高粱耐盐碱胁迫基因、检测引物组和试剂盒及应用的制作方法

[0001]
本发明属于基因检测和功能研究技术领域，具体涉及高粱耐盐碱胁迫基因、检测引物组和试剂盒及应用。


背景技术：

[0002]
高粱(sorghum bicolor(l.)moench)是全球第五大禾谷类作物，是一种重要的粮食、饲料、能源等多功能c4作物，光合作用效率高，生物产量大，同时高粱抗旱性强、耐盐碱、产量高、适应性广，适合我国中低产田开发利用，尤其是我国高粱多种植在一些种植条件不良的地区，如干旱、半干旱、低洼易涝和盐碱地、土壤贫瘠山区和半山区种植。这就导致高粱产量降低，目前为解决这一困境，多利用生物有机肥或其他的一些土壤改良手段来提高土壤的营养含量和改造为宜种环境，但效果并不显著。
[0003]
随着高粱基因组测序的完成，覆盖高粱全基因组的高密度遗传连锁图谱构建也日趋完善，基因功能鉴定以及遗传转化的研究亦取得了长足的进展。这对于高粱抗逆品种资源开发利用、抗性机制的研究、重要性状基因的克隆、分子标记辅助选择育种奠定了基础。但是依然鲜有关于高粱耐盐碱胁迫能力相关性状和基因的研究。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一个高粱耐盐碱胁迫基因，所述基因参与并提高高粱对盐碱胁迫的耐受性，在耐盐碱胁迫高粱品种和不耐盐碱胁迫高粱品种中，所述基因特异性差异表达，可利用所述基因进行耐盐碱胁迫高粱新品种或种质的选育和改良。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一个高粱耐盐碱胁迫基因，所述基因的cdna序列如seq id no.1所示。
[0007]
本发明还提供了一组检测高粱耐盐碱胁迫基因的引物组，所述引物组包括引物f和引物r，所述引物f的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述引物r的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0008]
本发明还提供了一种检测高粱耐盐碱胁迫性状的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物组和内参基因。
[0009]
优选的，所述内参基因包括gapdh和/或actin；所述gapdh包括gapdh-f和gapdh-r，所述gapdh-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述gapdh-r的核苷酸序列如seq id no.5所示；
[0010]
所述actin包括actin-f和actin-r，所述actin-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述actin-r的核苷酸序列如seq id no.7所示。
[0011]
本发明还提供了一种检测高粱耐盐碱胁迫性状的方法，包括以下步骤：分别以所述试剂盒中的引物组和内参基因为引物，以高粱rna反转录后得到的第一链cdna为模板，进行qrt-pcr。
[0012]
优选的，所述高粱rna提取自高粱叶片。
[0013]
优选的，所述qrt-pcr的体系以20μl计，包括：f引物0.4μl，r引物0.4μl，2
×
transstart top green qpcr supermix 10μl，模板2μl和余量的ddh2o。
[0014]
优选的，所述qrt-pcr的程序包括：94℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸10s，45个循环。
[0015]
本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒在筛选耐盐碱胁迫高粱种质中的应用。
[0016]
本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒在选育耐盐碱胁迫高粱新品种中的应用。
[0017]
本发明提供了一个高粱耐盐碱胁迫基因，所述基因直接参与并提高高粱对盐碱胁迫的耐受性，在耐盐碱胁迫高粱品种和不耐盐碱胁迫高粱品种中，所述基因特异性表达，表达量呈现极显著差异，可依据所述基因在不同高粱品种中的表达量判断高粱对于盐碱胁迫的耐受性，所以可将所述基因用于检测高粱的耐盐碱胁迫性状和选育耐盐碱胁迫高粱新品种和种质。
附图说明
[0018]
图1为参考基因组内xm_021462231.1基因的特异性表达图；
[0019]
图2为利用qrt-pcr验证xm_021462231.1基因的特异性表达图。
具体实施方式
[0020]
本发明提供了一个高粱耐盐碱胁迫基因，所述基因的cdna序列如seq id no.1所示。本发明所述基因的全长序列已上传ncbi，genbank登录号为xm_021462231.1。
[0021]
本发明还提供了一组检测高粱耐盐碱胁迫基因的引物组，所述引物组包括引物f和引物r，所述引物f的核苷酸序列如seq id no.2所示：gaacgagttctccgtcgagc，所述引物r的核苷酸序列如seq id no.3所示：agtggaaatcggtggtggtc。
[0022]
本发明还提供了一种检测高粱耐盐碱胁迫性状的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物组和内参基因。
[0023]
本发明所述内参基因优选包括gapdh和/或actin；所述gapdh包括gapdh-f和gapdh-r，所述gapdh-f的核苷酸序列优选如seq id no.4所示：tcactgctacccaaaagacg，所述gapdh-r的核苷酸序列如seq id no.5所示：agacatcaacggtaggaacac。
[0024]
本发明所述actin包括actin-f和actin-r，所述actin-f的核苷酸序列优选如seq id no.6所示：gggacataaaggagaagctcg，所述actin-r的核苷酸序列优选如seq id no.7所示：acaagagatggctggaacag。
[0025]
本发明所述试剂盒中优选还包括2
×
transstart top green qpcr supermix和ddh2o。
[0026]
