一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒。


背景技术：

[0002]
甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤。据中国肿瘤登记中心的数据显示，我国城市地区女性甲状腺癌发病率居女性所有恶性肿瘤的第4位。甲状腺癌分为分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer，dtc）、髓样甲状腺癌（medullary thyroid cancer，mtc）和未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，atc）。各种类型的甲状腺癌恶性程度不同，治疗方式和预后也大相径庭。
[0003]
靶向治疗是放射性碘抵抗或手术不能切除的甲状腺癌患者的重要治疗方式。索拉非尼（sorafenib）是一种同时靶向vegfrs、ret/ptc及braf基因的小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, tki）。2013 年，美国食品药物管理局（food and drug administration, fda）批准索拉非尼用于治疗局部复发或转移、放射性碘抵抗的进展期 dtc。凡德他尼（vandetanib）是口服的小分子tki，可同时作用于vegfr-1、vegfr-2 和 ret 基因等多靶点，2011年成为首个被fda批准的治疗症状性或进展性mtc靶向药物。卡博替尼（cabozantinib）是另一种口服小分子多靶点治疗药物，可同时作用 vegfr-1、vegfr-2、met和ret基因，2012年被fda批准为第二种治疗进展期转移性mtc的靶向药物，对于治疗进展期、不能切除或转移性mtc具有很大的帮助。2018年，针对ntrk1-3基因融合的靶向药物拉罗替尼（loxo-101）被批准上市，拉罗替尼是 fda 批准的首个针对特定基因变异、跨越肿瘤部位的广谱抗癌药。另外，针对ret基因融合和突变的靶向药物塞尔帕替尼（loxo-292）被fda批准用于进展期及远端转移的且携带ret基因融合或突变的甲状腺癌。多个甲状腺癌诊疗指南和专家共识均指出：靶向治疗是难治性或晚期甲状腺癌的重要治疗方式，能减轻患者的症状并延长生存期，推荐进行基因检测筛选靶点，指导靶向药物的选择。
[0004]
因此，我们发明了一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒，通过对一组甲状腺癌靶向用药相关的基因变异进行检测，其检测结果可以用来协助医生为甲状腺癌患者选择适合的靶向药物进行治疗，可以提高甲状腺癌靶向药物选择的准确性，从而减轻患者的症状并延长生存期，无疑具有非常重要的临床使用价值。


技术实现要素：

[0005]
本发明的主要目的在于提供一种准确度高的用于检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物及试剂盒，为甲状腺癌靶向药物的选择提供良好的辅助作用。
[0006]
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物，包括如下扩增引物对：核苷酸序列如seq id no.1-4所示的braf基因的扩增引物对，核苷酸序列如seq id no.5-10所示的ret基因的扩增引物对，核苷酸序列如seq id no.11-14所示的kras基因的扩增引物对，核苷酸序列如seq id no.15-18所示的hras基因的扩增引物对，核苷酸序列如
seq id no.19-22所示的nras基因的扩增引物对，核苷酸序列如seq id no.23-24所示的flt3基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.25-26所示的kit基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.27-28所示的tet2基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.29-30所示的pdgfr-α基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.31-32所示的lrp1b基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.33-34所示的pik3ca基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.35-36所示的pten基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.37-42所示的map2k1基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.43-48所示的map2k2基因的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.49-50所示的ncoa4/ret融合的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.51-52所示的ccdc6/ret融合的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.53-56所示的ntrk1/tpm3融合的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.57-58所示的nacc2/ntrk2融合的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.59-60所示的qki/ntrk2融合的扩增引物对,核苷酸序列如seq id no.61-64所示的etv6/ntrk3融合的扩增引物对。
[0007]
所述14个基因32个dna突变位点分别如表1所示：表1 基因突变位点所述6种基因融合类型分别如表2所示：表2 基因融合类型
表3 引物序列表
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒，包括上述所有用于检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物。
[0008]
