一种单个细胞提取方法与流程

[0001]
本发明涉及一种生物医疗检测，尤其是涉及一种单个细胞提取方法。


背景技术：

[0002]
目前，对标定组织细胞的提取大多采用的是激光切割法，即先将组织细胞涂覆到载玻片上，然后将细胞膜层烘干，最后利用激光切割出所需要的标定目标。这种方法得到的细胞提取液不仅杂质多，而且在对细胞膜烘烤的过程中存在将活细胞破坏的情况，因此，需要研究出一种可精确提取标记细胞的提取方法，以提高细胞提取液的纯度。


技术实现要素：

[0003]
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种单个细胞提取方法，从而减少细胞提取液的杂质，更利于后续的检测分析。
[0004]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种单个细胞提取方法，包括如下步骤：
[0005]
将带有标记细胞的细胞溶液滴入细胞分离芯片上，细胞溶液在细胞分离芯片上自动平铺，形成溶液膜；
[0006]
定位目标细胞；
[0007]
在控制系统的控制下，细胞分离枪头运行到目标位置，并吸取出目标细胞。
[0008]
于本发明一实施例中，还包括步骤：控制系统控制细胞分离枪头定位到某一目标细胞，吸取对应的目标细胞，然后将所吸取的目标细胞释放出；再次通过控制系统将细胞分离枪头定位到另一目标细胞，吸取对应的目标细胞，并将所吸取的目标细胞释放出；如此循环，直至达到提取要求。
[0009]
于本发明一实施例中，采用荧光标记法对细胞进行标记。
[0010]
于本发明一实施例中，在荧光系统的作用下，被标记的细胞呈现荧光，从而实现对细胞的定位。
[0011]
于本发明一实施例中，所述细胞分离芯片上设有溶液膜形成区，所述溶液膜形成区凹向所述细胞分离芯片，所述细胞溶液在溶液膜形成区自动平铺成一层细胞溶液膜。
[0012]
于本发明一实施例中，所述细胞分离芯片上还设有边缘区，所述边缘区连续地围绕在所述溶液膜形成区的四周，所述溶液膜形成区设有细胞凹槽，所述细胞凹槽由若干个紧密排布的细胞锚槽组成，平铺后的细胞溶液膜中的细胞被铺展到单个的细胞锚槽中。
[0013]
于本发明一实施例中，所述细胞分离枪头上设有一压力腔，通过改变压力腔内的气压实现将目标细胞吸取到细胞分离枪头的毛细管中。改变压力腔内外的压强具体实现方式是：先通过外力挤压所述压力腔的腔壁，使所述腔壁变形，挤压出所述压力腔中的部分空气，然后释放外力。
[0014]
于本发明一实施例中，所述细胞分离枪头包括：
[0015]
固定架；
[0016]
压力管，与固定架固定连接，所述压力管的一端开口；
[0017]
毛细管，与所述压力管密封固定连接，所述毛细管与所述压力管相连通；
[0018]
管套，密封套在所述压力管上、并与所述压力管之间形成一压力腔；以及
[0019]
压力机构，与所述管套相配合以改变所述压力腔内的气压。
[0020]
于本发明一实施例中，所述压力管一端开口，另一端与所述毛细管相接，所述管套密封套在所述压力管开口的一端，所述毛细管经疏水处理。
[0021]
于本发明一实施例中，所述压力机构包括压架和凸压头，所述压架与凸压头之间固定连接，所述压架安装在所述固定架上，所述凸压头位于所述管套的上方。
[0022]
本技术方案具有以下有益效果：
[0023]
本发明通过将带有标记细胞的细胞溶液在细胞分离芯片上铺展成膜，使细胞溶液中的细胞可独自分散在细胞分离芯片上的细胞锚槽中，从而使提取单个细胞变成可能；进一步在荧光系统下可清楚准确地找到标记细胞，并在控制系统的作用下通过细胞分离枪头将目标标记细胞分别提取出，得到高纯度的细胞提取液。该提取方法提取精度高，安全高效，不会损害细胞的活性。
附图说明
[0024]
图1是本发明一实施例中细胞分离枪头的结构示意图；
[0025]
图2是本发明一实施例中细胞分离芯片的结构示意图；
[0026]
图3是本发明图2中a处的放大图；
[0027]
图4是本发明一实施例中细胞分离芯片的截面示意图；
[0028]
图5是本发明图4中b处的放大图。
[0029]
