一种重组人生长激素蛋白的纯化方法与流程

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本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组人生长激素真核表达纯化方法。


背景技术：

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人生长激素(human growth hormone,以下简写为hgh)含有191个氨基酸残基，分子量为21.7 kda,等电点4.9，是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能，在人体生长发育过程中起着重要作用。hgh能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。hgh基因工程产品问世以来，适应症范围扩大到成人生长激素缺乏、turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。
[0003]
全球生长激素市场非常巨大，目前利用dna重组技术在大肠杆菌中表达的重组人生长激素，但是大肠杆菌重组表达外源蛋白会在蛋白的n端加入起始密码子，与天然蛋白相比多了起始氨基酸-蛋氨酸，有时候为了纯化方便，也会在蛋白质序列中加入一定的标签，应用该类生长激素后易产生抗体；因此，人们趋向于研究n-端不带met或标签的人生长激素。用大肠杆菌生产无met的人生长激素有两种方法，一种是在胞内表达产生met-人生长激素后，在加工、纯化过程中用酶法除去met分子；另一种方法是用分泌型载体，把人生长激素成熟蛋白的编码序列直接转录入高表达高分泌启动子和信号序列后面，在分泌过程中切去信号肽，使表达的人生长激素累积在细胞周质中。毕赤酵母作为低等真核生物，具有高效分泌表达的特点，同时可以利用自身信号肽的切割的特点，获得无met的人生长激素。为了不产生抗体，需要不带标签和met的与天然hgh相同序列，这就给hgh的纯化带来了困难。


