一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体、其衍生物及应用的制作方法

[0001]
本发明涉及生物和医学技术领域，尤其涉及一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体、其衍生物及应用。


背景技术：

[0002]
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，简称ra)是一种病因极其复杂的慢性进行性自身免疫性疾病。早期表现为游走性关节疼痛和功能障碍，晚期常可出现关节僵硬和严重变形，致残率高，严重危害着广大人民群众的身体健康。“早发现、早诊断、早治疗”是控制ra疾病进展的主要原则，因而早期、准确诊断ra对患者能否接受早期干预进而延缓疾病进展意义重大。
[0003]
目前ra的临床诊断主要依据关节受累情况、症状持续时间、急性期反应物以及血清类风湿因子(rf)、抗瓜氨酸蛋白抗体(acpa)等血清指标，但由于ra的早期临床症状表现不典型且多样性，而出现关节受累往往已是晚期，加之急性期反应物的非特异性，因此血清学指标对于ra早期诊断、准确诊断就显得尤为重要。
[0004]
然而当前指南所推荐的rf和acpa均存在一定的局限性。rf和acpa不仅能在ra患者中被检测出来，在骨关节炎(oa)、系统性红斑狼疮(sle)等自身免疫病患者中也广泛存在，因此其敏感性或特异性较低，分别为69％，85％和67％，95％，而两者联合诊断ra的敏感性及特异性则仅有78％、82％，误诊率高达19％，此外在早期ra中的表现也不尽人意，阳性率仅为57％，故本领域迫切需要寻找能对ra患者进行早期、准确诊断且操作简单便捷的诊断指标。这方面研究对于在ra患者中做到早发现、早诊断、早治疗，从而减缓疾病进程，控制临床症状，提高生存质量具有重要意义。
[0005]
本发明中的研究对象—人结缔组织生长因子(ctgf/ccn2)属于富半胱氨酸的ccn蛋白家族，是一种与血管生成密切相关的分泌肽，分子量4.5kb，包括4个结构域，由5个外显子和4个内含子组成，编码349个氨基酸，genbank号为np_001892。目前研究认为，ctgf在细胞增殖迁移、血管生成及有丝分裂中均起到一定的促进作用，其与tgf-β的相互作用更是在纤维化的改变中起到重要作用。近年来，更多的研究报道了ctgf在ra发病过程中的作用，如可通过影响破骨细胞代谢、调控tsp-1/tgf-β/ctgf信号通路等影响ra疾病进程。(参考文献：1.connective tissue growth factor promotes articular damage by increased osteoclastogenesis in patients with rheumatoid arthritis.arthritis research&therapy 2009,11.2.nishimura k,sugiyama d,kogata y,tsuji g,nakazawa t,kawano s,et al.meta-analysis:diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis.ann intern med.2007；146(11):797-808；3.sun j,zhang y,liu l,liu g.diagnostic accuracy of combined tests of anti cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis:a meta-analysis.clin exp rheumatol.2014；32
(1):11-21；4.infantino m,manfredi m,meacci f,sarzi-puttini p,ricci c,atzeni f,et al.anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor isotypes in the diagnosis of rheumatoid arthritis:an ssessment of combined tests.clin chim acta.2014；436:237-42.)我们发现ctgf是一个重要的在ra疾病进程中稳定、持续表达的蛋白，并且可由滑液释放入血，其对ra诊断、联合诊断及鉴别诊断能力更为突出。
[0006]
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础医学、新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些ctgf蛋白的核酸适配体序列，然而，这些ctgf蛋白的核酸适配体还没有做到检测试剂盒或者成药的水平。因此，本领域对具有更高的针对ctgf蛋白的结合亲和力的核酸适配体存在需求。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体、其衍生物及应用。
[0008]
本发明所采取的技术方案如下：一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下a-d中的核苷酸序列中的至少一种：
[0009]
a、如seq idnos.1-4所示的任意一个dna序列；
[0010]
b、与seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列具有60％以上同源性的dna序列，其同源性可以为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上或99％以上；
[0011]
c、与seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列进行杂交的dna序列；
