一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法与流程

[0001]
本发明涉及一种人生长激素的方法，更具体一点说，涉及一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法，属于基因工程技术领域。


背景技术：

[0002]
人生长激素(human growth hormone,hgh)是由脑垂体侧翼的成群排列的生长激素细胞(α细胞)分泌的一种单一肽链、非糖化的亲水性蛋白质激素,含有191个氨基酸残基，分子量为21700da，等电点为4.9。其主要作用是包括刺激骨、软骨细胞的生长和分化，以及调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现hgh还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松、心血管疾病等多种疾病。生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。现在重组人生长激素在临床上已广泛应用。
[0003]
最早的hgh(20世纪50～70年代)也称为人垂体源性生长激素，它是从刚去世的人垂体中提取出来，是临床上最早应用的生长激素。其缺点是：
①
来源受限，产量稀少；
②
纯度较低，易产生抗体；
③
易受供体病毒污染，于1985年被美国fda禁用。20世纪80年代早期：genentech公司利用大肠杆菌(e.coli)包涵体技术研制出含192氨基酸的基因重组人生长激素——met-rhgh，其缺点是：
①
提取和复性工艺复杂；
②
易受到污染；
③
与人hgh不完全一致，易产生抗体，纯度和活性较低，因此也被淘汰，20世纪80年代中期，用普通大肠杆菌基因表达技术合成含有191个氨基酸的重组人生长激素，但由于其结构与人垂体生长激素具有差异，仍易产生抗体，另外其分泌和提取过程较为复杂，易受到污染或引入杂质而导致过敏反应，20世纪80年代末期，哺乳动物细胞重组dna技术合成的含有191个氨基酸的重组人生长激素，该产品和天然的生长激素结构更为接近，但其缺点是：
①
细胞培养要求高、繁殖速度慢、收率低；
②
腺病毒污染——动物源性感染；
③
促增殖药物污染——肿瘤发生，20世纪90年代，用分泌型大肠杆菌基因表达技术合成的重组人生长激素，产物直接分泌于菌体之外。其氨基酸含量、序列和蛋白质结构与人垂体生长激素完全一致，生物活性、效价、纯度和吸收率极高，在最大限度降低治疗成本的同时确保了产品的安全性、有效性和稳定性，但是目前大肠杆菌分泌表达存在表达量不高，操作复杂，有的超低温表达对仪器设备要求较高等缺点，近年来也有利用酵母分泌表达hgh，可以大量表达hgh，但酵母表达周期长，培养基配置复杂，参数控制要求较高等缺点。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的不足，本申请提供具有可提高生长激素的表达量，hgh更易于表达，成本低廉，易于实现等技术特点的一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法。
[0005]
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006]
本发明提供一种重组人生长激素核苷酸序列，该核苷酸序列依次包含限制性酶酶切切位点1、核糖体结合位点、信号肽编码区、人生长激素编码区、限制性内切酶酶切位点2，
其中，信号肽为大肠杆菌热稳定肠毒素ⅱ信号肽编码序列seq id no：1，hgh编码序列为seq id no：2所示。
[0007]
作为优选，限制性酶酶切位点1为-xbai酶切位点，限制性内切酶酶切位点2为xhoi酶切位点，核苷酸序列为seq id no：3。
[0008]
另一方面提供一种重组表达载体，通过以下方法获得：将核苷酸序列为seq id no：3经过双酶切后插入到载体pet28a(+)相应的酶切位点上，得到pet28a-st
ⅱ-
hgh重组载体。
[0009]
另一方面提供一种表达人生长激素蛋白的工程菌，作为优选工程菌为大肠杆菌bl21，并且含有pet28a-st
ⅱ-
hgh重组表达载体。
[0010]
另一方面提供一种表达人生长激素蛋白的方法，包括以下步骤：a)将含有pet28a-st
ⅱ-
hgh重组表达载体的大肠杆菌bl21按1:100(v/v)接种；b)在37摄氏度培养3-5小时，加入iptg，25-30摄氏度诱导3-5小时；c)低温离心收集表达了人生长激素蛋白的菌体。
[0011]
