一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用。


背景技术：

[0002]
类风湿关节炎是一种病因复杂且反复发作的自身免疫性疾病，其病理特征表现为关节滑膜慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和纤维化，给广大患者造成了极大的不便及痛苦。由于其病因尚未完全明确，发病机制涉及到遗传、环境、免疫等多个方面，故而现行药物难以根治患者，仅仅只能做到对症治疗，即减轻或消除患者因关节炎症造成的关节红肿疼痛，控制疾病的发展，减少关节破坏，尽可能保证受累关节的功能。
[0003]
国内外治疗类风湿关节炎的药物常用包括非甾体抗炎药(nsaids)、改善病情抗风湿药(dmards)、生物制剂、中药及中药制剂等。其中抗体类生物制剂常以tnf-α、il-1、il-6等作为靶点。由于这些蛋白在维持机体正常免疫功能方面发挥着重要的作用，故而采用其抑制剂作为药物进行治疗的不良反应较为显著。从人组合抗体库中采用噬菌体展示等技术能筛选出以细胞膜受体之天然配体为靶点的抑制剂或激活剂，这些抑制剂或激活剂的化学本质是抗体。不仅结构稳定(避免药物在到达病灶前，在体内被提前降解)，且靶向性良好(可大大减少毒副作用)，更为重要的是：这样产生的抗体能够克服杂交瘤技术生产抗体易引起排异反应、制备过程复杂、融合效率不高、抗体产量低、抗体不稳定、穿透力弱的缺点，还能实现高通量、快速筛选抗体的目的，且价格低廉。
[0004]
人结缔组织生长因子是当前发现的与类风湿关节炎发病以及病程进展密切相关的蛋白，但至今未见从人组合抗体库中采用噬菌体展示等技术筛选以人结缔组织生长因子为靶点的抑制剂抗体的文献和产品。相比现有治疗类风湿关节炎的抗体类药物，人结缔组织生长因子为靶点的抗体类抑制剂药物还处于年轻的上升阶段，有很大的开拓空间。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种本发明提供了抗人结缔组织生长因子全人源单克隆单链抗体scfv，利用基因工程的方法，在类风湿关节炎患者全人源噬菌体抗体库中淘选并鉴定出人结缔组织生长因子全人源单链抗体scfv，其特异性结合人结缔组织生长因子。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0007]
一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，该全人源拮抗抗体为单链抗体，其氨基酸序列为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10所示。
[0008]
编码如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体的基因。
[0009]
所述基因的核苷酸序列分别为seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19或seqidno:20，分别对
应氨基酸序列为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10的全人源拮抗抗体。
[0010]
一种含有如上述的基因的表达载体。这些表达载体可以选自质粒或病毒。
[0011]
一种含有如上述的表达载体的重组细胞。这些重组细胞可以为真核细胞或原核细胞。
[0012]
一种如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体的酶解片段，所述酶解片段为fab、fab
′
、f(ab
′
)2或fv片段。
[0013]
一种如上述的酶解片段的编码基因。
[0014]
如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体在制备靶向人结缔组织生长因子的抑制剂的应用。
[0015]
如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体在制备制备治疗或缓解类风湿关节炎的药物的应用。
[0016]
本发明的有益效果如下：本发明通过类风湿关节炎患者scfv噬菌体抗体库，筛选出全人源抗ctgf单克隆抗体，并分别测定其核苷酸序列和氨基酸序列，通过该方法获得的全人源拮抗抗体具有靶向人结缔组织生长因子的特异性。
附图说明
[0017]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
[0018]
图1为pcr扩增轻链可变区vκ基因；
[0019]
图2为pcr扩增重链可变区vh基因；
[0020]
图3为pcr扩增轻链可变区vλ基因；
[0021]
图4为soe-pcr扩增scfv基因；
[0022]
图5为单克隆噬菌体elisa检测中全人源抗体实验组的结果图；
[0023]
图6为具有靶向特异性的全人源拮抗抗体的重、轻链序列图；