附图标记说明：固定架1，压力管2，毛细管3，管套4，压力弹片5，凸压头6，螺钉7，硅基片8，溶液膜形成区81，边缘区82，细胞锚槽9，压力腔10。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例及附图1至5对本发明作进一步描述。
[0031]
本发明所涉及的细胞提取系统包括硬件设备数字pcr细胞分离芯片(以下简称“细胞分离芯片”或“芯片”)和数字pcr细胞分离枪头(以下简称“细胞分离枪头”或“枪头”)以及控制系统，控制系统用于控制将枪头定位到目标细胞，并通过枪头将目标细胞提取出来。具体实现提取单个细胞的方法是：先将带有标记细胞的细胞溶液滴入细胞分离芯片上，细胞溶液在细胞分离芯片上自动平铺，形成溶液膜；然后在荧光系统中定位目标细胞，最后在控制系统的控制下，细胞分离枪头运行到特定位置吸取目标细胞。从而得到杂质更少的细胞提取液，更有利于后续的检测分析。
[0032]
如图1所示，所述细胞分离枪头包括固定架1、压力管2、毛细管3、管套4以及压力机构，压力管2、毛细管3和管套4三者连接在一起并固定在所述固定架1上，所述压力机构也安装在固定架1上。
[0033]
所述压力管2一端开口、另一端密闭，所述压力管2开口的一端套有密封管套4，从而密封管套4和压力管2之间形成一压力腔10。所述管套4为具有密封性能且可发生变形的材质，因此，所述压力腔10会因套管的变形而发生体积的变化。在外力的作用下，管套4产生
形变，所述压力腔10的体积变小，即所述压力腔10中的空气会被挤出一部分；当外力消失时，管套4的弹性变形会消失，所述压力腔10的体积回复到初始大小。本实施例中，所述管套4为硅胶密封圈。
[0034]
所述压力管2的另一端密封安装有一毛细管3，所述毛细管3为一极细的两端开口的管子，所述毛细管3与所述压力管2内部中空部分相连通，即所述毛细管3的一端与所述压力腔10相连通，两者构成连通器。进而可以理解为，当压力腔10受到挤压时，压力腔10中的空气会通过毛细管3排出，当外力消失时，所述压力腔10会恢复到初始状态，这时所述压力腔10中的气压低于大气压，大气压就会将位于毛细管3管口处的细胞液压到毛细管3中，换言之，当外力消失时，枪头就会将目标细胞吸到所述毛细管3中，从而实现对目标标记细胞的提取。
[0035]
使所述管套4产生变形的是所述压力机构。所述压力机构包括压架和凸压头6，所述凸压头6与压架之间固定连接，所述压架的一端通过螺钉7固定安装在所述固定架1上。所述压架为压力弹片55，所述压力弹片5在外力消失时可自动回弹。所述凸压头6设置在所述压力弹片5的另一端。所述凸压头6设置在管套4的上方，可通过凸压头6对管套4施加压力从而使其变形，进而使位于管套4下的所述压力腔10受到挤压。所述控制系统控制外力施加到所述压力弹片5上，所述压力弹片5变形使凸压头6抵压到所述管套4上，外力通过凸压头6传递至所述管套4上，管套4受到挤压而变形，从而压力腔10中的空气被排出。
[0036]
所述凸压头6用于接触管套4的端部为圆弧形，从而可以将对所述管套4的挤压损害降到最低。根据需要，通过控制凸压头6的下压程度，可控制管套4的变形量，从而控制压力腔10中空气的排出量。所述压力弹片5靠近所述管套4的部分平行位于所述管套4的上方，形成悬臂，根据外部压力的大小悬臂下弯的角度不同，从而管套4的变形量不同。本实施中，所述凸压头6的圆弧端与所述压力管2的管口相配合，在外部压力的作用下，所述压力弹片5下弯，凸压头6正好压在所述压力管2开口处的管套4上，从而使得所述管套4顺利实现弹性形变，在外部压力消失后，压力弹片5上抬，管套4回复到原来形状。本实施例中，所压力弹片5上设置有弧形弯曲，所述弧形弯曲为了减小压力弹片5在下弯和上弹的过程中的内应力，提高压力弹片5的使用性能。
[0037]
施加到管套4上的外力是由控制系统控制的，通过压力机构与所述管套4之间的配合以改变所述压力腔10内的气压，使所述压力腔10内外形成气压差，从而在外力消除时将位于毛细管3管口的细胞液吸到所述毛细管3中。改变压力腔10内外的压强具体实现方式是：先通过外力挤压所述压力腔10的腔壁——管套4，使所述腔壁变形，挤压出所述压力腔10中的部分空气，然后释放外力，当外力消失时，腔壁的变形消失，压力腔10恢复原始状态，此时，压力腔10中的气压就会变得低于大气压，大气压就把位于毛细管3管口的目标细胞液压入毛细管3中，实现对单个目标细胞的提取。