作为优选，培养大肠杆菌所用培养基为lb培养基。
[0012]
作为优选，大肠杆菌于37摄氏度培养3-4小时后，28摄氏度培养半小时，加入iptg继续28度诱导3-5小时。
[0013]
另一方面提供一种纯化重组人生长激素的方法，包括以下步骤：
[0014]
1)将步骤c)所得的菌体进行超声破碎或低温冻融破碎，离心收集上清；
[0015]
2)30kd超滤管超滤，取穿透液，穿透液经5kd超滤管超滤取截留液；
[0016]
3)步骤2)获得的截留液过q离子交换柱，洗涤液洗涤得到纯化的hgh蛋白。
[0017]
有益效果：本发明利用大肠杆菌高效分泌表达人生长激素的方法存在以下优点：
[0018]
1、序列的改造，根据密码子的偏爱性，重新设计的重组人生长激素核苷酸序列，以及信号肽的核苷酸序列，使hgh更易于表达。
[0019]
2、载体的改造，通过加入核糖体结合位点可以避免昂贵限制性内切酶nco
ꢀⅰ
的使用，并且去除了pet28a(+)上不必要的多余序列，而且利用载体原来的t7启动子来启动目的基因的表达，通过以上所有改造成功实现了利用常规载体pet28a(+)实现人生长激素在大肠杆菌bl21中的高效分泌表达。
[0020]
3、显著提高生长激素的表达量，现有技术利用大肠杆菌分泌表达的人生长激素的表达量占总菌体量的百分之10-20左右，尤其利用pet28a(+)载体表达量更低，只有百分之十左右，本申请提供的方法可以达到百分之30-40。
[0021]
4、本发明提供的限制性内切酶比较廉价，载体普遍，菌种常见，诱导表达参数控制简单，所以成本低廉，易于实现，方法简单，技术人员易于掌控，便于推广。
附图说明
[0022]
图1是本发明加入iptg在37摄氏度诱导4小时收集菌体后sds-page胶电泳检测图。
[0023]
图2是本发明加入iptg在30摄氏度诱导3小时收集菌体后sds-page胶电泳检测图。
[0024]
图3是本发明加入iptg在25摄氏度诱导5小时收集菌体后sds-page胶电泳检测图。
[0025]
图4是本发明加入iptg在28摄氏度诱导4小时收集菌体后sds-page胶电泳检测图。
[0026]
其中，图1中：m-蛋白质marker，1-hgh蛋白标准品，2-诱导表达总菌体，3-诱导表达沉淀，4-诱导表达上清，5-未诱导菌体。
[0027]
图2中：1-诱导表达总菌体，2-诱导表达沉淀，3-诱导表达上清，4-蛋白质marker。
[0028]
图3中：1-蛋白质marker，2-诱导表达总菌体，3-诱导表达沉淀，4-诱导表达上清。
[0029]
图4中：1-蛋白质marker，2-诱导表达总菌体，3-诱导表达沉淀，4-诱导表达上清。
具体实施方式
[0030]
以下结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[0031]
大肠杆菌热稳定肠毒素ⅱ信号肽编码序列seq id no：1
[0032]
atgaagaaaaacatcgcgttcctgctggcgagcatgttcgtttttagcatcgcgaccaacgcgtatgcg
[0033]
hgh编码序列为seq id no：2
[0034]
ttcccgaccattccgctgagccgtctgtttgacaacgcgatgctgcgtgcgcaccgtctgcaccagctggcgttcgatacctaccaagagtttgaggaagcgtatatcccgaaggaacagaaatacagcttcctgcagaacccgcaaaccagcctgtgctttagcgagagcattccgaccccgagcaaccgtgaggaaacccagcaaaagagcaacctggagctgctgcgtatcagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcaattcctgcgtagcgtttttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgacagcaacgtttacgacctgctgaaggatctggaggaaggtatccagaccctgatgggtcgtctggaagacggcagcccgcgtaccggtcagattttcaagcaaacctacagcaaatttgataccaacagccacaacgacgatgcgctgctgaaaaactacggcctgctgtattgcttccgtaaggacatggataaagtggagacctttctgcgtattgtgcaatgccgtagcgttgaaggtagctgcggcttttaa
[0035]
加入酶切位点核糖体结合位点的全序列seq id no：3