[0012]
d、由seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列转录的rna序列；
[0013]
其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合人结缔组织生长因子。
[0014]
本发明设计并合成了一个随机单链dna文库和相应的引物，经适宜的磁珠法筛选九轮得到特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体，将其分别命名为ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt；
[0015]
ctgf-w2-1-76nt的序列如seq idno.1所示，其序列为：5
’-
ttcagcactccacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtgctaccgtgaa-3
’
；
[0016]
ctgf-w2-1-56nt的序列如seq idno.2所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtg-3
’
；
[0017]
ctgf-w2-1-46nt-1的序列如seq idno.3所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactg-3
’
；
[0018]
ctgf-w1-2-56nt的序列如seq idno.4所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcggactgtgttaggtgtaccgccatctctttgggatccctatgcgtg-3
’
。
[0019]
所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
[0020]
所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶。
[0021]
上述荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna、酶为常用的标记、检测、诊断或治疗的物质。
[0022]
以上经修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都能与人结缔组织生长因子结合；经修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与人结缔组织生长因子的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。
[0023]
一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体衍生物，所述衍生物为如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。核酸适配体衍生物具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即可特异性结合人结缔组织生长因子。
[0024]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在检测人结缔组织生长因子中的应用。
[0025]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在制备检测人结缔组织生长因子试剂盒或检测人结缔组织生长因子的分子探针中的应用。
[0026]
可以用上述核酸适配体来检测受试者血清中ctgf蛋白的浓度，进而判断受试者是否具有ctgf表达水平异常相关的疾病例如异常的炎性反应相关的诸如类风湿关节炎等疾病；抑制ctgf活性可用于治疗ctgf异常的相关疾病，例如类风湿关节炎等。
[0027]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在纯化人结缔组织生长因子中的应用。
[0028]
人结缔组织生长因子的纯化方法有多种，如：将上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物与含有ctgf蛋白的样品液孵育，使得二者特异性结合形成复合物，回收复合物，通过高盐或者其他方法将结合的ctgf蛋白洗脱下来，即纯化得到ctgf蛋白；
[0029]
或者，先将上述核酸适配体固定到固相基质上，将含有ctgf蛋白的样品液缓慢流经固相基质，二者会特异性结合，且不会与其它无关蛋白结合，然后用缓冲液清洗固相基质，去除未结合的无关蛋白，再用高盐或者其他方法将结合的ctgf洗脱并收集，即纯化得到ctgf蛋白。本领域技术人员能够依据实际需要选择适当的纯化方法。
[0030]
本发明的有益效果如下：本发明提供的核酸适配体具有比蛋白抗体易合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且更稳定，易于保存，无批次间差异等优点；本发明可在常温的血清环境中结合ctgf蛋白；另外，与目前已经公布的一些ctgf蛋白的核酸适配体相比，本发明提供的核酸适配体对ctgf蛋白的亲和力更高，结构更稳定，在pbs缓冲液中有很强的结合，蛋白点杂交实验中可以识别ctgf蛋白，可以用于快速、敏捷且准确地检测ctgf蛋白，并且本发明可以在血清中与ctgf蛋白结合。
附图说明
[0031]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
[0032]
图1为实施例1中第五轮、第七轮、第九轮所得文库与人结缔组织生长因子的亲和力spr检测结果。
[0033]
图2为如seq id nos.1-4所示的dna序列在pbs缓冲液中与人结缔组织生长因子的亲和力spr检测结果。