[0038]
所述压力管2和毛细管3的材质为不锈钢或石英，所述毛细管3的内径为1-50μm。为了避免在吸取目标细胞液的时候出现虹吸现象，需要对所述毛细管3的内外表面进行疏水处理，具体方式可在所述毛细管3的内外表面均涂覆有疏水涂层，从而消除虹吸现象，在毛细管3内外压力差的情况下，只允许毛细管3管口所指向的细胞物质被吸进毛细管3，也就是尽可能少的吸取除标记细胞以外的其他物质。
[0039]
本发明使用枪头对平铺在芯片上的单个标记细胞进行提取时，其所采用的原理
是：外部压力挤压所述管套4，从而挤压出所述压力腔10中的部分空气；随着外部压力的消失，管套4变形也消失，此时所述压力腔10中的气压会小于大气压，通过内外的气压差将位于毛细管3管口处的目标细胞吸到毛细管3中。
[0040]
实现“尽可能少的吸取除标记细胞以外的其他物质”的方式是通过对芯片的结构进行特殊设计。所述芯片的具体结构如图2-5所示，所述芯片的主体结构为一硅基片8，所述硅基片8上设有溶液膜形成区81和边缘区82，所述边缘区82位于所述溶液膜形成区81的四周，所述溶液膜形成区81内凹于所述硅基片8。所述溶液膜形成区81是在表面平整的硅基片8上光刻蚀出的一内凹区域，凹陷深度小于一层单细胞膜的厚度。所述溶液膜形成区81光刻有细胞凹槽，所述细胞凹槽由若干个紧密排布的细胞锚槽9组成。所述溶液膜形成区81进行亲水处理，即位于所述溶液膜形成区81内的所述细胞锚槽9的每个表面都涂覆有亲水涂层。所述边缘区82涂覆有疏水涂层，从而保证滴在芯片上的细胞溶液只会在溶液膜形成区81进行铺展。
[0041]
所述细胞锚槽9为六边形或五边形或四边形或圆形的凹槽。本实施例中，所述细胞锚槽9排布成蜂窝状结构，此种排布，一方面从流体力学的角度可以更好地让细胞溶液铺展开来，另一方面可以更好地固定铺展开后的单个细胞，更利于枪头的吸取。所述细胞锚槽9的深度为2-15μm，优选2-5μm，从而避免铺开的细胞液膜中膜度过后，导致多个细胞叠加，不利于对单个标记细胞的提取。所述细胞锚槽9的内切圆直径为2-10μm，便于更好地实现对铺开后各细胞的固定。
[0042]
制备芯片时，选择形状规整、表面平整的硅基片8先进行表面疏水处理，再在硅基片8上刻蚀出一浅凹槽，是为溶液膜形成区81，所述浅凹槽的四周为环形台阶，从而防止滴入浅凹槽中的细胞溶液溢出该区域；然后在浅凹槽内光刻蚀出紧密排布的具有一定深度的细胞锚槽9，最后对溶液膜形成区81进行亲水处理，使细胞锚槽9的各表面都涂覆有亲水涂层。
[0043]
利用枪头和芯片的配合进行单个细胞提取时，具体的方法为：
[0044]
步骤1：将一定量的经荧光标记后的细胞溶液递到溶液膜形成区81，在表面张力的作用下，细胞溶液会扩散成一层细胞液膜，均匀地平铺在溶液膜形成区81，细胞液膜中所包含的细胞会被分别固定在各细胞锚槽9中；
[0045]
步骤2：在荧光系统中被标记的细胞会发出荧光，以实现对标记细胞的定位；
[0046]
步骤3：控制系统控制枪头移到芯片上的目标位置，将枪头的毛细管3管口对准标记细胞，通过控制系统施加一定的外力到压力弹片5上，压力弹片5下压到所述管套4上，管套4发生变形，从而将压力腔10中的部分空气通过毛细管3的管口挤出；然后取消外力，毛细管3管口处的标记细胞被吸入毛细管3中；
[0047]
步骤4：在控制系统的控制下将枪头移离芯片，将吸入毛细管3中的细胞释放到采集容器中；
[0048]
步骤5：重复步骤1-4，直至将芯片上的目标标记细胞全部提取出。
[0049]
采用本发明所用的提取设备和提取方法，整个提取过程不会影响到细胞的活性，同时，通过芯片和枪头结构的特定设计，实现了对标记细胞精确提取，在控制系统的作用下，实现对单个标记细胞的自动化提取，使所获得的的细胞提取液杂质更少、纯度更高。
[0050]
上述具体实施例只是用来解释说明本发明，而并非是对本发明进行限制，在本发
明构思和权利要求保护范围内对本发明做出的任何不付出创造性劳动的改变和替换，皆落入本发明专利的保护范围。

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