[0036]
tctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaagaaaaacatcgcgttcctgctggcgagcatgttcgtttttagcatcgcgaccaacgcgtatgcgttcccgaccattccgctgagccgtctgtttgacaacgcgatgctgcgtgcgcaccgtctgcaccagctggcgttcgatacctaccaagagtttgaggaagcgtatatcccgaaggaacagaaatacagcttcctgcagaacccgcaaaccagcctgtgctttagcgagagcattccgaccccgagcaaccgtgaggaaacccagcaaaagagcaacctggagctgctgcgtatcagcctgctgctgattcagagctggctggaaccggtgcaattcctgcgtagcgtttttgcgaacagcctggtgtatggcgcgagcgacagcaacgtttacgacctgctgaaggatctggaggaaggtatccagaccctgatgggtcgtctggaagacggcagcccgcgtaccggtcagattttcaagcaaacctacagcaaatttgataccaacagccacaacgacgatgcgctgctgaaaaactacggcctgctgtattgcttccgtaaggacatggataaagtggagacctttctgcgtattgtgcaatgccgtagcgttgaaggtagctgcggcttttaactcgag
[0037]
编码的stii-hgh氨基酸序列：
[0038]
mkkniafllasmfvfsiatnayafptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkdleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf
[0039]
获取大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列以及hgh的编码序列：
[0040]
根据已知的hgh的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，设计大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列seq id no：2以及hgh的编码序列seq id no：1。
[0041]
设计序列限制性内切酶切位点1(优选xba i)-核糖体结合位点-大肠杆菌耐热肠毒素信号肽的编码序列-hgh的编码序列-限制性内切酶酶切位点2(优选xho i)，序列如seq id no：3所示，该序列由人工合成，序列seq id no：3编码的氨基酸序列为seq id no：4。
[0042]
pet28a-hgh重组质粒工程菌的获得：
[0043]
将seq id no：3序列和pet28a(+)经xba
ꢀⅰ
和xho
ꢀⅰ
双酶切后，用t4dna连接酶连接，连接产物为pet28a-hgh重组质粒，该重组质粒去掉了pet28a(+)连上的his标签，以及核糖体集合位点后面不必要的多余序列，可以高效表达信号肽-hgh的蛋白序列，信号肽切除后可以得到和天然人生长激素蛋白完全一样的氨基酸序列，将pet28a-hgh重组质粒转化大肠杆菌bl21，在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的lb平板上挑选阳性克隆并进行质粒xba
ꢀⅰ
和xho
ꢀⅰ
双酶切鉴定，以及测序鉴定，经鉴定克隆成功，成功获得含有pet28a-hgh重组质粒的bl21工程菌bl21-pet28a-hgh，所用培养基为lb培养基。
[0044]
重组人生长激素的诱导表达：
[0045]
将工程菌bl21-pet28a-hgh 37摄氏度培养4小时，加入iptg，iptg终浓度为1mm，诱导4小时，收集菌体，sds-page胶电泳检测，结果没有目的基因表达，如图1所示；
[0046]
将工程菌bl21-pet28a-hgh 37摄氏度培养4小时，加入iptg，iptg终浓度为1mm，30摄氏度诱导3小时，sds-page胶电泳检测，结果目的基因在上清和沉淀中均有表达，表达量可以达到40％以上，如图2所示；
[0047]
将工程菌bl21-pet28a-hgh 37摄氏度培养3小时，加入iptg，iptg终浓度为1mm，25摄氏度诱导5小时，收集菌体，sds-page胶电泳检测，结果没有目的基因在上清和沉淀中均有表达，如图3所示；