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒，包括逆转录试剂、建库试剂、阳性dna质控品、阳性rna融合质控品、阴性rna融合质控品、无核酸酶水。
[0009]
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒，所述逆转录试剂，含有rna逆转录酶、5
×
缓冲液、0.1m dtt、dntps、rna酶抑制剂、随机引物，可以选择市售superscript iii reverse transcriptase（thermo fisher）和rnaseout
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recombinant ribonuclease inhibitor（thermo fisher）。
[0010]
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒，所述建库试剂含有dna聚合酶、kcl、mgcl2、tris-hcl、dntps、通用引物、接头，可以选择市售二代测序快速dna建库试剂盒（illumina）。
[0011]
所述阳性dna质控品为正常人基因组dna。
[0012]
所述阳性rna融合质控品为人ret/ccdc6融合rna。
[0013]
所述阴性rna融合质控品为人非融合rna。
[0014]
优选的，所述试剂盒的存储温度为-20℃。
[0015]
进一步的，所用的样本为检测对象的甲状腺癌实体组织。
[0016]
优选地，所用的样本可以是新鲜的手术组织和/或穿刺组织、冷冻的手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋（ffpe）的组织样本中的一种或多种。更优选地，检测样本为新鲜手术组织和/或穿刺组织。
[0017]
进一步的，一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的检测方法，包括如下步骤：(1) 从待测样本中提取dna，对提取的dna进行浓度和纯度检测；(2) 以步骤（1）提取的dna为模板，用seq id no. 1～48所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮pcr扩增，纯化扩增产物；(3) 以步骤（2）所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮pcr扩增，纯化扩增产物，得到dna测序文库；(4) 从待测样本中提取纯化rna，对提取的rna进行浓度和纯度检测；(5) 以步骤（4）提取的rna为模板，通过逆转录生成相应的cdna，纯化cdna；(6) 以步骤（5）所述cdna为模板，用seq id no. 49～64所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮pcr扩增，纯化扩增产物；(7) 以步骤（6）所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮pcr扩增，纯化扩增产物，得到cdna测序文库；(8) 对步骤（3）和步骤（7）所述测序文库进行质检，然后用二代测序仪进行测序；(9) 对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。
[0018]
优选的，所述核苷酸序列seq id no.1～48所示的dna特异性引物混合池浓度为2μm。
[0019]
所述核苷酸序列seq id no.49～64所示的rna特异性引物混合池浓度为6μm。
[0020]
所述扩增产物纯化使用的磁珠为beckman agencourt ampure xp磁珠。
[0021]
本发明具有以下有益效果：（1） 本发明可以同时检测braf基因、ret基因、kras基因、hras基因、nras基因、flt3基因、kit基因、tet2基因、pdgfr-α基因、lrp1b基因、pik3ca基因、pten基因、map2k1基因、map2k2基因这14个基因上的32个突变位点和ncoa4/ret融合、ccdc6/ret融合、ntrk1/tpm3融合、nacc2/ntrk2融合、qki/ntrk2融合、etv6/ntrk3融合这6个融合变异，这些基因突变及融合变异都与甲状腺癌靶向药物选择有关，因此其检测结果可以用来协助医生为甲状腺癌患者选择适合的靶向药物，提高甲状腺癌治疗效果。
[0022]
（2） 本发明基于高通量测序技术，其引物组合、试剂盒及检测方法具有检测灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。
附图说明
[0023]
图1为本试剂盒文库构建的原理图。
[0024]
图2为本试剂盒的检测流程图。
[0025]
图3为使用本试剂盒构建的dna文库片段分布图。
[0026]
图4为使用本试剂盒构建的cdna文库片段分布图。
[0027]
图5为10个不同的临床样本构建文库的braf基因t1799a位点测序深度图。
[0028]
图6为同一实验人员对同一临床样本构建5次文库的braf基因t1799a位点测序深度。
[0029]
图7为不同实验人员对同一临床样本构建5次文库的braf基因t1799a位点测序深度。
具体实施方式
[0030]
为了更加透彻和全面地理解本发明所公开的内容，下面将参照附图对本发明进行详细的描述，但是本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，通常属于本发明的技术领域的普通技术人员都能够理解这些描述，并可能在不脱离本发明方法的前提下，做出若干非意想不到的改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
[0031]
实施例1 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的引物。
[0032]
本实施例涉及的甲状腺癌靶向用药相关基因及位点选自《nccn肿瘤学临床实践指南-甲状腺癌》、《甲状腺癌诊疗规范》等国内国外甲状腺癌指南/规范/专家共识，以及cosmic(catalogue of somatic mutations in cancer)数据库，依据相关基因序列进行靶向药物相关突变位点引物设计，设计范围包含了甲状腺癌靶向用药相关基因中的药物选择相关突变。
[0033]
如表3所示，本实施例中对甲状腺癌靶向用药相关基因的药物选择相关突变共设计了32对特异性扩增引物，每对引物扩增目标区域大小为180-200bp,具有覆盖范围广、检测位点多、gc含量均衡、产物结构稳定、二聚体结构少等优点。
