一种萝卜功能基因组研究及基因功能验证的方法与流程

[0001]
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种萝卜功能基因组研究及基因功能验证的方法。


背景技术：

[0002]
自上世纪以来，国内外学者针对萝卜尝试建立再生体系和遗传转化方法，但是效率非常低，获得的转基因植株十分有限，转基因成功的案例寥寥无几，并且难于重复。目前还没有成熟的萝卜遗传转化体系。无法在萝卜中超表达、敲除或编辑萝卜基因，导致萝卜的功能基因组研究和基因的功能鉴定滞后。因此，建立一种萝卜功能基因组研究及基因功能验证的方法有重要意义。
[0003]
萝卜是一个典型的再生顽拗型植物，遗传转化十分困难。植物遗传转化的难易受遗传控制。为攻克萝卜遗传转化难题，前期研究大多集中在两个方向：1调整培养基配方、激素配比等遗传转化方法的研究。2筛选萝卜种质资源，寻找容易再生和易于转化的萝卜品种。虽然投入了大量人力、物力和时间，这两个方向均未能取得最终成功。可能的原因是萝卜基因组中决定体细胞胚发生的关键基因不表达或者不能响应外源激素的诱导。而甘蓝中拥有高效再生和易于遗传转化的品种。表明甘蓝基因组中决定体细胞胚发生的关键基因高表达并能有效响应外源激素的诱导。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题为：如何建立一种萝卜功能基因组研究及基因功能验证的方法。
[0005]
本发明的技术方案为：一种萝卜功能基因组研究及基因功能验证的方法，该方法以萝卜(raphanus sativus)与甘蓝(brassica oleracea)远缘杂种加倍后稳定遗传的异源四倍体(rrcc基因组)为受体材料，通过引入一套甘蓝基因组使合成植物易于遗传转化。通过遗传转化，超表达、敲除或编辑萝卜的目标基因以研究其功能，在全基因组范围内敲除萝卜基因来进行功能基因组研究。
[0006]
进一步地，所述萝卜包括rr基因组的所有亚种、变种，所述甘蓝包括cc基因组的所有亚种、变种，所述异源四倍体是指含有rrcc基因组的植株。
[0007]
进一步地，所述萝卜与甘蓝远缘杂种的遗传转化是农杆菌介导的遗传转化。
[0008]
遗传转化方法为：
[0009]
无菌苗制备：选取饱满的种子，清洗、消毒后均匀播种于播种培养基上，所述播种培养基组成为：1/2ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌；
[0010]
预培养：选取苗龄6-10d的幼苗，当外植体用下胚轴时，切取下胚轴，在预培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；当外植体用子叶盘时，切下子叶后直接平放于预培养培养基上，用封口膜将培养皿封好，预培养2-4d；所述预培养基组成为：ms+蔗糖
30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加agno
3
至5mg/l；
[0011]
摇菌：配置lb，其中加入筛选抗生素(根据载体上的抗性基因选择，包括但不限于卡那霉素)和利福平，从平板上挑取含有载体(目的基因超表达或敲除或编辑的载体)的农杆菌或直接加入新鲜菌液，震荡过夜，震荡条件28℃，250r/min；
[0012]
农杆菌悬浮液配置：摇菌至od600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，离心，弃上清后加入dm悬浮液，重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中震荡培养30min-1h，震荡条件250r/min，28℃，之后，取出菌液，以加入乙酰丁香酮(as)的dm悬浮液为背景，稀释菌液至od600＝0.5-0.6；所述dm悬浮液的制备方法为：ms+蔗糖30g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮(as)至100μmol/l；
[0013]
共培养：将预培养2-4d的外植体置于od600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染，期间不断摇晃，之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干，在共培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上，将培养皿封好后，共培养2-4d，所述共培养培养基组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+2,4-d 1mg/l+kt 0.3mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加as至100μmol/l；
[0014]
延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基上，培养2-4d，所述延迟培养基组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l,调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
和timentin分别至5mg/l和200mg/l；
[0015]
筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基上，光照强度为2000-4000lx，培养2-3周后开始出现芽分化。每培养约2-3周转到新的培养基中，所述筛选培养基组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和10mg/l；
[0016]
生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基组成为：ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+naa 0.1mg/l,调节ph为5.8，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和5mg/l；
[0017]
炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养，光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度，3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中。
[0018]
进一步地，遗传转化具体为：
[0019]
无菌苗制备：选取饱满的种子，无菌水清洗3次，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，84消毒液(有效含氯量34.0-46.0g/l)稀释一倍后消毒10min，无菌水清洗3-4次，均匀播种于播种培养基上(1/2ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌)，每个培养基上约30粒种子。