[0034]
图3为如seq id nos.1-4所示的dna序列与ctgf的结合kd值用spr检测的结果。
[0035]
图4为如seq id nos.1-4所示的dna序列用蛋白点杂交检测人结缔组织生长因子的结果。
具体实施方式
[0036]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0037]
一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含以下a-d中的核苷酸序列中的至少一种：
[0038]
a、如seq idnos.1-4所示的任意一个dna序列；
[0039]
b、与seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列具有60％以上同源性的dna序列，如将seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列删除或增加部分互补的核苷酸，其同源性可以为60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上或99％以上；
[0040]
c、与seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列进行杂交的dna序列；
[0041]
d、由seq id nos.1-4所示的任意一个dna序列转录的rna序列；
[0042]
其中，上述核苷酸序列均能够特异性结合人结缔组织生长因子。
[0043]
本发明设计并合成了一个随机单链dna文库和相应的引物，经适宜的磁珠法筛选九轮得到特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体，将其分别命名为ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt；
[0044]
ctgf-w2-1-76nt的序列如seq idno.1所示，其序列为：5
’-
ttcagcactccacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtgctaccgtgaa-3
’
；
[0045]
ctgf-w2-1-56nt的序列如seq idno.2所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtg-3
’
；
[0046]
ctgf-w2-1-46nt-1的序列如seq idno.3所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactg-3
’
；
[0047]
ctgf-w1-2-56nt的序列如seq idno.4所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcggactgtgttaggtgtaccgccatctctttgggatccctatgcgtg-3
’
。
[0048]
所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化。
[0049]
所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶。
[0050]
上述荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、
sirna、酶为常用的标记、检测、诊断或治疗的物质。
[0051]
以上经修饰或连接处理后的核酸适配体，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都能与人结缔组织生长因子结合；经修饰或连接处理后的核酸适配体可以保持或提高核酸适配体与人结缔组织生长因子的亲和力，或可以提高核酸适配体的稳定性。
[0052]
一种特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体衍生物，所述衍生物为如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。核酸适配体衍生物具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即可特异性结合人结缔组织生长因子。
[0053]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在检测人结缔组织生长因子中的应用。
[0054]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在制备检测人结缔组织生长因子试剂盒或检测人结缔组织生长因子的分子探针中的应用。
[0055]
可以用上述核酸适配体来检测受试者血清中ctgf蛋白的浓度，进而判断受试者是否具有ctgf表达水平异常相关的疾病例如异常的炎性反应相关的诸如类风湿关节炎等疾病；抑制ctgf活性可用于治疗ctgf异常的相关疾病，例如类风湿关节炎等。
[0056]
如上述的特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体或其衍生物在纯化人结缔组织生长因子中的应用。
[0057]
人结缔组织生长因子的纯化方法有多种，如：将上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物与含有ctgf蛋白的样品液孵育，使得二者特异性结合形成复合物，回收复合物，通过高盐或者其他方法将结合的ctgf蛋白洗脱下来，即纯化得到ctgf蛋白；
[0058]
或者，先将上述核酸适配体固定到固相基质上，将含有ctgf蛋白的样品液缓慢流经固相基质，二者会特异性结合，且不会与其它无关蛋白结合，然后用缓冲液清洗固相基质，去除未结合的无关蛋白，再用高盐或者其他方法将结合的ctgf洗脱并收集，即纯化得到ctgf蛋白。本领域技术人员能够依据实际需要选择适当的纯化方法。