本发明所述试剂盒中的引物组和内参基因的使用浓度优选为10μm。
[0027]
本发明还提供了一种检测高粱耐盐碱胁迫性状的方法，包括以下步骤：分别以所述试剂盒中的引物组和内参基因为引物，以高粱rna反转录后得到的第一链cdna为模板，进行qrt-pcr。
[0028]
在本发明中，所述高粱rna优选提取自高粱叶片，本发明对从所述高粱叶片中提取
rna的方法并没有特殊限定，优选利用trizol法提取。
[0029]
本发明所述qrt-pcr的体系以20μl计，优选包括：f引物0.4μl，r引物0.4μl，2
×
transstart top green qpcr supermix 10μl，模板2μl和余量的ddh2o。本发明所述qrt-pcr的程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸10s，45个循环。
[0030]
在本发明中，当利用所述引物组测得的表达量是内参基因表达量的3倍以上时，可认为具有耐盐碱胁迫性状。
[0031]
本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒在筛选耐盐碱胁迫高粱种质中的应用。本发明在所述应用中，所述引物组或所述试剂盒在筛选耐盐碱胁迫高粱种质中的方法优选与上述方法相同，在此不再赘述。
[0032]
本发明还提供了所述引物组或所述试剂盒在选育耐盐碱胁迫高粱新品种中的应用。本发明在所述应用中，所述引物组或所述试剂盒在选育耐盐碱胁迫高粱新品种中的方法优选与上述方法相同，在此不再赘述。
[0033]
下面结合实施例对本发明提供的高粱耐盐碱胁迫基因、检测引物组和试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0034]
实施例1
[0035]
1.1试验材料及处理方法：选用感盐品种l甜和耐盐品种石红137(在文章中公开wang h l.chen g l,zhang h w,liu b,yang y b,guan y a.identification of qtls for salt tolerance at germination and seedling stage of sorghum bicolor l.moench.euphytica,2014,196:117-127；在文章中分别标记为l-tian和shihong137)为供试材料。试验材料选取水培方式种植，种子消毒后摆放在培养盒中，在28℃长日照(16h/8h)条件下培养。待长至一叶一心，用hoagland培养液代替水进行培养。在三叶一心期利用2％nacl(m/m)溶液进行盐胁迫处理，处理时间分别为0(对照)、1和24h，每个处理3次重复。处理结束之后将叶片迅速剪下放入液氮中冷冻，样品放于-80℃贮存，并送到百迈客生物科技有限公司进行转录组分析。
[0036]
1.2cdna文库的构建及转录组测序：样品rna由百迈客生物科技有限公司制备。rna样品通过质量检测进入illumina hiseq 2000平台进行转录组测序。下机所得原始数据(raw data)经过过滤得到纯净数据(clean data)，纯净数据再与指定参考基因组(sbicolor_v2.1)比较得到比对数据(mapped data)。
[0037]
1.3差异基因的筛选：将样品处理两两比较得到差异基因。在差异表达基因检测过程中，将fold change≥2且fdr＜0.001作为筛选标准。差异倍数(fold change)表示两样品(组)间表达量的比值。错误发现率(false discovery rate，fdr)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到。采用了公认的benjamini-hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用fdr作为差异表达基因筛选的关键指标。
[0038]
结果如图1和表1所示，无论在抗、感品种中，在盐胁迫处理24h后，表达量都出现差异极显著升高，尤其是在感品种中，在处理1h后即出现极显著差异表达，可将xm_021462231.1基因作为耐盐碱胁迫的备选基因。
[0039]
表1 盐胁迫处理条件下基因在抗、感品种中表达量的变化
[0040]
xm_021462231.1感抗ck0.0812.1
1h1.417.224h11.258.7
[0041]
实施例2
[0042]
2.1 cdna获得：取1μg实施例1中提取得到的总rna使用transscript ii all-in-one first-strand cdna synthesis supermix for qpcr(one-step gdna removal)反转录试剂盒反转录成cdna，反转录反应体系如表2所示，
[0043]
表2 反转录体系
[0044][0045]
反转录条件：55℃30min，85℃5s，反应结束后加入80μl rnase-free water稀释cdna。
[0046]
2.2利用表3中所示的引物进行qrt-pcr检测，引物如表3所示，
[0047]
表3 引物名称和序列
[0048][0049][0050]
2.3使用实时荧光定量pcr仪检测18个样品，每个基因在每个样品中设置三次技术重复；qpcr反应体系如表4所示，
[0051]
表4 qpcr反应体系
[0052]
[0053]
pcr反应条件如下：94℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸10s，45个循环。
[0054]
统计被测基因(含2个内参)在待测样品中的ct值，结果如表5和图2所示，在盐胁迫条件下，自处理1h开始，耐盐胁迫品种的xm_021462231.1基因表达量显著高于不耐盐胁迫品种，且该基因参与并提高高粱对盐碱胁迫的耐受性。
[0055]
表5 盐胁迫下基因在抗、感品种中表达量的变化
[0056]
xm_021462231.1感抗ck001h0.322.6224h11.46231.34
[0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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