重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用的制作方法

[0001]
本发明属于重组酶介导等温扩增检测技术领域，尤其涉及一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用。


背景技术：

[0002]
玉米细菌性枯萎病菌(pantoea.stewartii subsp.stewarii，pss)是我国进境植物检疫性病原物之一，主要分布在美国、加拿大、墨西哥、巴西、秘鲁、意大利、波兰、罗马尼亚、马来西亚、泰国、越南以及俄罗斯、乌克兰等原苏联国家和地区(esfa，2020)。尽管我国是仅次于美国的世界第二大玉米种植国，但随着国内玉米需求量的激增，自2009年起我国每年都需大量进口玉米。根据海关数据，玉米进口来源主要集中在美国、阿根廷、乌克兰等玉米细菌性枯萎病菌发生国家。随着玉米进口贸易的发展，玉米细菌性枯萎病菌侵入我国风险剧增，该病原物在我国大部分地区气候条件均适合定植，具有广泛的适生区域，一旦入侵将严重威胁我国玉米生产安全(刘翔等，2008)。因此，建立并掌握针对玉米细菌性枯萎病菌快速检测技术至关重要。
[0003]
目前，针对玉米玉米细菌性枯萎病菌的主要有传统的分离培养(郭翼奋等，1982)，血清学检测(王岭等，2008；zhao et al.，2014)及常规分子生物学检测技术(王赢等，2009；tambong et al.，2008)，这些方法或操作复杂、耗时较长，或需大型仪器的支持，无法实现体外恒温条件的快速检测。目前针对体外恒温扩增的技术主要有环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)和重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification，raa)技术。lamp、rpa技术广泛应用于病原微生物及转基因片段的检测研究(李华伟等，2019；董文敏等，2020；谢实龙等，2019)。与lamp技术利用bst dna聚合酶的链置换合成活性提供反应动力，实现目标dna在恒温条件下的扩增不同(notomi et al.，2000)，raa与rpa技术均是利用重组酶与引物dna结合形成聚合体，实现dna模板在恒温条件下的的解链，其区别之处在于rpa技术利用噬菌噬uvsx重组酶、单链dna结合酶(gp32)和uvsy蛋白实现模板dna解链(piepenburg o et al.2006)，而raa技术使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，并在单链dna结合蛋白(single-stranded dna binding，ssb)的帮助下，实现模实现模板dna解链(l
ü
et al.，2010)。解链后，rpa和raa均在dna聚合酶的作用下，快速形成新的互补链，实现了20min内完成特定片段的指数级扩增。
[0004]
raa方法耗时短、特异性强、灵敏度高，是目前应用于细菌、病毒、支原体等病原微生物(zhang et al.，2017；shen et al.，2019；xue et al.，2020)检测研究的热门方法之一。
[0005]
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前针对玉米玉米细菌性枯萎病菌的方法存在操作复杂、耗时较长，或需大型仪器的支持，无法实现体外恒温条件的快速检测。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用。
[0007]
本发明是这样实现的，一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针，所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的序列为：
[0008]
f1：tattgatcgtatcctcattgttgcttagctt
[0009]
r2：gcgctctggctatattgggttattacggcac
[0010]
p:gcgagttgactgaggatatttgcatgat[fam-dt]t[thf]a[dt-bhq1]agcgtttttgttaa-block
[0011]
本发明的另一目的在于提供一种应用所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法，所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法包括以下步骤：
[0012]
步骤一，在na平板划线，28℃培养48小时，接种环刮板收集菌株。
[0013]
步骤二，采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组，用核酸测定仪验证提取效果；将pss基因组10倍等梯度稀释，-20℃保存备用。
[0014]
步骤三，以genbank序列cp017581为靶标，以pss基因组为模板，设计引物pss3/pss4扩增psts-glms序列。
[0015]