[0059]
以下实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
[0060]
实施例1
[0061]
特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体的筛选
[0062]
1.合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：
[0063]
随机单链dna文库：
[0064]
5
’-
ttcagcactccacgcatagc-36n-cctatgcgtgctaccgtgaa-3
’
[0065]
其中，“36n”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示，
[0066]
表1引物及其序列
[0067][0068]
备注：libp1s1为正向引物；libp1a2为反向引物；libp1s1-fam为荧光标记的正向引物；libp1a2-ploya为连接有polya尾的反向引物，polya为由19个腺苷酸(a)组成的polya尾，“spacer 18”为18原子的六乙二醇间臂，其结构式如下：
[0069][0070]
将随机单链dna文库、引物分别用pbs缓冲液((kcl:0.2g/l，kh2po4:0.24g/l，nacl:8g/l，na2hpo4:1.44g/l；ph7.2，25℃)配制成100μm贮存液，依次记为随机单链dna文库储备液、libp1s1储备液、libp1a2储备液、libp1s1-fam储备液、libp1a2-ploya储备液，于-20℃保存备用。
[0071]
2.磁珠法筛选
[0072]
2.1羧基磁珠固定靶标蛋白(ctgf蛋白)：
[0073]
(1)取50μl羧基磁珠(invitrogen,dynabeads
tm
myone
tm
carboxylic acid，#65012)，用200μl pbs缓冲液(kcl:0.2g/l，kh
2
po
4
:0.24g/l，nacl:8g/l，na
2
hpo
4
:1.44g/l)清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清；
[0074]
(2)取配置好的nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)各50μl，等体积混合，加入到上一步清洗后的磁珠中，室温孵育20min活化磁珠表面的羧基，磁珠用pbs缓冲液清洗1遍后得到活化后的磁珠，尽快用于下一步；
[0075]
(3)取20μl浓度为50ug/ml的ctgf蛋白(货号：9190-cc-050；r&d systems)，加入ph4.5，10mm naac溶液80μl混匀，然后加至活化后的磁珠中，室温摇床孵育60min(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，使得ctgf蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面，磁铁垂钓磁珠，去上清得到固定靶标的磁珠；
[0076]
(4)取100μl 1m乙醇胺ph8.5加至固定靶标的磁珠中，室温，摇床孵育10min，封闭磁珠表面未反应的活化位点，磁铁垂钓磁珠，去上清，用200μl pbs缓冲液清洗4遍，此磁珠记为mb-ctgf磁珠，待用；
[0077]
2.2羧基磁珠固定bsa蛋白：
[0078]
方法同2.1，用bsa蛋白替换ctgf蛋白，其他条件相同，获得的磁珠记为mb-bsa磁珠，待用；
[0079]
2.3磁珠筛选过程：
[0080]
2.3.1文库变复性处理：取1od随机单链dna文库作为起始文库，14000rpm离心
10min，将文库粉末离心到管底，用pbs缓冲液溶解至5μm，分装到pcr管进行变复性处理，变复性处理过程如下：pcr仪设定程序95℃保持10min，拿出pcr管立即冰水浴5min，然后将pcr管置于室温平衡至室温得到变复性处理后文库，变复性处理目的是使折叠的链解开，然后再折叠成一定的构象；
[0081]
2.3.2反筛：将变复性处理后文库加入到2.2得到的mb-bsa磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育60min，磁铁垂钓磁珠，收集得到上清pool-，备用于正筛步骤；将孵育后的磁珠加入200μl pbs缓冲液清洗4次，清洗后的磁珠加入200μl pbs缓冲液中，沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，收集煮沸后的上清标记为elution-bsa备用，丢弃磁珠；
[0082]
2.3.3正筛：将上清全部加入到2.1得到的mb-ctgf磁珠中，室温摇床孵育60min，结束后吸弃上清，保留磁珠，用pbs缓冲液清洗磁珠4次，每次200μl，吸弃上清，向清洗后的磁珠中加入200μl pbs缓冲液，沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，回收上清标记为elution-ctgf；
[0083]
2.3.4计算正筛、反筛的文库保留率：取罗氏8联排pcr管，每孔加入28μl q-pcrmix，再分别加入elution-bsa和elution-ctgf各2μl，进行荧光定量pcr，其程序如下：95℃预变性2min；95℃变性0.5min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，共25个循环；
[0084]
然后根据q-pcr的起跳循环数以及标准曲线，分别计算出elution-ctgf和elution-bsa中的分子数，并分别计算其与投入的起始文库的总分子数的比值即得正筛、反筛的文库保留率，这样可以有效的监测每一轮筛选的效果；