[0048]
将工程菌bl21-pet28a-hgh 37摄氏度培养3小时，加入iptg，iptg终浓度为1mm，28摄氏度诱导4小时，收集菌体，sds-page胶电泳检测，结果没有目的基因在上清和沉淀中均有表达，上清表达量明显增加，表达量可以达到总菌体的40％左右，如图4所示；
[0049]
以上重组人生长激素的诱导表达中工程菌接种体积比为1:100。
[0050]
关于iptg终浓度的优化，在培养诱导条件不变的前提下，分别加入终浓度为0.5mm、0.8mm和1mm的iptg，结果显示1mmiptg诱导表达效果最佳。人生长激素蛋白的纯化：
[0051]
配制pbs(ph7.4，20mm)，a液：tris
·
hcl(ph9.0，20mm)，洗涤液：200mmnacl的a液，洗脱液：500mmnacl的a液，再生液：2mnacl的a液。
[0052]
步骤1)收集菌体，将诱导表达的工程菌bl21-pet28a-hgh在4℃下8000rpm离心10min，收集菌体沉淀；
[0053]
步骤2)菌体破碎：
[0054]
将菌体沉淀按体积比1:5-10加入pbs(ph7.4，20mm)混匀，-80℃速冻过夜后室温缓慢融化，再-80℃冷冻24h后室温缓慢融化，重复一次。12000rpm离心20-30min，得上清；
[0055]
另外一种菌体破碎方法，将菌体沉淀按体积比1:10加入pbs(ph7.4，20mm)混匀，冰浴超声破碎(2s超声，5s间歇)10-20min，12000rpm/min离心20min，的上清。
[0056]
步骤3)超滤：
[0057]
使用millipore超滤器，超滤膜截流分子量为5-10kd，取截留液(作用是去除小分子杂质和盐类)，取截留液，加入5-20(优选10)倍体积的tris
·
hcl(ph9.0，20mm)稀释，30kd超滤膜超滤，取穿透液准备过离子交换柱。
[0058]
步骤4)层析：
[0059]
所用层析柱为q离子交换柱
[0060]
将步骤3)得到的穿透液上样，室温轻摇孵育3-5min，静置1min；用2-3倍体积的洗
涤液进行洗涤，2倍体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。sds-page检测，结果显示纯化的人生长激素蛋白纯度可以达到95％以上。
[0061]
柱子用再生液再生，洗脱液经5kd超滤膜去离子浓缩，经质谱检测为r人生长激素蛋白。
[0062]
一种重组人生长激素核苷酸序列，所述核苷酸序列依次包含限制性酶酶切切位点1、核糖体结合位点、信号肽编码区、人生长激素编码区hgh、限制性内切酶酶切位点2，其中，信号肽为大肠杆菌热稳定肠毒素ⅱ信号肽编码序列seq id no：1，人生长激素编码区hgh编码序列为seq id no：2。
[0063]
作为一种改进的实施例方式，所述限制性酶酶切位点1为-xba i酶切位点，所述限制性内切酶酶切位点2为xho i酶切位点，重组人生长激素核苷酸序列为seq id no：3。
[0064]
一种含有重组人生长激素核苷酸序列的重组表达载体，重组表达载体含有重组人生长激素核苷酸序列，通过将所述重组人生长激素氨基酸序列经过双酶切后插入到载体pet28a(+)获得重组表达载体。
[0065]
一种含有所述的重组表达载体表达人生长激素蛋白的工程菌，所述工程菌为含有重组表达载体的大肠杆菌bl21。
[0066]
一种利用所述的工程菌表达人生长激素蛋白的方法，表达方法包括以下步骤：a)将工程菌按1:100(v/v)接种；b)置于37摄氏度条件下培养3-5小时，加入iptg，在25-30摄氏度条件下诱导3-5小时；c)低温离心收集表达了人生长激素蛋白的菌体。
[0067]
作为一种改进的实施例方式，培养大肠杆菌所用培养基为lb培养基。
[0068]
作为一种改进的实施例方式，在37摄氏度培养3-4小时后，然后加入iptg继续28摄氏度诱导3-5小时。
[0069]
一种利用所述的人生长激素蛋白的菌体纯化重组人生长激素的方法，包括以下步骤：
[0070]
1)将步骤c)所得的菌体进行超声破碎或低温冻融破碎，离心收集上清；
[0071]
2)30kd超滤管超滤，取穿透液，穿透液经5kd超滤管超滤取截留液；
[0072]
3)将步骤2)获得的截留液过q离子交换柱，洗涤液洗涤得到纯化的hgh蛋白。
[0073]
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

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