牙鲆非编码小RNA(miRNA)及其的应用的制作方法

牙鲆非编码小rna(mirna)及其的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是牙鲆非编码小rna(mirna(pol-mir-150))及其在抑制病毒感染中的应用。


背景技术：

[0002]
mirna(microrna)是一种非编码小rna，通过与靶基因mrna序列互补而调控基因表达。在大多数情况下，mirna诱导靶mrna降解或在翻译后水平阻止蛋白质合成，但有些情况下，mirna也能激活mrna转录或蛋白质翻译。越来越多的研究表明，mirna参与多种生物学活动，包括生长、发育、细胞凋亡、能量代谢、免疫以及病原感染等。尽管越来越多mirnas的功能被揭示，绝大部分mirnas的功能仍不清楚。牙鲆(paralichthys olivaceus)是一种海水鱼类，在我国及亚洲其它国家属于重要水产养殖品种之一。在牙鲆养殖过程中，病毒感染和流行是危害牙鲆健康养殖的主要因素之一。目前，虹彩病毒科的病毒是影响牙鲆养殖业的主要病毒之一。虹彩病毒科包括几种不同类型的病毒，其中一种为肿大细胞病毒(megalocytivirus)。肿大细胞病毒是一种危害严重的鱼类病毒，能感染多种鱼类。目前，直接应用于抗鱼类病毒的相关制剂研究很少。


技术实现要素：

[0003]
本发明目的在于提供一种牙鲆非编码小rna(mirna(pol-mir-150))在抑制病毒感染中的应用。
[0004]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005]
牙鲆非编码小rna(pol-mir-150)为seq id no:1所示的碱基序列所示。所述牙鲆pol-mir-150在制备抑制病毒感染的制剂中的应用。
[0006]
所述牙鲆pol-mir-150在制备拮抗剂，抑制病毒感染中的应用。
[0007]
所述病毒为肿大细胞病毒(megalocytivirus)。
[0008]
本发明具有如下优点：
[0009]
本发明所涉及的pol-mir-150拮抗剂作为免疫调节分子，能够有效提升牙鲆对肿大细胞病毒的抗性。本发明的pol-mir-150拮抗剂注射牙鲆后能够显著抑制肿大细胞病毒的感染。
附图说明
[0010]
图1为本发明实施例提供的pol-mir-150拮抗剂抑制肿大细胞病毒感染脾脏的结果图(*p<0.05)，牙鲆在pol-mir-150拮抗剂存在条件下(a)或在pol-mir-150拮抗剂阴性对照nc存在条件下(b)感染肿大细胞病毒，或者在无pol-mir-150拮抗剂或nc条件下(c)感染肿大细胞病毒，4天后检测脾脏中病毒量。数值是三次实验的平均值，以平均值
±
标准差表示.*p<0.05。
具体实施方式
[0011]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0012]
实施例1
[0013]
牙鲆非编码小rna——pol-mir-150的获得：
[0014]
pol-mir-150是牙鲆体内表达的一种非编码小rna，利用高通量测序获得其序列，如下：
[0015]
seq id no:1：5
’-
cacugguacaaggauugggagu-3
’
[0016]
实施例2
[0017]
pol-mir-150作为拮抗剂抗肿大细胞病毒实验：
[0018]
步骤1)pol-mir-150液和pol-mir-150nc(阴性对照)液的制备：
[0019]
以上述实施例获得序列作为pol-mir-150拮抗剂，同时设计pol-mir-150拮抗剂的对照分子(命名为nc)；将pol-mir-150拮抗剂和nc分别溶解于depc水(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)至100um，即分别为pol-mir-150液和nc液。
[0020]
其中，对照分子序列为:5
’-
ggcauuggaugacgucgauaga-3。上述分子由genepharma公司合成。
[0021]
步骤2)pol-mir-150液-病毒注射液和nc液-病毒注射液的制备
[0022]
将肿大细胞病毒(制备方法具体见zhang m,xiao z,hu y,sun l.characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,oplegnathus fasciatus(temminck&schlege),in china.aquac res.2012；43:556
–
64)分别与上述步骤1)制备的pol-mir-150液和nc液等体积混合，各混合液浓度108病毒/ml，分别命名为pol-mir-150液-病毒注射液和nc液-病毒注射液。
[0023]
步骤3)注射鱼类
[0024]
将15条牙鲆(每条重约10-12g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为a、b和c。将a组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤2)的pol-mir-150液-病毒注射液，将b组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤2)的nc液-病毒注射液，将c组的每条鱼分别腹腔注射100ul depc水(空白对照组)。
[0025]
步骤4)病毒感染检测
[0026]
对上述步骤3的各组注射后第4天，取鱼脾脏组织，利用dna提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)从组织中提取dna，用绝对定量pcr法检测组织中病毒含量。具体方法见参考文献zhang m,xiao z,hu y,sun l.characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,oplegnathus fasciatus(temminck&schlege),in china.aquac res.2012；43:556
–
64。结果表明，b组和c组鱼脾脏的病毒数无显著差异；而注射pol-mir-150液-病毒注射液的a组鱼脾脏的病毒数显著(p<0.05)低于b组和c组鱼(图1)。
[0027]
这些结果表明，pol-mir-150拮抗剂能够显著抑制肿大细胞病毒感染脾脏。

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