[0085]
其中，q-pcr mix的配方如表2：
[0086]
表2 q-pcr mix的配方
[0087]
试剂体积(μl)ddh
2
o82610*pfu酶缓冲液100dntpmix(10mm)20引物libp1s15引物libp1a25pfu酶4evagreen染料40
[0088]
上述每一轮筛选的条件、文库保留率见表3：
[0089]
表3各轮筛选的条件、各轮文库保留率
[0090][0091]
2.4乳浊液pcr(e-pcr)：以elution-ctgf中的核酸分子为模板，用乳浊液pcr(epcr)进行扩增，方法如下：将全部模板elution-ctgf加入2ml pcr mix中混匀，加入4倍体积的epcr微液滴生成油，涡旋制备得到乳浊液；将乳浊液分装到pcr管中扩增，100μl/管，扩增条件如下：95℃预变性2min，95℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，共30个循环，4℃保存；
[0092]
其中，epcr微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(aptamy)生物科技有限公司(货号：epo100)，pcr mix的配方见表4。
[0093]
表4 pcr mix的配方
[0094]
[0095][0096]
2.5制备单链：收集所有的epcr产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；于25℃，9000rpm离心10min；移弃上相(正丁醇和油)，得到浓缩的pcr扩增产物，按体积比1：1加入tbe尿素变性缓冲液，煮沸变性15min使dna变性，随后冰浴1min，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，于400v电泳至溴酚蓝到达胶底部，使fam标记的单链dna与加长的反向的带有polya的单链dna分开。其中，tbe尿素变性缓冲液和尿素变性聚丙烯酰胺凝胶均购自昂普拓迈生物科技有限责任公司，货号分别为tlb-5、ddp-100；
[0097]
2.6切胶回收fam标记的单链dna：将凝胶取出放在塑料膜上，ex(nm)：495，em(nm)：517条件下检测fam标记的单链dna；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5ml ep管中并捣碎，加入1ml ddh
2
o后沸水浴10min将胶中的fam标记的单链dna转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清，上清用正丁醇纯化，纯化方法为：加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；于25℃，9000rpm离心5min；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的fam标记的单链dna，用3.5kd的透析袋透析过夜得到次级文库，透析液为pbs缓冲液；
[0098]
3、多轮筛选：重复筛选9轮，每次操作均以前一轮第2.6步操作中得到的次级文库为起始文库，筛选过程中用spr检测每一轮的次级文库对ctgf蛋白的识别能力变化(第五轮、第七轮、第九轮筛选得到的次级文库与ctgf蛋白的亲和力检测的spr结果如图1所示，具体操作步骤见实施例2)，当次级文库对ctgf蛋白的识别能力满足要求(即次级文库与靶标的结合能力高于第一轮投入的随机单链dna文库)，将得到的次级文库经克隆测序分析后，挑选若干条序列由北京擎科生物科技公司合成，检测亲和力，经过亲和力检测以及序列优化，最后确定了4条dna序列与ctgf具有很强的结合能力(参见实施例3-5)，即为特异性结合人结缔组织生长因子的核酸适配体，将其分别命名为ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt；
[0099]
ctgf-w2-1-76nt的序列如seq idno.1所示，其序列为：5
’-
ttcagcactccacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtgctaccgtgaa-3
’
；
[0100]
ctgf-w2-1-56nt的序列如seq idno.2所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactgcctatgcgtg-3
’
；
[0101]
ctgf-w2-1-46nt-1的序列如seq idno.3所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcaggccgggagggtacccattgatggtgtgatgactg-3
’
；
[0102]
ctgf-w1-2-56nt的序列如seq idno.4所示，其序列为：5
’-
cacgcatagcggactgtgttaggtgtaccgccatctctttgggatccctatgcgtg-3
’
；
[0103]
所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入起始文库的量、靶标蛋白的用量，缩短起始文库和靶标蛋白的孵育时间，增加磁珠清洗时间、清洗次数(本次筛选详细参数见表3)。
[0104]
实施例2
[0105]
表面等离子共振(spr)检测实施例1中第五轮筛选、第七轮筛选、第九轮筛选得到的次级文库和ctgf蛋白的亲和力。
w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt蛋白的结合kd值
[0125]
溶液配制：
[0126]
