肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法与流程

[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法。


背景技术：

[0002]
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是一种高死亡率的原发性肝癌，它是全球范围最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球范围内，每年有数十万人死于肝癌。世界卫生组织(who)明确指出：癌症患者如果能早期发现，治愈率可达到80％。因此肝癌的早期诊断对肝癌病人治疗效果及生存质量有极为重大的意义。
[0003]
现有技术中，肝癌的早期筛查和诊断方法主要分为影像学检查和生化检测。其中，以肿瘤标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)检测为主的生化检测，由于生理因素影响及个体差异，其灵敏度和特异性远远不能满足临床诊断需求，并且组织活检具有一定的创伤性，患者接受度低。而以pet-ct为主的影像学检查对人体有射线辐射伤害，且费用昂贵，易受到检查者经验、手法、细致程度等主观因素的影响。因此，现有技术在肝癌的早期预测和诊断中效果均较差，仍然急需建立一种经济、快速、有效的肝癌早期筛查方法。
[0004]
相比于影像学检查和生化检测方法，以基因为靶标的分子检测方法已被证实拥有更高的灵敏度和特异性。研究表明，肝癌组织中存在多种基因启动子异常甲基化现象，这些基因启动子区域dna甲基化紊乱直接影响细胞周期和信号传导途径，与肝癌的发生发展息息相关。循环肿瘤dna(circulating tumor dna,ctdna)携带有与原发肝癌组织一致的分子遗传学改变，可以在外周血样本中获得。从临床角度出发，外周血样本较易获得、分子诊断灵敏度和特异性高。外周血循环肿瘤dna甲基化程度分析，可为肝癌的早期筛查提供重要信息；同时，联合检测多个基因的异常甲基化水平，有利于提高肝癌早期预警的准确率，对于肝癌早期诊断、治疗有着重大意义。因此，提供一种方法，能根据外周血循环多个基因的甲基化水平进行肝癌早期预警，成本低廉、特异性好、灵敏度高，操作简单方便，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的之一在于，提供一种肝癌早期的预警方法，解决现有技术中肝癌的早期筛查和预警灵敏度和特异性不好，成本高昂的问题。
[0006]
本发明的目的之二在于，提供肝癌早期预警用多基因甲基化联合检测试剂盒。
[0007]
本发明的目的之三在于，提供采用该多基因甲基化联合检测试剂盒检测外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化水平的方法。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009]
本发明所述的一种肝癌早期的预警方法，通过pcr法检测外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化水平，计算罹患肝癌的风险值，并根据计算结果进行预警；计算公式为：
[0010]
y＝1.208163-0.00653
×
ct(rassf1a)-0.00751
×
ct(elf)-0.00555
×
ct(p16)-0.00457
×
ct(gstp1)；
[0011]
当y≥0.3177时，判断为罹患肝癌高风险，当y<0.3177时，则判断为罹患肝癌低风险。
[0012]
本发明的部分实施方案中，所述ct(rassf1a)表示rassf1a经过内源参照的校准后的扩增水平，
[0013]
所述ct(elf)表示elf经过内源参照的校准后的扩增水平，
[0014]
所述ct(p16)表示p16经过内源参照的校准后的扩增水平，
[0015]
所述ct(gstp1)表示gstp1经过内源参照的校准后的扩增水平。
[0016]
本发明中的外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化水平可以通过现有技术中的检测试剂或和/试剂盒检测，也可以通过本发明所述的多基因甲基化联合检测试剂盒检测。优选地，采用本发明所述的多基因甲基化联合检测试剂盒检测。
[0017]
本发明所述的肝癌早期预警用多基因甲基化联合检测试剂盒，包括特异性检测外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化检测试剂。本发明的部分实施方案中，所述检测试剂盒还包括有内源性基因和内源性基因检测试剂。
[0018]
本发明所述的内源性基因可以选择现有技术报道的可作为内参的基因。
[0019]
优选地，所述内源性基因为β-actin或rpph。
[0020]
优选地，所述检测试剂盒为荧光pcr检测试剂盒。
[0021]
本发明的部分实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂中包括用于rassf1a、elf、p16和gstp1基因启动子区域进行甲基化特异性pcr(msp)扩增的dna引物对及探针
[0022]
