胞的鉴定
[0082]
将培养获得的单个细胞用常规免疫组织化学染色鉴定，结果如图1所示，其中嗅前
体细胞学鉴定(采用nestin、gfap和tuj-1或omp细胞化学染色)显示，大部分细胞呈nestin阳性，其中部分gfap同时阳性，部分同时tuj-1阳性，没有不与其它标记共染阳性而仅nestin阳性的细胞，符合嗅前体细胞特性。
[0083]
实施例4将根据本发明的方法得到的嗅前体细胞制备为嗅鞘细胞或嗅神经元细胞
[0084]
将培养获得的单个细胞，使用中国发明专利201510935540.3或201510516055.2记载的技术定向分化成嗅鞘细胞或嗅神经元细胞。根据《国际神经修复学会的临床应用指南》，进行临床细胞治疗使用。
[0085]
实施例5本申请制备的细胞的应用
[0086]
病例1：美国籍男性，完全性胸六脊髓损伤九年余，一直在当地坚持做正规康复训练，神经功能无任何恢复。2005年接受我们的嗅鞘细胞治疗，治疗两周后坚持，感觉平面下降，胯膝关节屈伸肌力部分恢复。回美国后神经功能继续改善和恢复，大小便控制部分恢复。治疗前asia评分运动50分，针刺觉52分，轻触觉52分，治疗半年后随访asia评分运动56分，针刺觉60分，轻触觉60分。国际神经修复学会脊髓损伤功能指数治疗前为21分，治疗半年后随访为29分。美国fox电视台采访报道，“完全性晚期脊髓损伤重新站起来和走路”。
[0087]
病例2：美国籍男性，确诊为运动神经元病(肌萎缩侧索硬化症)后，病情逐渐恶化，走路蹒跚，双上肢及手力弱，持物上举困难，被判定大约只有两年的寿命。2005年接受我们的嗅鞘细胞治疗后，上下肢及手力量增加，走路恢复正常。回美国后恢复打高尔夫球(嗅鞘细胞治疗前半年已丧失打高尔夫球能力)，治疗改善和功能维持一年半，直至再次打高尔夫球困难时，又再次来接受嗅鞘细胞治疗。随后每一年半至两年来接受一次嗅鞘细胞治疗，持续随访至2016年仍健在。
[0088]
病例3意大利女性，左侧脑卒中后遗症三年，右足踝关节需打支具才能站立，走路呈跛行步态，2006年接受我们的嗅鞘细胞治疗，随后神经功能逐渐改善。两年后随访，走路已不需要支具，步态恢复正常。barthel index治疗前85分，两年后随访为100分。
[0089]
以上是结合实施例对本发明做出的具体说明，但本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，或直接或间接将本发明运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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