步骤四，引物筛选与体系建立：采用荧光raa试剂盒默认反应体系，以最低检测限度基因组为模板，结合探针对pss进行实时荧光raa检测，筛选得到最终的检测引物组合。
[0016]
进一步，步骤二中，所述细菌基因组提取试剂盒为takara：9763。
[0017]
进一步，步骤三中，所述上下游引物分别对应基因组444415nt和444914nt，引物序列为pss3和pss4；
[0018]
所述扩增条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸7min下，获取500bp大小片段。
[0019]
进一步，步骤四中，所述50μl体系，包含上游引物2.0μl(10mm)、下游引物2.0μl(10mm)、荧光探针0.6μl(10mm)、反应缓冲液a buffer 40.9μl和b buffer 2.5μl及dna模板2.0μl。利用荧光定量pcr仪(abi 7500)，反应条件为39℃40s；39℃30s，共40个循。
[0020]
进一步，步骤四中，所述筛选得到最终的检测引物组合的方法，包括：
[0021]
(i)以f1/r1引物组合，探索实时荧光raa对pss最低检测限度。
[0022]
(ii)以最低检测限度基因组为模板，分别以上游引物与下游引物组合f1/r1，f1/r2，f1/r3，f2/r1，f2/r2，f2/r3，f3/r1，f3/r2，f3/r3，f4/r1，f4/r2，f4/r3，结合探针对pss进行实时荧光raa检测，筛选出扩增效率最高的一组引物对作为最终的检测引物组合。
[0023]
本发明的另一目的在于提供一种应用所述重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针制备得到的重组酶介导等温扩增检测用的试剂盒。
[0024]
本发明的另一目的在于提供一种重组酶介导等温扩增检测用的试剂盒的特异性灵敏度的测定方法为：
[0025]
(1)提取pss标准菌、对照菌株的dna模板进行荧光raa检测，验证所述最终的检测引物组合特异性。
[0026]
(2)提取基因组模板，核酸测定仪测定浓度为28ng/μl，用无菌生理盐水10倍等梯
度稀释制备模板，稀释后的浓度分别是2.8、2.8
×
10-1
、2.8
×
10-2
、2.8
×
10-3
、2.8
×
10-4
、2.8
×
10-5
、2.8
×
10-6
、2.8
×
10-7
、2.8
×
10-8
ng/μl。
[0027]
(3)以梯度稀释dna为模板，进行荧光raa反应，测定其灵敏度。
[0028]
本发明的另一目的在于提供一种重组酶介导等温扩增检测用的试剂盒在检测玉米细菌性枯萎病菌中的应用。
[0029]
本发明的另一目的在于提供一种重组酶介导等温扩增检测用的试剂盒在检测玉米细菌性枯萎病菌中的检测效果的验证方法，所述重组酶介导等温扩增检测用的试剂盒在检测玉米细菌性枯萎病菌中的检测效果的验证方法包括：
[0030]
1)筛选按照sn/t 1375-2004：玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法，检测结果为阴性的进境饲用玉米，磨成粉状分成4份，每份10g。
[0031]
2)每份玉米样本中加入浓度为3.5
×
103cfu/ml的玉米细菌性枯萎病菌液5ml，搅拌混匀。
[0032]
3)称取收集的8份进境玉米样本及制备的4份模拟样本各20mg，提取dna用于荧光raa检测，同时利用标准方法进行验证。
[0033]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒，利用实时荧光raa检测技术，以玉米细菌性枯萎病菌psts-glms序列为模板，设计并筛选荧光性引物探针，构建玉米细菌性枯萎病菌快速检测体系。
[0034]
本发明利用重组酶等温扩增技术，以玉米细菌性枯萎病菌特异性片段psts-glms序列为模板，设计并筛选实时荧光raa引物和探针，验证其特异性并检测其灵敏性。结果表明，利用引物r2f1，结合设计探针成功建立了针对玉米细菌性枯萎病菌的实时荧光raa检测方法。该检测方法特异性强，对玉米细菌性枯萎病菌的检测限度可达280fg//μl。通过模拟样本及实际样本检测验证，表明该检测方法稳定、可靠，可用于检疫部门现场快速检测。
[0035]
本发明针对玉米细菌性枯萎病菌特异性psts-glms序列片段设计引物和探针，通过引物筛选、特异性验证和灵敏性测定等实验，建立了玉米细菌性枯萎病菌实时荧光raa检测方法。该方法特异性强，灵敏度高达280fg/μl，所用时间仅为20min，有效降低时间成本。该检测体系的建立为口岸进境玉米现场快速检疫提供新参考。本发明利用实时荧光raa检测技术，以玉米细菌性枯萎病菌psts-glms序列为模板，设计并筛选荧光性引物探针，构建玉米细菌性枯萎病菌快速检测体系。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1是本发明实施例提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法流程图。
[0038]
图2是本发明实施例提供的实时荧光raa引物与探针的位置示意图。
[0039]
图3(a)是本发明实施例提供的以f1/r1组合探测最低检测限度的示意图，图3(b)、