[0024]
图7为ctgf拮抗抗体治疗cia小鼠关节损伤及疾病进程对比。
具体实施方式
[0025]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0026]
本发明提供一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，为单链抗体，其具有靶向人结缔组织生长因子的特异性，其氨基酸序列为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10所示。
[0027]
本发明的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体可以与其他治疗类风湿关节炎的抗体类药物融合，所形成的抗体一方面可以发挥靶向人结缔组织生长因子的作用，另一方面可以起到治疗类风湿关节炎作用。
[0028]
上述单链抗体的dna可以通过常规的基因重组技术获得。将编码上述单链抗体的dna序列用pcr获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或基因片段。在编码上述抗体的dna序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(polya)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。
[0029]
本发明的单链抗体可以与其他效应分子进一步融合，以达到其他额外的作用，而不影响其靶向性，它们都属于本发明的范畴。
[0030]
在完成含编码上述抗体的dna序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达抗体的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。由于原核细胞表达抗体容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达抗体的哺乳动物细胞有多种，例如cho细胞、293细胞、ns0细胞、cos细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述抗体基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。
[0031]
一种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素(neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株；又例如用含有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的重组载体稳定转染缺乏dhfr的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(mtx)的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。
[0032]
哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达本发明的抗体，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是容易形成包涵体，因此需要进一步蛋白复性。
[0033]
本发明的抗体还可以用病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviralvectors)、腺相关病毒载体(adeno-associatedviralvectors)、反转录病毒载体(retroviralvectors)、单纯疱疹病毒载体(herpessimplexvirus-basedvectors)、慢病毒载体(lentiviralvectors)。
[0034]
本发明的抗体可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。
[0035]
本发明的抗体可以与其他药物形成药物组合物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗疾病，所述其他治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。
[0036]
本发明的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体为通过类风湿关节炎患者scfv噬菌体抗体库筛选出的。具体过程如下：
[0037]
1.实验例证信息说明
[0038]
抗原:ctf-h82e6(biotinylated human ctgf/ccn2protein，购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司)；