[0034]
本实施例的特异性引物在多重pcr扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，在确保pcr扩增特异性的同时能保证其扩增效率。
[0035]
实施例2 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒。
[0036]
本实施例中所述用于检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的试剂盒，主要包括：（1）扩增引物：用于扩增待测样本目标基因上的多个目标区域及基因融合。扩增待测样本目标基因上的多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的热点突变区域，引物序列如表3中seq id no.1-48所示；扩增待测样本基因融合，引物序列如表3中seq id no.49-64所示；（2）逆转录试剂：rna逆转录酶、5
×
缓冲液、0.1m dtt、dntps、rna酶抑制剂，随机引物；（3）建库试剂：dna聚合酶、kcl、mgcl2、tris-hcl、dntps、通用引物、接头；（4）阳性dna质控品：正常人基因组dna；（5）阳性rna融合质控品：人ret/ccdc6融合rna；（6）阴性rna融合质控品：人非融合rna。
[0037]
优选的，所述试剂盒的存储温度为-20℃。
[0038]
实施例3 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异的检测方法。
[0039]
本实施例的检测方法包括以下步骤：
（1） 样本dna和rna提取：参照说明书，使用allprep dna/rna mini kit 试剂盒分别提取dna和rna，使用nanodrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用无核酸酶水将核酸样本稀释至10-50ng/μl作为扩增建库的核酸起始浓度。
[0040]
（2） dna文库构建：（2a） dna靶区域扩增：按照下列反应体系和扩增条件进行第一轮pcr扩增：试剂体积dna聚合酶混合液12.5μl扩增引物混合池4μldna(50-100ng)2μl无核酸酶水补足至25μldna多重pcr扩增程序设置：（2b）第一轮pcr产物纯化：使用ampure xp beads纯化试剂盒对第一轮pcr产物进行纯化：1) 将25ul扩增产物转移至一个新的1.5ml离心管中，然后加入22.5μl ampure xp beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；2) 将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，将50ul上清吸出丢弃，用10ul枪头吸出管底残留，保留磁珠，取下离心管，加入50ul yf buffer b，用枪吹打混匀，室温孵育5min；3) 将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；4) 在上述离心管中加入180μl 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；5) 重复上述步骤一次；6) 室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；7) 向离心管中加入24μl无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；
8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取13.5μl上清到新的0.2ml pcr管中，进行第二轮pcr扩增。
[0041]
（2c） dna第二轮pcr扩增：按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮pcr扩增：试剂体积dna聚合酶混合液14.5μl通用引物1μl接头1μl第一轮pcr纯化产物13.5μl无核酸酶水补足至30μl不同的样本文库需使用不同的接头编号引物。
[0042]
dna多重pcr扩增程序设置：（2d）dna第二轮pcr产物回收使用ampure xp breads纯化试剂盒对第二轮pcr产物进行纯化：1) 将以上30μl pcr扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5ml离心管中，然后加入27μl ampure xp beads，使用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；2) 将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，将50ul上清吸出丢弃，用10ul枪头吸出管底残留，保留磁珠，取下离心管，加入50ul yf buffer b，用枪吹打混匀，室温孵育5min；3) 将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；4) 在上述离心管中加入180μl 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；5) 重复上述步骤一次；6) 室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；
7) 向离心管中加入24μl无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取20μl上清到新的1.5ml 离心管中，该纯化产物即为构建好的文库，质检（图3）通过后上机测序。
[0043]
（3） cdna文库构建：（3a）逆转录制备cdna：按照下面反应体系和扩增条件进行rna逆转录：试剂体积随机引物2μltotalrna2μldntps4μl无核酸酶水5μl5
×
缓冲液4μl0.1mdtt1μlrna酶抑制剂1μlrna逆转录酶1μl扩增程序设置：温度时间循环数25
˚
c5min150
˚
c60min170
˚
c15min1将获得的cdna作为扩增反应模板备用。
[0044]
（3b）cdna靶区域扩增：按照下列反应体系和扩增条件进行pcr扩增：试剂体积dna聚合酶混合液12.5μl扩增引物池2μlcdna模板2μl无核酸酶水补足25μl多重pcr扩增程序设置：