本发明的部分实施方案中，rassf1a的扩增引物对的核苷酸序列为：
[0023]
正向引物gggttttgcgagagcgcg，如seq id no:1所示；
[0024]
反向引物gctaacaaacgcgaaccg，如seq id no:2所示；
[0025]
针对rassf1a的探针核苷酸序列为gctcttcccagcgcgctca，如seqid no:3所示；优选地，针对rassf1a的探针连接有荧光基团；更优选地针对rassf1a的探针标记fam荧光素。
[0026]
本发明的部分实施方案中，elf的扩增引物对的核苷酸序列为：
[0027]
正向引物ggcgagtggtttttgataaaattataaat，如seq id no:4所示；
[0028]
反向引物acataccacgattaccgaacccgaa，如seq id no:5所示；
[0029]
针对elf的探针核苷酸序列为cggcactcgtacgtcaaccgcg，如seqid no:6所示；优选地，针对elf的探针连接有荧光基团；更优选地针对elf的探针标记hex荧光素。
[0030]
本发明的部分实施方案中，p16的扩增引物对的核苷酸序列为：
[0031]
正向引物ttattagagggtggggcggatcgc，如seq id no:7所示；
[0032]
反向引物gaccccgaaccgcgaccgtaa，如seq id no:8所示；
[0033]
针对p16的探针核苷酸序列为accgcgtagctcagtcctta，如seq idno:9所示；优选地，针对p16的探针连接有荧光基团；更优选地针对p16f的探针标记cy5荧光素。
[0034]
本发明的部分实施方案中，gstp1的扩增引物对的核苷酸序列为：
[0035]
正向引物ttcggggtgtagcggtcgtc，如seq id no:10所示；
[0036]
反向引物gccccaatactaaatcacgacg，如seq id no:11所示；
[0037]
针对gstp1的探针的核苷酸序列为accgggtcgcatgggccaatcg，如seq id no:12所示；优选地，针对gstp1的探针连接有荧光基团；更优选地针对gstp1的探针标记rox荧光素。
[0038]
本发明的部分实施方案中，内源性基因为rpph，其扩增引物对的核苷酸序列为：
[0039]
正向引物：tcatcagtggggccacga，如seq id no:13所示；
[0040]
反向引物：ctgttagggccgcctctggc，如seq id no:14所示；
[0041]
针对rpph的探针的核苷酸序列为tgcgtcctgtcactccactcccatgt，如seq id no:15所示；优选地，针对rpph的探针连接有荧光基团；更优选地针对rpph的探针标记alexafluor680荧光素。
[0042]
本发明所述的一种非诊疗目的检测人rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化的方法，包括以下步骤：
[0043]
s1.将待测样品进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸盐修饰的待测样品；
[0044]
s2.采用上述的pcr检测试剂盒对s1得到的待测样品进行检测，获得人rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化水平。
[0045]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0046]
本发明的肝癌早期预警方法，通过检测外周血中rassf1a、elf、p16和gstp1四种基因的dna甲基化水平，计算其风险值，从而用于肝癌早期风险预警，操作简单，成本低廉，灵敏度高，结果准确，高风险预警结果与临床诊断结果符合度高。对于早期肝癌的诊断具有很好的应用前景，能够提高肝癌诊断的敏感性和特异性，增加肝癌患者的生存率、治愈率。
[0047]
本发明的采用多靶标同时检测技术构建试剂盒，特异性好、灵敏度高，为肝癌早期预警方法提供了有力支撑。
[0048]
本发明采用外周血为检测样本，样本易得，分子学检测流程标准化，有利于低成本、高通量的系统化检测平台的建立，能够克服现有技术价格昂贵、依赖专业人员操作、灵敏度低、特异性低等缺陷，适合在普通实验室推广和规模。
附图说明
[0049]
附图1为roc曲线分析图。
具体实施方式
[0050]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0051]
本发明实施例中所述的血浆游离dna提取及转化试剂盒由西安天隆科技有限公司提供。
[0052]
实施例1
[0053]
本实施例公开了采用本发明的检测试剂盒检测外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化的方法，具体为：
[0054]
1.血浆样本的分离与保存：抽取受检者外周血10ml于抗凝采血管中，于3000rpm，离心10min，使样本分血浆、白细胞、红细胞三层，用移液器取出抗凝管中最上层血浆至新的离心管中，做好标记后至于80℃保存。
[0055]
