一种用于鉴定龙须菜性别的引物及鉴定方法与流程

[0001]
本发明涉及一种引物，特别是一种用于鉴定龙须菜性别的引物，本发明还涉及利用前述引用进行鉴定龙须菜性别鉴定的方法。


背景技术：

[0002]
作为红藻门产琼胶海藻，龙须菜具有重要的经济价值、食用价值、药用价值和生态价值。作为重要栽培藻类，龙须菜产业可追溯到上个世纪50年代，在我国山东、江苏、福建、浙江、大连、广东等地陆续开展。1988年龙须菜南移栽培取得成果，极大促进产业的发展，尤其是龙须菜遗传育种工作的突破，国家良种龙须菜“981”、“2007”和“鲁龙1号”相继培养而出。2003年，龙须菜产业已明显形成规模，其栽培面积和产量等数据收录至《中国渔业统计年鉴》。《2020中国渔业统计年鉴》数据显示：截止至2019年，全国龙须菜栽培规模高达9388公顷，栽培产量348,085吨，成为继海带之后我国第二大栽培藻类。
[0003]
龙须菜生活史中具有三个不同的世代，其中单倍体世代包含雌配子体和雄配子体，雌雄配子体外观形态高度形似，在性成熟之前无法通过形态辨别。传统的方法采用随机杂交的方式，将疑似的龙须菜雌雄配子体两两装进一个三角瓶中，持续培养2-3个月，待一株长出囊果时，可根据囊果的有无区分雌雄配子体；如若体系中无囊果的产生，则继续重复实验。该方法具有一定随机性和偶然性，用时长、效率低，给龙须菜遗传育种工作和采孢子育苗工作带了较大挑战。因此，急需一种能够方便有效的对龙须菜雌雄配子体进行性别鉴定的方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的用于鉴定龙须菜性别的引物，通过pcr可在龙须菜雌配子中稳定扩增出一条特异的核苷酸片段，将其与雄配子体区分开来。
[0005]
本发明所要解决的别一种技术问题是提供鉴定龙须菜性别的方法，该方法具有稳定性高、效率高、速度快、准确度高等特点，解决了龙须菜在遗传育种和人工苗种繁育过程中雌雄配子体鉴别困难、用时长、准确率低、效率低的问题。
[0006]
1、本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于鉴定龙须菜性别的引物，其特点是：所述的引用为seqidno.1和seqidno.2；其序列如下：。
[0007]
本发明还公开了一种采用以上技术方案所述的引物进行龙须菜性别鉴定的方法，其特点是，其步骤如下：s1、提取龙须菜单倍体的dna；
s2、以步骤s1中提取的dna为模板，使用引物seqidno.1和seqidno.2进行pcr扩增；s3、pcr产物进行琼脂糖检测，根据条带的有无差异，判断龙须菜单倍体的性别。
[0008]
优选的步骤（1）的具体方法如下：采用离心柱型植物基因组dna试剂盒法，提取龙须菜总dna，步骤为：称取0.05~0.10 g新鲜材料，液氮研磨后，转移至预装装有700 μl且含0.1% β-巯基乙醇的预热裂解缓冲液的离心管，混匀后65 ℃水浴30 min，待裂解完成，加入700 μl氯仿抽提，12,000 *g离心5~10 min，收集上层液加入700 μl的抽提缓冲液，混匀后转移至dna吸附柱中，12,000 *g离心1 min，去废液；向吸附柱中移入500 μl含乙醇的gd缓冲液，12,000 *g离心1 min，去废液；向吸附柱中加入600 μl含乙醇的漂洗液，12,000 *g离心1 min，去废液；重复一漂洗，去废液，12,000 *g离心2 min，室温放置至酒精完全挥发后，转入干净的ep管内；向吸附柱内悬空滴加100 μl的te洗脱缓冲液，静置5 min，12,000 *g离心2 min，-20 ℃保存离心洗脱液，即为龙须菜总的dna。
[0009]
优选的步骤（2）的具体方法如下：利用引物seqidno.1和seqidno.2，对已知性别的龙须菜雌雄配子体基因组和龙须菜四分孢子体空白对照进行扩增；反应体系：taq dna polymerase
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0.1
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l；10
×ꢀ
taq buffer with kcl
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l；25 mmmgcl
2 ꢀ
1.2
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l；dntp mix
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l；10
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m seqidno.1
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l；10
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m seqidno.2
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l；dna
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l；加ddh2o至总体系20
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l；反应条件为： 94 ℃ 10min；94 ℃ 30s，63 ℃ 30s，72 ℃ 1min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。
[0010]
优选的步骤（3）的具体方法如下：取4 μl pcr扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳30 min，通过凝胶成像仪记录结果；电泳结果中，有条带且条带大小为1000bp表示个体性别为雌性；无条带表示此个体性别为雄性。
[0011]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明获得两条特异核苷酸序列作引物，可以快速而准确地鉴定龙须菜雌雄配子体，具有稳定性高、效率高、速度快、准确度高等特点，解决了龙须菜在遗传育种和人工苗种繁育过程中雌雄配子体鉴别困难、用时长、准确率低、效率低的问题。
附图说明
[0012]
图1为引物有效性实验结果图，图1中：1~3为龙须菜雌性配子体；4~6为龙须菜雄性配子体；7~12为龙须菜四分孢子体（对照：二倍体）；marker从上到下大小依次为：2000、1000、750、500、250、100 bp；图2为重复性验证实验和性别判定图，图2中：左侧1~8为龙须菜雌性配子体；9号为pcr阴性对照；右侧1~6为龙须菜雄性配子体；marker从上到下大小依次为：2000、1000、750、500、250、100 bp。
具体实施方式
[0013]
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0014]