图3(c)、图3(d)是本发明实施例提供的以107倍稀释液为模板，反向引物r1、r2、r3分别与正向引物f1、f2、f3、f4组合，探索最佳引物组合的示意图。
[0040]
图4(a)是本发明实施例提供的特异性验证示意图，(b)是本发明实施例提供的灵敏性测定示意图。
具体实施方式
[0041]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0042]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针、试剂盒及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0043]
本发明实施例提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的序列为：f1：tattgatcgtatcctcattgttgcttagctt
[0044]
r2：gcgctctggctatattgggttattacggcac
[0045]
p:gcgagttgactgaggatatttgcatgat[fam-dt]t[thf]a[dt-bhq1]agcgtttttgttaa-block。
[0046]
如图1所示，本发明实施例提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法包括以下步骤：
[0047]
s101，在na平板划线，28℃培养48小时，接种环刮板收集菌株。
[0048]
s102，采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组，用核酸测定仪验证提取效果；将pss基因组10倍等梯度稀释，-20℃保存备用。
[0049]
s103，以genbank序列cp017581为靶标，以pss基因组为模板，设计引物pss3/pss4扩增psts-glms序列。
[0050]
s104，引物筛选与体系建立：采用荧光raa试剂盒默认反应体系，以最低检测限度基因组为模板，结合探针对pss进行实时荧光raa检测，筛选得到最终的检测引物组合。
[0051]
本发明提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的重组酶介导等温扩增检测用的引物和探针的合成方法仅仅是一个具体实施例而已。
[0052]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0053]
玉米细菌性枯萎病是进境玉米重要的细菌性检疫性病害之一。本发明利用重组酶等温扩增技术(recombinase-aided amplification，raa)，以玉米细菌性枯萎病菌特异性片段psts-glms序列为模板，设计并筛选实时荧光raa引物和探针，验证其特异性并检测其灵敏性。结果表明，利用引物r2f1，结合设计探针p成功建立了针对玉米细菌性枯萎病菌的实时荧光raa检测方法。该检测方法特异性强，对对玉米细菌性枯萎病菌的检测限度可达280fg//μl，较tambong等建立taqman实时荧光法1pg灵敏度有所提升。通过模拟样本及实际样本检测验证，表明该检测方法稳定、可靠，可用于检疫部门现场快速检测。
[0054]
本发明利用实时荧光raa检测技术，以玉米细菌性枯萎病菌psts-glms序列为模板，设计并筛选荧光性引物探针，构建玉米细菌性枯萎病菌快速检测体系。
[0055]
1、材料与方法
[0056]
1.1材料
[0057]
供试玉米样品来自乌克兰进境饲用玉米，进境口岸为舟山，进境时间为2018年
---
2019年，共计8个样品，每个样品2kg。
[0058]
供试菌株共计12株，其中玉米细菌性枯萎病菌菌株(pantoea.stewartii subsp.stewarii，pss)为atcc标准菌株编号atcc 29229，玉米内周萎蔫病菌(clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis)为atcc标准菌株编号atcc 27794，丁香假单胞杆菌番茄致病变种(pseudomonas syringae pv.syringae)、砖红色微杆菌(microbacterium testaceum)、密执安棍状杆菌诡谲亚种(clavibacter michiganensis subsp.insidiosus)、密执安棍状杆菌密执安(clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)为本实验室保存，成团泛菌(pantoea agglomerans)、菠萝泛菌(pantoea ananatis)、分散泛菌(pantoea dispersa)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia andropogonis)、玉米迪克氏菌(dickeyazeae)、欧氏杆菌(erwinia chrysanthemi var.zea)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
[0059]
1.2方法