取ctgf-w2-1-76nt用pbs缓冲液稀释成一系列不同浓度的溶液，其浓度为：600nm、300nm、150nm、75nm、37.5nm、18.75nm、9.375nm。
[0127]
取ctgf-w2-1-56nt用pbs缓冲液稀释成一系列不同浓度的溶液，其浓度为：600nm、300nm、150nm、75nm、37.5nm、18.75nm、9.375nm。
[0128]
取ctgf-w2-1-46nt-1用pbs缓冲液稀释成一系列不同浓度的溶液，其浓度为：600nm、300nm、150nm、75nm、37.5nm、18.75nm、9.375nm。
[0129]
取ctgf-w1-2-56nt用pbs缓冲液稀释成一系列不同浓度的溶液，其浓度为：600nm、300nm、150nm、75nm、37.5nm、18.75nm、9.375nm。
[0130]
操作：
[0131]
将ctgf蛋白偶联到cm5芯片(ge healthcare货号：br100399)表面：ctgf蛋白用ph 4.5的10mm醋酸钠稀释至终浓度为20μg/ml后，进样体积20μl，流速5ul/min，ctgf蛋白偶联量为1500ru，其他同实施例2中的ctgf通道偶联过程。
[0132]
检测：使用表面等离子共振仪(ge healthcare，型号：biacore t200)设定检测参数，进样10μl/min*3min，解离10μl/min*5min，再生：1m nacl 30μl/min*30s，仪器运行的缓冲液为pbs缓冲液，取上述各核酸适配的系列溶液从低浓度到高浓度依次进样，检测结果参见图4；图4为如seq id nos.1-4所示的dna序列与人结缔组织生长因子的结合kd值用spr检测的结果。
[0133]
由图4可以看出，ctgf-w2-1-76nt与人结缔组织生长因子的结合kd值为1.17e-8m；ctgf-w2-1-56nt与人结缔组织生长因子的结合kd值为：1.96e-8m；ctgf-w2-1-46nt-1与人结缔组织生长因子的结合kd值为：4.57e-8m，ctgf-w1-2-56nt与人结缔组织生长因子的结合kd值为：7.44e-8m；kd值均在nm级别以上，seq id nos.1-4所示的dna序列与人结缔组织生长因子的亲和力很高
[0134]
实施例5
[0135]
蛋白点杂交实验检测生物素修饰的核酸适配体ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt蛋白的相互作用
[0136]
溶液配制：
[0137]
ctgf蛋白系列溶液：取ctgf蛋白分别用pbs缓冲液稀释成浓度为0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml的溶液。
[0138]
对照蛋白溶液：取对照蛋白tnf-α用pbs缓冲液稀释成浓度为0.5mg/ml的溶液。
[0139]
10％bsa溶液：取bsa蛋白用pbs缓冲液稀释成质量分数为10wt％的溶液。
[0140]
pbst缓冲液：取tween20用pbs缓冲液稀释成体积分数为0.5
‰
的溶液。
[0141]
变复性核酸适配体溶液：取ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt分别用pbs缓冲液稀释成1μm的溶液，分别经变复性处理(95℃保持10min，然后立即冰浴5min，再室温平衡10min)得到各自对应的变复性核酸适配体溶液。
[0142]
hrp-标记的链霉抗生物素蛋白溶液：hrp-标记的链霉抗生物素蛋白(购自博奥森，货号bs-0437p-hrp)用pbst缓冲液按照1：5000(v/v)配制得到。
[0143]
显色液：a液：b液＝1:1(v/v)，(pierce
tm
ecl western blotting substrate，购自
赛默飞世尔，货号32106，1液和2液为试剂盒自带溶液)。
[0144]
操作：
[0145]
取ctgf蛋白系列溶液、对照蛋白溶液各1μl，分别点样到硝酸纤维素膜上(购自millipore，规格15cm
×
20cm)，自然风干，然后用10％bsa溶液于室温封闭2h，接着用pbst缓冲液清洗3次，吸净；共做4份平行样；
[0146]
将4个变复性核酸适配体溶液分别和硝酸纤维素膜上的蛋白摇床室温孵育2h，然后用pbst缓冲液洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10min；加入hrp-标记的链霉抗生物素蛋白溶液室温摇床孵育30min，用pbst缓冲液洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10min；加入显色液于室温显色，使用仪器(上海勤翔科学仪器有限公司的一体式化学发光成像系统)观察拍照，结果参见图4，图4为如seq id nos.1-4所示的dna序用蛋白点杂交检测人结缔组织生长因子的结果。
[0147]
由图4可以看出，图4包含了各蛋白浓度梯度变化的情况以及对照蛋白的情况，可以看出生物素修饰的ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt对ctgf蛋白显色明显，随着ctgf蛋白浓度的降低，显色的斑点颜色变浅，而对tnf-α蛋白没有显色，这说明生物素修饰的ctgf-w2-1-76nt、ctgf-w2-1-56nt、ctgf-w2-1-46nt-1、ctgf-w1-2-56nt均可以用于膜杂交ctgf蛋白的检测，而且灵敏度较高。
[0148]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0149]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

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