2.血浆游离dna(cfdna)提取：采用血浆游离dna提取及转化试剂盒提取，所有操作按照试剂盒说明书严格操作。
[0056]
3.cfdna转化：采用血浆游离dna提取及转化试剂盒对提取的cfdna进行重亚硫酸盐修饰并纯化，按照试剂盒说明书严格操作。取80μl的cfdna提取产物，并加入甲基化处理试剂220μl，置于pcr仪上按照以下条件孵育完成甲基化处理：98℃，10min，80℃，45min。重亚硫酸盐修饰处理后的cfdna经试剂盒中附带的dna纯化柱及洗脱试剂完成洗脱纯化。经处理后，甲基化/非甲基化的c碱基在经过重亚硫酸盐处理后分别为c/u碱基，经过pcr扩增后分别为c/t碱基。
[0057]
4.目的基因扩增引物对的选择：为了制备适用于同时检测人rassf1a、elf、p16、gstp1基因甲基化dna的检测试剂，分别选定各基因的扩增区域序列并设计相应的引物序列，各基因的引物序列分别如表1所示；
[0058]
表1
[0059][0060][0061]
5.所述rassf1a、elf、p16、gstp1基因多重甲基化特异性pcr试剂配方如表2
[0062]
所示：
[0063]
表2
[0064]
试剂终浓度hs taq0.5-1.5u/40μl10
×
buffer1mgcl21-3.5mmdntp100-300μmrassf1a-f0.1-0.3μmrassf1a-r0.1-0.3μmrassf1a-p0.1-0.3μmelf-f0.1-0.3μmelf-r0.1-0.3μm
elf-p0.1-0.3μmp16-f0.1-0.3μmp16-r0.1-0.3μmp16-p0.1-0.3μmgstp1-f0.1-0.3μmgstp1-r0.1-0.3μmgstp1-p0.1-0.3μmrpph-f0.1-0.3μmrpph-r0.1-0.3μmrpph-p0.1-0.3μm模板dna20μl去离子水补足至40μl
[0065]
所述rassf1a、elf、p16、gstp1基因多重甲基化特异性pcr扩增程序如表3所示：
[0066]
表3
[0067][0068]
ct值的校准方法：在相同反应体系及相同扩增效率的情况下，以内源基因的表达量对标基因的ct进行归一化，得到目标基因经过归一化即校准后的ct值，其计算公式如下：
[0069]
ct
归一化
＝25-(ct
内源基因-ct
目标基因
)
[0070]
实施例2
[0071]
本实施例公开了本发明的预警方法的建立实验。
[0072]
1.实验分组
[0073]
1.1训练组：2018年1月至2018年7月间接受肝病治疗的患者外周血样本100例。
[0074]
1.2验证组：2018年9月至2019年4月间接受肝病治疗的患者外周血样本100例。
[0075]
2.外周血样本中rassf1a、elf、p16和gstp1基因的dna甲基化水平检测：按照实施例1的方法检测。
[0076]
3.检测结果：
[0077]
训练组样本中包含临床病理诊断为肝癌患者(40人)、肝硬化患者(30人)、无肝纤维化慢性患者(20人)及正常人(10人)的外周血样本。按实施例1的方法检测检测训练组rassf1、elf、p16、gstp1基因的甲基化水平，肝癌患者、肝硬化患者及无肝纤维化慢性患者各基因甲基化检测ct值如下表4、表5、表6、表7所示，各基因甲基化占比，如表8所示：
[0078]
表4
[0079]
[0080]
[0081][0082]
表5
[0083]
[0084][0085]
表6
[0086]
[0087][0088]
表7
[0089][0090]
表8
[0091][0092]
6公式建立与风险阈值的确定：
[0093]
对训练组数据进行roc曲线分析，结果见图1，得到公式：
[0094]
y＝1.208163-0.00653
×
ct(rassf1a)-0.00751
×
ct(elf)-0.00555
×
ct(p16)-0.00457
×
ct(gstp1)；
[0095]
经过roc曲线分析，本方法的检测灵敏度92.5％，特异性93.3％，风险阈值0.3177。
[0096]
即通过检测rassf1、elf、p16、gstp1基因的甲基化水平提示罹患肝癌风险的阈值为＞0.3177。
[0097]
7.验证组测试及评估
[0098]
按实施例1的方法检测检测验证组rassf1、elf、p16、gstp1基因的甲基化水平，并按公式y＝1.208163-0.00653
×
ct(rassf1a)-0.00751
×
ct(elf)-0.00555
×
ct(p16)-0.00457
×
ct(gstp1)计算风险值，结果如表9-12所示，临床诊断为肝癌或有肝癌风险的病人，其风险值y均＞0.3177。验证组测试的结果表明，通过检测rassf1、elf、p16、gstp1基因的dna甲基化水平，根据本发明的公式计算风险值，可以有效地肝癌早期预警。
[0099]
表9
[0100]
[0101][0102]
表10
[0103]
[0104][0105]
表11
[0106]
[0107][0108]
表12
[0109][0110]
最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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