[0020]
预培养：外植体用下胚轴或子叶盘。选取苗龄6-10d的幼苗，用锋利的手术刀片切取下胚轴，长度为0.5cm，在预培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加agno
3
至5mg/l)上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；切下子叶后直接平放于预培养培养基上。用封口膜将培养皿封好，预培养2-4d。
[0021]
摇菌：配置50ml lb，其中加入筛选抗生素(根据载体上的抗性基因选择，包括但不限于卡那霉素)和利福平分别至50mg/l，用无菌牙签从平板上挑取含有载体(目的基因超表达或敲除或编辑的载体)的农杆菌菌落或直接加入新鲜菌液1ml，震荡过夜，震荡条件28℃，250r/min
[0022]
农杆菌悬浮液配置：摇菌至od600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，转速4000r/min，离心15min。弃上清后加入dm悬浮液(ms+蔗糖30g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮(as)至100μmol/l(注：用前再加防止as失效)。重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中30min-1h，震荡条件250r/min，28℃。之后，取出菌液，以加入as的dm悬浮液为背景，稀释菌液至od600＝0.5-0.6。
[0023]
共培养：将预培养2-4d的外植体置于od600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染10min，期间不断摇晃。之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干。在共培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+2,4-d 1mg/l+kt 0.3mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加as至100μmol/l)上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上。将培养皿封好后，共培养2-4d。
[0024]
延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l,调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
和timentin分别至5mg/l和200mg/l)上，培养2-4d。
[0025]
筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和10mg/l)上，光照强度为2000-4000lx，培养2-3周后开始出现芽分化。每培养约2-3周转到新的培养基中，避免培养基中营养物质减少或抗生素失效对外植体生长产生影响。
[0026]
生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+naa 0.1mg/l,调节ph为5.8，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和5mg/l)中进行生根培养。
[0027]
炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养。光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度。3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中。
[0028]
进一步地，所述表达或敲除的萝卜目标基因是指萝卜基因组中的编码基因以及非编码基因。
[0029]
进一步地，所述敲除或编辑萝卜目标基因的方法是利用crispr-cas9。
[0030]
进一步地，超标达萝卜基因的转基因苗t
0
代进行pcr鉴定，阳性植株自交，获得t
1
代植株。q-pcr鉴定目标基因表达量。
[0031]
进一步地，基因敲除植株利用pcr扩增目的基因靶位点所在的dna片段，测序验证突变。
[0032]
进一步地，超表达或基因敲除植株进行表型观察，与野生型植株对比，研究萝卜基因功能。
[0033]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0034]
本发明通过合成萝卜与甘蓝的属间杂种，该杂种中同时含有萝卜和甘蓝两套基因
组。利用甘蓝基因组中的调控体细胞胚发生的关键基因驱动杂种植物的再生和遗传转化。通过转基因超表达或敲除杂种中萝卜基因组中的基因，以研究萝卜基因功能。本发明首次使超表达、敲除和编辑萝卜基因和基因组成为可能。由于本体系遗传转化效率很高，利用该系统大批量敲除萝卜基因，可以进行萝卜功能基因组研究。
附图说明
[0035]
图1为萝卜与甘蓝远缘杂种(rrcc)下胚轴再生芽；
[0036]
图2为萝卜与甘蓝远缘杂种(rrcc)子叶盘再生芽；
[0037]
图3为生根中的遗传转化再生芽；
[0038]
图4为遗传转化再生芽生出的根；
[0039]
图5为再生苗pcr产物电泳图。从左至右分别是50bp dna ladder，空白对照，菌落pcr产物以及再生苗pcr产物(l1-l12)；
[0040]
图6为再生苗pcr产物电泳图。从左至右分别是50bp dna ladder，空白对照，菌落pcr产物以及再生苗pcr产物(l1-l6)；
[0041]
图7为转基因植株l1 pcr产物测序峰图；
[0042]
图8为转基因植株l1 pcr产物序列与其他植株序列对比图；
[0043]
图9为转基因植株l4 pcr产物测序峰图；
[0044]
图10为转基因植株l4 pcr产物序列与其他植株序列对比图；
[0045]
图11为转基因植株l11 pcr产物测序峰图；
[0046]
图12为转基因植株l11 pcr产物序列与其他植株序列对比图。
具体实施方式
[0047]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0048]
1、萝卜与甘蓝远缘杂种的创制
[0049]
以萝卜(raphanus sativus)为母本，甘蓝(brassica oleracea)为父本，授粉杂交后通过胚挽救，并在培养基中加入秋水仙素促进染色体加倍，人工合成了萝卜和甘蓝的远缘杂交种(rrcc基因组)。
[0050]
2、萝卜基因表达或编辑载体构建
[0051]