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(3c) cdna第一轮pcr产物纯化：使用ampure xp beads纯化试剂盒对cdna第一轮pcr扩增产物进行纯化：1) 将以上25μl pcr扩增产物补水至50μl，涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5ml离心管中，然后加入30μl ampure xp beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；2) 将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，将管内上清液全部吸出至新管中，加入35ul磁珠，用枪吹打混匀，室温孵育5min；3) 将上述离心管放置在磁力架上，开盖，室温静止5min后，将上清吸出丢弃，保留磁珠；4) 在上述离心管中加入200μl 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；5) 重复上述步骤一次；6) 室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；7) 向离心管中加入20μl无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取17μl上清到新的0.2ml pcr管中，进行第二轮pcr扩增。
[0045]
（3d）cdna第二轮pcr扩增：按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮pcr扩增：试剂体积dna聚合酶混合液25μl通用引物1μl接头1μl第一轮pcr纯化产物17μl无核酸酶水补足至50μl不同的样本文库需使用不同的接头编号引物。
[0046]
cdna多重pcr扩增程序设置：（3e） cdna第二轮pcr产物回收使用ampure xp breads纯化试剂盒对第二轮pcr产物进行纯化：1) 将以上50μl扩增产物涡旋混匀离心，将上清转移至一个新的1.5ml离心管中，然后加入27.5μl ampure xp beads，使用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；2)将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，将管内上清液全部吸出至新管中，加入15ul磁珠，用枪吹打混匀，室温孵育5min；3)将上述离心管放置在磁力架上，开盖，室温静止5min后，将上清吸出丢弃，保留磁珠；4)在上述离心管中加入200μl 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；5) 重复上述步骤一次；6) 室温静置10分钟，使乙醇完全挥发；7) 向离心管中加入20μl无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取18μl上清到新
的1.5ml 离心管中，该纯化产物即为构建好的文库，质检（图4）通过后上机测序。
[0047]
（4） 上机测序：将构建好的文库，准确定量并稀释到合适浓度，参照illumina公司的官方操作说明书进行上机测序。
[0048]
（5） 生信分析：对测序结果利用生物信息软件进行分析和注释。
[0049]
实施例4 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异试剂盒的测序深度性能验证。
[0050]
利用本发明所述的试剂盒，对10例甲状腺癌样本进行检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。10例样本检测的结果表明，对于不同样本，本发明所述试剂盒检测深度均表现良好，例如，其中braf基因t1799a位点，在10例样本中的检测深度分别为：3935.15、3179.52、4102.31、4851.93、3910.39、5010.91、4651.79、5710.71、3726.91、4910.81（图5），最低测序深度3179.52，最高测序深度5710.71，均达到试剂盒设定的最低测序深大于1000的性能指标，确保了测序结果的准确性。
[0051]
实施例5 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异试剂盒的重复性实验。
[0052]
利用本发明所述的试剂盒，对同1例甲状腺癌样本，由实验室同一技术人员分别进行5次检测，检测方法按照实施例3的步骤进行，5次检测中，以braf基因t1799a位点的测序深度为例，其测序深度分别为3821.31、3590.97、3901.21、3619.96、3489.13（图6），braf基因t1799a位点突变可以被稳定的检出，检出的突变频率分别为30.12%、31.96%、29.61%、31.87%、30.91%，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，本发明所述试剂盒具有良好的检测重复性。
[0053]
实施例6 一种检测甲状腺癌靶向用药相关基因变异试剂盒的重现性实验。
[0054]
利用本发明所述的试剂盒，对同1例甲状腺癌样本，由实验室5位不同实验人员，分别按照实施例3的步骤进行检测，以braf基因t1799a位点的检测结果为例，该位点的测序深度分别为4001.34、3898.97、3711.91、3529.13、3619.18（图7），braf基因t1799a位点突变可以被稳定地检出，检出的突变频率分别为23.90%、25.89%、23.42%、27.13%、24.19%。结果表明，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，不同实验操作人员使用本发明所述试剂盒检测结果均表现良好。本发明所述试剂盒具有良好的检测重现性。
[0055]
最后说明的是，以上所例举的实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明的技术方案的限制。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明的形式、内容和细节做出非意想不到的改变，而这些改变并没有偏离本发明权利要求书所限定的范围。

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