[0060]
1.2.1细菌基因组提取
[0061]
在na平板划线，28℃培养48小时，接种环刮板收集菌株。采用细菌基因组提取试剂盒(takara：9763)提取细菌基因组，用核酸测定仪验证提取效果。将pss基因组10倍等梯度稀释，-20℃保存备用。
[0062]
1.2.2引物探针合成
[0063]
psts-glms序列对于ps具有高保守性，以genbank序列cp017581为靶标，设计引物pss3/pss4扩增psts-glms序列，上下游引物分别对应基因组444415nt和444914nt，引物序列如下：
[0064]
seq id no：9，pss3:cctgg cgaaa tcggt aac
[0065]
seq id no：10，pss4：ggcac aatta ttgct cat
[0066]
利用引物pss3/pss4，以pss基因组为模板，在扩增条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸7min下，获取500bp大小片段。分析序列与pss近似种序列差异，按照raa引物、探针设计原则设计引物和探针，引物探针位置及序列结果见表1，图2。本实验引物和探针的合成及序列测定均由上海生物工程技术有限公司完成。seq id no：1为f1，seq id no：2为f2，seq id no：3为f3，seq id no：4为f4，seq id no：5为r1，seq id no：6为r2，seq id no：7为r3，seq id no：8为p。
[0067]
表1实验用引物和探针
[0068][0069]
注：fam：6-羧基荧光素；bhq：荧光淬灭基团；thf：四氢呋喃
[0070]
1.2.3引物筛选与体系建立
[0071]
本实验采用荧光raa试剂盒(杭州众测生物科技有限公司：s002zc)默认反应体系，50μl体系包含上游引物、下游引物、荧光探针、ddh2o、反应缓冲液a buffer和b buffer及dna模板。利用荧光定量pcr仪(abi 7500)，反应条件为39℃40s；39℃30s，共40个循。
[0072]
以f1/r1引物组合，探索实时荧光raa对pss最低检测限度。以最低检测限度基因组为模板，分别以上游引物与下游引物组合f1/r1，f1/r2，f1/r3，f2/r1，f2/r2，f2/r3，f3/r1，f3/r2，f3/r3，f4/r1，f4/r2，f4/r3，结合探针对pss进行实时荧光raa检测，筛选出扩增效率最高的一组引物对作为最终的检测引物组合。
[0073]
1.2.4特异性验证
[0074]
按照方法1.2.1提取pss标准菌、对照菌株的dna模板进行荧光raa检测，验证该方法的特异性。
[0075]
1.2.5灵敏度测定
[0076]
按照1.2.1提取基因组模板，核酸测定仪(nanodrop 2000)测定浓度为28ng/μl，用无菌生理盐水10倍等梯度稀释制备模板，稀释后的浓度分别是2.8、2.8
×
10-1
、2.8
×
10-2
、2.8
×
10-3
、2.8
×
10-4
、2.8
×
10-5
、2.8
×
10-6
、2.8
×
10-7
、2.8
×
10-8
ng/μl。以梯度稀释dna为模板，进行荧光raa反应，测定其灵敏度。同时，与采用本实验室建立的实时荧光pcr方法(目的片段与本实验相同，均为pss3/pss4扩增片段)检测以上10个浓度，比较两种检测方法的灵敏度差异。
[0077]
1.2.6模拟样品及真实样品检测效果验证
[0078]
筛选按照标准sn/t 1375-2004：玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法，检测结果为阴性的进境饲用玉米(编号1-3103304)，磨成粉状分成4份，每份10g。每份玉米样本中加入浓度为3.5
×
103cfu/ml的玉米细菌性枯萎病菌液5ml，搅拌混匀。
[0079]
称取收集的8份进境玉米样本及制备的4份模拟样本各20mg，按照方法1.2.1提取dna用于荧光raa检测，同时利用标准方法进行验证。
[0080]
2、结果与分析
[0081]
2.1psts-glms序列获取与分析
[0082]
将测序获取的500bp大小目的片段，进行blast比对，结果显示：利用引物pss3/pss4扩增的psts-glms序列，与玉米细菌性枯萎病菌菌株dc283(序列号：cp017581)匹配率
为100％，与其他菌株差异显著。表明，该段序列对玉米细菌性枯萎病菌具有很强的特异性。
[0083]
2.2引物筛选与体系建立
[0084]
图3(a)显示一引物f1/r1组合，以28ng/μl为初始浓度10倍等梯度稀释模板进行实时荧光raa反应，结果显示：107倍稀释液即2.8
×
10-6
ng/μl为模板进行以引物f1/r1组合的实时荧光raa的最低检测限度。本实验以2.8
×
10-6
ng/μl模板进行不同引物组合扩增实验，探索最佳引物组合。
[0085]