克隆萝卜目标基因装载到植物表达载体上，或根据目标基因序列设计grna，构建crispr-cas9基因编辑载体。转入农杆菌。
[0052]
3、遗传转化
[0053]
播种：选取饱满的种子，无菌水清洗3次，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，84消毒液(有效含氯量34.0-46.0g/l)稀释一倍后消毒10min，无菌水清洗3-4次，均匀播种于播种培养基上(1/2ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌)，每瓶培养基上约30粒种子。
[0054]
预培养：外植体用下胚轴或子叶盘。选取苗龄6-10d的幼苗，用锋利的手术刀片切取下胚轴，长度为0.5cm，在预培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l+6-ba 2mg/l+naa0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加agno
3
至5mg/l，倒入无菌培养皿中凝固
备用)上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；切下子叶后直接平放于预培养培养基上。用封口膜将培养皿封好，预培养2-4d。
[0055]
转化方法为农杆菌介导的转化方法
[0056]
摇菌：
[0057]
配置50ml lb，其中加入卡那霉素(kan)和利福平(rif)均至50mg/l，用无菌牙签从平板上挑取含有载体(目的基因超表达或敲除或编辑的载体)的农杆菌或直接加入新鲜菌液1ml，震荡过夜，震荡条件28℃，250r/min
[0058]
农杆菌悬浮液配置：摇菌至od600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，转速4000r/min，离心15min。弃上清后加入dm悬浮液(ms+蔗糖30g/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮as至100μmol/l。注：用前再加防止as失效)。重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中震荡培养30min-1h，震荡条件250r/min，28℃。之后，取出菌液，以加入as的dm悬浮液为背景，稀释菌液至od600＝0.5-0.6。
[0059]
共培养：将预培养2-4d的外植体置于od600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染10min，期间不断摇晃。之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干。在共培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l+2,4-d 1mg/l+kt 0.3mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加as至100μmol/l，倒入无菌培养皿中凝固备用)上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上。将培养皿封好后，共培养2-4d。
[0060]
延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基(ms+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l,调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
和timentin分别至5mg/l和200mg/l，倒入无菌培养皿中凝固备用)上，培养2-4d。
[0061]
筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+6-ba 2mg/l+naa 0.1mg/l，调节ph至5.8
±
0.1，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和10mg/l，倒入无菌培养皿中凝固备用)上，光照强度为2000-4000lx，培养2-3周后开始出现芽分化。每培养约2-3周转到新的培养基中，避免培养基中营养物质减少或抗生素失效对外植体生长产生影响。
[0062]
生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基(ms+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l或植物凝胶2.5g/l+naa 0.1mg/l,调节ph为5.8，高压蒸汽灭菌后加入agno
3
、timentin和潮霉素，终浓度分别为5mg/l、200mg/l和5mg/l，倒入无菌三角瓶中凝固备用)中进行生根培养。
[0063]
炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养。光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度。3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中。
[0064]
4、转基因苗t
0
代进行pcr鉴定，阳性植株自交。基因敲除植株利用pcr扩增目的基因靶位点所在的dna片段，测序验证突变。
[0065]
5、超表达或基因敲除植株进行表型观察，与野生型植株对比，研究该萝卜基因功能。
[0066]
6、以目标基因clv举例。clv可促进子房发育，具有提高作物种子产量的潜力。
[0067]
具体方法：在ncbi中找到拟南芥clv2基因的核酸序列，与rrcc全基因组序列进行对比查找到rrcc中对应的同源基因。针对来自萝卜染色体的clv2同源基因设计grna，装载
到预装有cas9基因的植物表达载体上，转化农杆菌。以农杆菌为介导对萝卜与甘蓝远缘杂种进行遗传转化，对再生芽进行生根培养获得转化苗(见附图1-4)(具体过程同上述条3提到的遗传转化步骤)。对转化苗进行pcr检测确定阳性苗(见附图5和6)，对获得的阳性植株的clv2基因目的片段pcr扩增并测序，在其中l1、l4和l11植株中发现套峰(见附图7，9，11)。将pcr产物克隆到t1载体，测序鉴定其突变类型，l1号植株在靶位点出现1个腺嘌呤插入(见附图8)，l4号植株在靶位点出现13bp的缺失(见附图10)，l11号植株在靶位点出现12bp的缺失和1个胞嘧啶插入(见附图12)。以上突变均靠近pam位点，造成clv2基因译码框突变，翻译提前终止。发现突变体植株雌蕊发育受到影响，有心皮膨大及开裂的现象，表明萝卜clv2基因调控雌蕊和心皮的发育。

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