实施例1，用于鉴定龙须菜性别的引物及鉴定方法实验：1. 基因组dna提取采用离心柱型植物基因组dna试剂盒法，提取龙须菜总dna，步骤为：称取0.05~0.10 g新鲜材料，液氮研磨后，转移至离心管（预装装有700 μl且含0.1% β-巯基乙醇的预热裂解缓冲液），混匀后65 ℃水浴30 min，待裂解完成，加入700 μl氯仿抽提，12,000 *g离心5~10 min，收集上层液加入700 μl的抽提缓冲液，混匀后转移至dna吸附柱中，12,000 *g离心1 min，去废液；向吸附柱中移入500 μl含乙醇的gd缓冲液，12,000 *g离心1 min，去废液；向吸附柱中加入600 μl含乙醇的漂洗液，12,000 *g离心1 min，去废液；重复一漂洗，去废液，12,000 *g离心2 min，室温放置至酒精完全挥发后，转入干净的ep管内；向吸附柱内悬空滴加100 μl的te洗脱缓冲液，静置5 min，12,000 *g离心2 min，-20 ℃保存离心洗脱液，即为龙须菜总的dna。
[0015]
引物有效性实验引物seqidno.1和seqidno.2如表1所示，表1 龙须菜性别鉴定引物序列利用引物seqidno.1和seqidno.2对已知性别的龙须菜雌雄配子体基因组和空白对照（龙须菜四分孢子体）进行扩增。反应体系：taq dna polymerase (fermentas mbi: 5 u
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l-1) 0.1
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l；10
×ꢀ
taq buffer with kcl 2
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l；mgcl
2 (25 mm)
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1.2
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l；dntp mix (2 mm)
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l；seqidno.1 (10
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m)
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l；seqidno.2 (10
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m) 1
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l；dna
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l；加ddh2o至总体系20
ꢀµ
l。反应条件为： 94 ℃ 10min；94 ℃ 30s，63 ℃ 30s，72 ℃ 1min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。
[0016]
取4 μl pcr扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳30 min，通过凝胶成像仪记录结果。电泳结果中，有条带且条带大小约为1000bp表示个体性别为雌性；无条带表示此个体性别为雄性。
[0017]
结果显示：雌雄均具有条带且条带大小约为1000bp；雄性均没有条带，如图1所示。该方法所用引物有效，且方法可行。
[0018]
3. 目的条带的回收与测序3.1 目的片段琼脂糖凝胶回收选用200
ꢀµ
l的pcr产物体系，经琼脂糖凝胶电泳和显色后，进行目的条带的切割，置入一个新的1.5ml离心管中，最后根据“离心柱型普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒”（天根生化科技有限公司，北京）说明，进行琼脂糖凝胶回收。
[0019]
3.2 目的片段的连接和转化
制备大肠杆菌dh5α感受态细胞制备，根据pmd
™
19-t vector说明书，进行目的片段的连接。将完成连接的感受态细胞混匀，放入预加热至42℃水浴锅中，热激90s（勿摇）后转移至冰上冷却5 min；加入不含amp的lb液体培养基400 μl，37 ℃恒温培养40 min，转速100 rpm；取出100 μl菌液，在含amp的琼脂板固体培养基上涂布，37℃恒温培养14 hour，挑取单菌落。
[0020]
3.3 阳性克隆的检测及测序随机挑取10个单克隆，放入1.5ml含amp的1ml lb液体培养基的离心管中，37℃恒温100 rpm培养6 h，将过夜后的菌液通过如下体系（20μl）进行阳性检测：反应体系：taq dna polymerase (fermentas mbi: 5 u
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l-1)
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0.1
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l；10
×ꢀ
taq buffer with kcl
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l；mgcl
2 (25 mm)
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1.2
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l；dntp mix (2 mm)
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l；primer 1 (10
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m)
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l；primer 2 (10
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m)
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l；dna
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l；加ddh2o至总体系20
ꢀµ
l。反应条件为： 94 ℃ 10min；94 ℃ 30s，63 ℃ 30s，72 ℃ 1min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。产物4 ℃保存。
[0021]
pcr产物经1.5%琼脂糖电泳，dl2000 dna marker作为标准标定，根据电泳结果情况，送测阳性克隆菌液，测序及拼接由北京六合华大基因科技有限公司完成。
[0022]
结果显示：具有特异性的目的条带，经测序显示序列大小为969 bp，如表2中seqidno.3所示：表2 龙须菜性别鉴定的特异性片段碱基序列4. 重复性验证实验和性别判定对已知性别（8雌6雄）的样本进行pcr扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果中，有条带且条带大小约为1000bp表示个体性别为雌性；无条带表示此个体性别为雄性。结果显示：8个龙须菜雌配子体具有条带；6个龙须菜雄配子无条带，如图2所示。

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