[0039]
用于筛选的噬菌体文库:类风湿关节炎患者scfv噬菌体抗体文库；
[0040]
例证目的:从类风湿关节炎患者scfv噬菌体抗体库筛选以人结缔组织生长因子为
靶点的拮抗抗体。
[0041]
2.实验内容
[0042]
2.1类风湿关节炎患者scfv噬菌体抗体文库构建
[0043]
(1)cdna的制备：收集类风湿关节炎患者共45人的外周血5毫升，edta-k2抗凝并采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(pbmc)，每5个患者pbmc混在一起提取rna，再逆转成cdna。
[0044]
(2)vh和vl基因的pcr扩增与连接：设计合成扩增人抗体基因的引物。以cdna第一链为模板，进行pcr扩增vh和vl基因。并通过编码连接肽(gly4ser)3使vh和vl基因连成scfv基因。琼脂糖电泳结果结果见图1、图2、图3和图4。
[0045]
(3)噬菌体抗体库的构建：以vh和vl基因片段为模板，将扩增产物以适当比例混合，通过重叠pcr拼接，扩增scfv基因，克隆入pcantab-5e载体中，电穿孔转化tg1，计数克隆测定库容为107，细菌增殖后经辅助噬菌体超感染获噬菌体抗体库。
[0046]
2.2液相-亲和淘选
[0047]
2.2.1封闭噬菌体文库和磁珠
[0048]
(1)封闭噬菌体文库。将1
×
10
11
的噬菌体文库加入3％m-pbs封闭液(即含3％脱脂奶粉的pbs)中，颠倒混合均匀，37℃，放置1～2h。
[0049]
(2)封闭磁珠:将磁珠瓶置于旋涡振荡器上，震荡重悬20s，准备a和b两个新的离心管，用移液器分别取50ul磁珠到新的离心管中，加入1ml 0.05％pbst，震荡重悬20s，磁性分离2min,移除上清液。(共洗涤2次)
[0050]
(3)“a管-负淘选"与“b管-正淘选”分别加入1ml封闭液，震荡重悬20s,磁性分离5min,移除上清:再次加入1ml封闭液，颠倒混合均匀，放置于旋转混匀器上，室温20rpm放置1h。
[0051]
2.2.2抗原蛋白与磁珠结合，噬菌体文库负淘
[0052]
(1)抗原-磁珠结合:“b管-正淘选"，瞬离磁性分离2min,移除上清，0.05％pbst洗涤2次，加入1ml生物素化的抗原蛋白(ctf-h82e6，biotinylated humanctgf/ccn2protein)0.05％pbst稀释，使磁珠浓度为lmg/ml，颠倒混合均匀，放置于旋转混匀器上室温20rpm放置1h。
[0053]
(2)噬菌体文库负淘:“a管-负淘选"，瞬离，磁性分离2min,移除上清，0.05％pbst洗涤3次，将经过封闭的噬菌体文库加入a管，颠倒混合均匀，放置于旋转混匀器上，室温20rpm放置1h。1小时后，a管磁性分离2min，转移上清加到新ep管中，即为经过封闭与负淘选的噬菌体文库。
[0054]
2.2.3淘选
[0055]
(1)抗原抗体结合:“b管-正淘选"，瞬离，磁性分离2min,移除上清，0.05％pbst洗涤3次，加入负淘的噬菌体文库，颠倒混合均匀，放置于旋转混匀器上，室温20rpm放置0.5～1h。
[0056]
(2)洗涤:“b管-正淘选”磁性分离5min，吸去上清，加入1ml 0.1％～0.5％pbst，震荡重悬20s，磁性分离2min，吸去上清。重复此步骤10～20次。
[0057]
(3)洗脱中和:b管，磁性分离2min，吸去上清，pbst洗涤2次，加入400ul洗脱缓冲液(甘氨酸盐酸ph2.2)，颠倒混合均匀，放置于旋转混匀器上，室温20rpm放置10min。磁性分离
2min，吸取上清加入新的1.5ml ep管(提前加入200ul中和缓冲液(1m tris盐酸ph8.0)，4℃备用。详细情况见表1。
[0058]
表1.每轮淘选选择的条件
[0059][0060]
2.3扩增洗脱产物
[0061]
(1)挑取平板上的tg1单克隆，加入20ml 2yt中，37℃、220rpm培养至对数期od600＝0.6-0.8。
[0062]
(2)加入洗脱的抗体库混匀，37℃放置60min。
[0063]
(3)补加入4ul amp,37℃180rpm培养60min。
[0064]
(4)向培养物中加入m13ko7(辅助噬菌体:tg1>＝10:1),37℃放置30min。
[0065]
(5)补加30ml 2yt和6ul amp，37℃180rpm培养60min。
[0066]
(6)室温5000rpm离心10min,去掉上清液，收集细菌沉淀，加入新的50ml2ytak重悬沉淀，在200ml锥形瓶中30℃220rpm过夜培养。第二天沉淀和回收，并测量扩增产物滴度。
[0067]
(7)将培养物转入100ml离心管，4℃12000rpm离心20min，上清转入新的离心管，12000rpm再次离心20min，将上清转入新的离心管。
[0068]
(8)向上清中加入1/4体积的peg/nacl，冰浴4h。