技术实现要素：

[0004]
为了克服以上缺点，发明人对hgh基因在毕赤酵母表达系统中进行了优化，并做了对表达hgh纯化的探索，发明人惊喜地发现，在该表达系统中，酵母分泌表达的hgh可以被300 kd孔径的超滤膜截留，通过300kd超滤膜截留后可以去除酵母分泌表达的绝大部分蛋白质并同时脱盐。再经过一步分子筛就可以得到纯度96%以上的hgh蛋白。hgh蛋白具体纯化步骤如下：一种重组hgh蛋白的纯化方法，包括以下步骤：1）酵母重组子发酵表达重组hgh蛋白；2）发酵液的处理：将步骤1）所得的发酵液进行固液分离，取上清，过2 um滤膜，收集滤液；3）超滤：将步骤2）得到的滤液用300 kd超滤膜超滤，取截留液；4）将步骤3）获得的截留液过分子筛，得到纯化的hgh蛋白。
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作为优选所述步骤1）酵母重组子发酵表达重组hgh蛋白包括以下步骤：a.构建含有编码hgh蛋白基因序列的ppiczαa-hgh重组载体；b.将步骤a的ppiczαa-hgh重组载体线性
化后转入smd1168毕赤酵母菌株中，获得酵母重组子ppiczαa-hgh-smd1168；c.酵母重组子ppiczαa-hgh-smd1168培养并适时补料，当酵母湿重150 mg/ml以上时，甲醇诱导 36-60 h。
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作为优选所述的编码hgh蛋白基因序列如seq id no：1所示，ppiczαa-hgh载体dna序列如seq id: 1所示。
[0007]
作为优选所述酵母重组子ppiczαa-hgh-smd1168培养条件为：温度30 ℃，ph 值为5.0，溶氧控制在25%～45%；甲醇诱导条件为：温度28 ℃，ph 值为5.6，溶氧控制在25%～45%。
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作为优选步骤2）所述固液分离是指将步骤1）得到的发酵液5000rpm离心5～10min。
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作为优选步骤3）所述超滤为切向超滤。
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作为优选步骤3）所述超滤包含以下步骤：将步骤2）得到的滤液调ph至6.9～7.5过300 kd切向超滤膜超滤，压力0.1～0.2兆帕，当截留液为原体积的1/8～1/15时，加入5～10倍体积的ddh2o，继续超滤至原体积1/8～1/15；重复3～8次。
[0011]
作为优选步骤4）所述分子筛为：sephadex g200。
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作为优选步骤4）具体包含以下步骤：用去离子水平衡分子筛2～3个柱体积，浓缩样品上样，去离子水洗脱，用核酸蛋白仪检测，收集人生长激素蛋白峰，浓缩，冷冻干燥。
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本发明的有益效果：通过300 kd的切向流超滤膜包可以将发酵上清液中的绝大多数小于100 kd的蛋白质去掉，极大的简化了后续纯化步骤，并提高蛋白的分离效率和蛋白纯度。hgh分子量虽然只有21.7 kd，但我们发酵得到的重组hgh可以透过300kd的超滤管，但却不能透过300 kd的切向流超滤膜包，这是意想不到的的。
附图说明
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图1是300 kd滤膜超滤蛋白电泳图，其中m为蛋白质分子量marker，1为300 kd的切向流滤膜超滤截留液，2为300 kd切向流滤膜超滤穿透液。箭头所示为表达的重组hgh。
具体实施方式
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为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
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实施例1：可表达hgh重组酵母菌的获得。
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1通过人工合成以及分子克隆技术构建含有编码hgh基因的ppiczαa-hgh重组质粒，其中编码hgh基因的dna序列如seq id: 1所示，ppiczαa-hgh重组质粒dna序列如seq id: 2所示。
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2将步骤1的ppiczαa-hgh重组质粒用限制性内切酶saci线性化，并回收。将回收的线性化质粒电转入smd1168毕赤酵母菌株中，获得重组菌ppiczαa-hgh-smd1168。电转条件如下;取10 μg上述线性化的ppiczαa-hgh质粒，与80 μl毕赤酵母smd1168感受态细胞混匀，转至0.2 cm冰预冷的电转化杯中，电压1 kv；电容30 μf；电阻200 ω；电击4～10毫秒，加入1 ml冰预冷的1 mol/l的山梨醇溶液将菌体混匀，放入30摄氏度水浴锅，水浴30 min，完成
转化。将完成转化的酵母用选择培养基进行筛选，获得阳性克隆ppiczαa-hgh-smd1168重组菌。
[0019]
实施例2 ：重组人生长激素蛋白的发酵。
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将筛选到的ppiczαa-hgh-smd1168重组菌接种于300 ml bmgy（酵母提取物10 g/l，蛋白胨20 g/l，k2hpo4 3 g/l，kh2po4 11.8 g/l，ynb 13.4 g/l，生物素4
×
10-4 g/l，甘油10 g/l）培养基中，30 ℃振荡培养24小时，作为种子转接于装有3 l bmgy培养基的5 l发酵罐中，温度设定为30 ℃，ph 值为5.0，溶氧控制在25%～45%，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加10-20 ml/h/l质量百分浓度为50 %的甘油（优选12 ml/h/l），在质量百分浓度为50 %甘油中含12 ml/l微量元素ptm1（1l微量元素ptm1中含cuso4.5h2o 6 g、nai 0.08 g、mnso4.h2o 3g、na2moo4.h2o 0.2 g、h3bo3 0.02 g、h2so4 5 ml、cocl2.6h2o 0. 5 g、zncl2 20 g、feso4.7h2o 75 g、生物素 0.2 g）维持溶氧在25%～45%。发酵液的湿菌重达到150-200 mg/ml时，停止补料，饥饿1-2小时，甘油耗尽，流加20 l甲醇诱导发酵，其中甲醇中含12 ml/l ptm1 微量元素，以速率为5 ml/l/h流加2～3 小时，然后提高速率至8 ml/l/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20%，诱导发酵36～48小时。诱导温度28 ℃，ph 值为5～5.5。
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实施例3：重组人生长激素的纯化。
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（1）超滤。发酵结束后，发酵液离心分离，5000 rpm，10 min，取上清液。过2 um滤膜，收集滤液。用氢氧化钠调滤液ph为6.9-7.5（优选7）用分子截留量为300 kd的切向流超滤膜包进行超滤，超滤压力为0.1～0.2兆帕：当截留液体积减少为原体积的1/8～1/15（优选1/10）时，加入5～10倍体积的（优选5）ddh2o，继续超滤至原体积1/8～1/15；重复3～8次（优选5次）；收集截留液。通过上述一步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的大量蛋白质并同时脱盐，获得人生长激素蛋白浓缩液。
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取超滤截留液即生长激素蛋白浓缩液和穿透液进行sds-page电泳，结果如图1（其中m为蛋白质分子量marker，从下往上数第一条带分子量为15 kd，第二条带分子量为35 kd；1泳道为300 kd滤膜超滤截留液；2泳道为300 kd滤膜超滤穿透液；箭头所示为表达的重组hgh）所示。我们惊喜的发现，重组表达的人生长激素蛋白并不能穿透分子截流量为300 kd的切向流超滤膜，但是发酵液上清中酵母本身分泌表达的大多数分子量小于300 kd的蛋白都穿透过膜，所以该步骤不仅浓缩脱盐，并且一步去除了发酵上清液中的绝大多数杂蛋白，蛋白质纯度可以达到80%以上。大大简化了纯化步骤。
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（2)分子筛层析。用sephadex g200分子筛，层析分离人生长激素浓缩液。用去离子水平衡2～3个柱体积，浓缩样品上样，上样量不多于柱体积的十分之一，流速为10 ml/min，去离子水洗脱，用核酸蛋白仪检测，收集人生长激素蛋白峰，浓缩，冷冻干燥，获得人生长激素。
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将获得的重组人生长激素进行质谱检测，确定为人生长激素编码序列。该方法纯化得到的重组人生长激素纯度可以达到96%以上。
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经过步骤1超滤后的截留液中的杂蛋白大多是高分子量蛋白，而hgh分子量只有21.7kd，与杂蛋白分子量差异比较大，所以再通过一步分子筛，可以有效分离重组表达的hgh蛋白。
[0027]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范
围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

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