图3(b)、图3(c)、图3(d)显示的是反向引物r1，r2，r3分别与正向引物f1，f2，f3，f4组合的实时荧光raa扩增结果。结果显示，每种组合均能收集到典型的扩增曲线，但扩增效率存在明显差异。分析不同引物组合扩增效率，结果显示：同一反向引物中，与正向引物f1/f4扩增效率明显高于与引物f2/f3组合扩增效率；r2f1/r2f4扩增效率明显高于r1f1/r1f4与r3f1/r3f4。经多次重复，最终实验选定引物组合r2f1作为玉米细菌性枯萎病菌实时荧光raa检测的引物对。
[0086]
分析引物自身二聚体形成及不同引物间二聚体形成现象(见表1、表2)，结果显示：在满足引物设计条件下，引物自身二聚体及引物间二聚体情况与引物扩增效率不存在必然联系。
[0087]
raa技术原理就是利用引物与重组酶的结合形成聚合体，在单链dna结合蛋白的辅助下，实现模板dna解链，并在dna聚合酶作用下，实现目的基因组的扩增。引物与重组酶形成聚合体的质量与整个反应扩增效率至关重要。不同引物组合间扩增效率的差异或许与聚合体的形成有关，究其具体原因，有待进一步研究。
[0088]
表2成对引物二聚体
[0089][0090]
2.3特异性分析
[0091]
利用收集的12株供试菌株验证建立的实时荧光raa检测方法的特异性，结果显示(图4(a))：只有pss样本具有典型的扩增曲线，包括其近似菌株pantoea agglomerance、pantoea ananatis、pantoea dispersa在内的11株其他菌株均无扩增。表明，引物r2f1和探针p针对pss菌株具有良好的特异性，可以用于玉米细菌性枯萎病菌的检测。
[0092]
2.4灵敏性测定
[0093]
将浓度为28ng/μl玉米细菌性枯萎病菌菌株，按照方法1.2.5进行10倍等梯度稀释制备模板进行实时荧光raa检测方法最低检测浓度测定，结果显示(图4(b))：荧光raa法可检测108倍稀释液，即检测灵敏度为280fg/μl。
[0094]
2.5模拟样本及真实样品检测效果
[0095]
以模拟样本及真实样本dna为模板进行荧光raa检测，同时采用标准方法进行验证复核。结果显示(表3)：4份模拟样本均检测均呈现阳性，8份真实样品检测均呈现阴性，与按照标准sn/t 1375-2004检测结果一致。
[0096]
表3 rt-raa检测效果验证
[0097][0098]
+：阳性；-：阴性
[0099]
3、结果
[0100]
raa扩增技术，是在39℃恒温下，利用重组酶蛋白与引物dna结合成聚合体，实现dna模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换，与传统pcr反应中利用高温条件将双链dna变性解链，并在退火条件下实现引物与模板碱基的互配不同，该方法在恒温条件下，实现dna解链并可在30min内完成目的dna扩增。正因如此，针对raa引物的设计具有其特殊性，既要考虑引物中gc含量及引物二聚体形成情况，又要验证引物与重组酶蛋白结合效率。
[0101]
本实验以玉米细菌性枯萎病菌psts-glms特异性序列为模板，设计7条引物，尽管12组引物对都能实现扩增，但扩增效率差异很大。分析设计引物及引物对间二聚体形成情况，显示在一定条件下，raa扩增效率与引物gc含量及引物二聚体形成情况无关。因此，有必要进一步研究raa中引物与重组酶蛋白之间的组合机制，以期指导引物的设计。
[0102]
环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)和raa技术是目前比较成熟的恒温核酸体外扩增技术。lamp技术是通过设计的4条引物，利用bst dna聚合酶的链置换合成活性提供反应动力，在恒温(60-65℃)条件下实现目标dna的扩增。但该方法引物设计复杂，且产物是一系列大小不等的片段，不能克隆、测序，只能定性判断目的基因的存在。与lamp技术不同，raa与rpa技术均是利用重组酶与引物dna结合形成聚合体，实现dna模板在恒温条件下的的解链。raa与rpa技术的区别之处在于rpa技术利用噬菌噬菌体uvsx重组酶和一个单链dna结合酶(gp32)，以及另外一个辅助uvsx重组酶的uvsy蛋白，而raa技术使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，并在单链dna结合蛋白(single-stranded dna binding，ssb)的帮助下，实现模板dna解链。两种方法获取的扩增产物均为单一条带，可用于后续的克隆、测序。且通过与荧光探针的结合使用，进一步提高检测的特异性和灵敏度。有研究利用实时荧光rpa技术进行转基因产品的定量检测。本发明主要利用实时荧光raa方法定性检测玉米细菌性枯萎病菌，20min完成检测，并具有高灵敏度、强特异性优势，但有关定量检测方面，尚需进一步研究。
[0103]
本发明针对玉米细菌性枯萎病菌特异性psts-glms序列片段设计引物和探针，通过引物筛选、特异性验证和灵敏性测定等实验，建立了玉米细菌性枯萎病菌实时荧光raa检
测方法。该方法特异性强，灵敏度高达280fg/μl，与实验室建立的rt-pcr检测灵敏度相当，所用时间仅为20min，有效降低时间成本。该检测体系的建立为口岸进境玉米现场快速检疫提供新参考。
[0104]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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