[0069]
(9)4℃12000rpm离心20min，弃去上清，再次短暂离心，除尽上清。
[0070]
(10)沉淀重悬于1ml pbs,4℃12000rpm离心10min,上清转入新离心管。
[0071]
(11)测定滴度(扩增的抗体库，梯度稀释至10e10-10e11)。
[0072]
(12)向200ul对数期tg1中加入10-9/10-10稀释度的抗体库，37℃放置30min，涂布在2ytag平板上，37℃过夜培养，第二天计算菌落数。
[0073]
2.4phage elisa
[0074]
单克隆phage上清制备
[0075]
(1)从最后一轮筛选洗脱的噬菌体库平板上挑取单菌落接种于含有300ul2ytag的96孔深孔板中，37c，700rpm培养至对数生长期；
[0076]
(2)从每个孔中吸取100ul菌液至一灭菌96孔板中，4℃保存；
[0077]
(3)加入2yt稀释的m13ko7(滴度2x10
10
，约10倍细菌浓度)100ul,37℃培养静置30min，然后37℃，600rpm培养60min。
[0078]
(4)将96孔深孔板4000rpm，离心10分钟，弃去上清，每孔加入300ul 2tyak重悬菌体，700rpm，30℃培养过夜
[0079]
单克隆phage elisa
[0080]
(5)包被靶蛋白：将生物素化靶分子用0.05％pbst液稀释至lug/ml，加入链霉亲和素酶标板中，100ul/孔，37℃混匀1h。
[0081]
(6)洗涤：弃去包被上清，拍干，0.05％pbst清洗3次，每次1min；
[0082]
(7)封闭：加入封闭液4％脱脂奶粉(pbs)300ul/孔，37℃静置1h；
[0083]
(8)洗涤：弃去封闭液，拍干，0.05％pbst清洗3次，每次1min；
[0084]
(9)phage上清结合:2％脱脂奶粉(pbs)和单克隆上清各取50ul按1:1混合，加入对应的酶标板孔中，37℃，100rpm缓摇1h；
[0085]
(10)洗涤：弃去上清，拍干，用0.1％pbst清洗5次:
[0086]
(11)二抗结合：将anti-m13-hrp抗体以1：5000稀释于封闭液1％脱脂奶粉(pbs)中，100ul/孔，加入酶标板中，37℃，100rpm缓摇1h；
[0087]
(12)洗涤：弃去液体，拍干，用0.1％pbst清洗5次；
[0088]
(13)加入100ul tmb，避光反应5～10分钟，加入100ul 2m盐酸终止反应，酶标仪中读取od450数值。
[0089]
单克隆噬菌体elisa检测结果，参见附图5所示，从中我们得到了92个与抗原蛋白(人结缔组织生长因子蛋白)特异结合的克隆。我们选择了10个附图5中标记有背景色的克隆(即，有不同a450.ag值)进行下一步的测序。
[0090]
最终获得10个对人结缔组织生长因子(ctgf)具有靶向特异性的抗原结合蛋白序列(分别记为seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和核苷酸序列(分别记为seq id no:11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，该抗原结合蛋白见重轻链序列见附图6所示。
[0091]
2.5 ctgf拮抗抗体治疗cia小鼠关节炎
[0092]
(1)单链抗体在大肠杆菌中的表达和纯化取5号噬菌体，用pcr方法扩增单链抗体dna片段,用ecor i和xho i双酶切后克隆进入表达载体pgex-6p-1，转化大肠杆菌bl21；重组菌株培养，加入iptg至终浓度为0.5mm，在30℃条件下诱导表达5h，超声破碎后，经过12000rpm/10min离心，取上清过gst柱进行纯化，用平衡缓冲液洗脱目的蛋白，获得电泳纯化单链抗体，用bca法测定蛋白质浓度。
[0093]
(2)构建cia小鼠模型：用含4mg/ml结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(cfa)与6mg/ml胶原配制的乳液，每只dba/1小鼠注射200ul进行一免。21天后，用胶原蛋白与不完全弗氏佐剂(ifa)，每只一免小鼠注射100ul进行二免。每三天进行一次关节评分，挑选出构建成功的cia小鼠模型。
[0094]
(3)用ctgf拮抗抗体与纯化小鼠igg(sigma-aldrich)200μg，每周腹腔注射dba/1构建的两组cia小鼠(每组10只)，从第22天至第43天共注射4次。与正常小鼠作比较，然后处死三组小鼠，取鼠腿，固定，脱钙，关节包埋切片，进行he染色。显微镜下观察组织形态，结果见附图7。结果显示ctgf拮抗抗体确实对cia小鼠关节炎有治疗作用。
[0095]
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

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