利用漳州芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶的方法及其应用与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用漳州芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶的方法及其应用。


背景技术：

[0002]
鱼露是一种类似于酱油的调味料，风味独特，是我国沿海地区、东南亚和日本居民的主要膳食调味料之一。传统鱼露是利用低值鱼(蓝园鲹、沙丁鱼、巴浪鱼)、虾，或者工业下脚料鱼头、鱼肝或鱼内脏为原料，加入30％-40％的盐，放置太阳底下暴晒，发酵一年以上后制成。传统发酵鱼露具有良好风味的同时也产生了一系列问题。第一，传统鱼露盐份高，发酵周期长，产量低下。第二，由于传统发酵技术在发酵过程不添加任何酶类，发酵过程不定向从而导致鱼露营养不够全面。第三，鱼露在自然发酵过程中由于微生物或酶的作用，会发生一系列生化反应从而产生具有不良风味的代谢产物，这些化合物给鱼露带来的腥味、汗味、酸味等，严重限制了它的可接受性。因此，急需开发利用外添加产蛋白酶等微生物加速鱼露发酵、改善鱼露风味的低盐风味速酿鱼露生产方法。
[0003]
海参体壁内富含海参多糖、磷脂、皂苷、胶原蛋白等多种功效成分，自古以来即被大众认为是滋补食品。口感良好的刺参产量低，价位高昂。而资源丰富的赤条参、沙虫参、海地瓜等低值海参口感较差，直接食用价值较低，研究并利用其功效成分，是实现海参资源高值化利用的有效途径。酸性溶液化学提取法和酶解技术提取法是当前海参功效成分提取的最通用方法。其中，酶解技术提取法相对于酸性溶液化学提取法，具有功效成分提取率高等优势，但酶解技术尤其是酶种类直接影响了特定功效成分的提取率。因此，利用特定产蛋白酶微生物是获取特定功效成分海参肽的关键途径。
[0004]
牡蛎，是我国主要的经济贝类之一。牡蛎富含脂类、蛋白质、肽、牛磺酸和微量元素等物质，营养价值极高。但当前，牡蛎主要以鲜食、干制等粗加工为主，产品附加值低。随着牡蛎养殖技术的快速发展，牡蛎产业已出现供过于求和价格下跌趋势，实现牡蛎高值化利用是牡蛎养殖业健康持续发展的先决条件之一。近年来，牡蛎肽因其良好的抗氧化、提高免疫力、促进生长发育、肝保护等生物活性和高安全性而受到广泛关注。如今，欧美、日本等发达国家已成功开发多种有关牡蛎肽的工业化产品，应用于多个领域。但是，我国对牡蛎肽的研究起步较晚，有关牡蛎肽的工业化产品很少。当前，阻碍牡蛎肽在医药保健食品行业广泛应用的主要原因是特定功能牡蛎肽的制备获取。因此，利用专一性产蛋白酶微生物制备具有特定分子片段及特定功效的牡蛎肽，市场前景广阔。
[0005]
蛋白酶根据其来源可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。其中微生物蛋白酶约占世界酶总销售额的60％，是工业酶中最重要的一类。海洋特殊生态环境孕育了独特酶学性质的海洋微生物。这些微生物，具有产酶丰富、生长周期短、不受季节、地理位置影响等特点，且所产蛋白酶大多为胞外蛋白酶。近年来，研究人员将芽孢杆菌作为一种有益菌用于提高食品的营养和食用价值。研究发现，甲基营养芽孢杆菌所产蛋白酶能有效提高食品的营养价值和感官特性；异源卤代芽孢杆菌可作为风味增强剂提高鱼露中的天冬氨
酸、谷氨酸等鲜味来源物质的含量，而多粘芽孢杆菌d05-1的胺降解活性可作为鱼露发酵剂有效的减少鱼露中生物胺的积累，增强鱼露风味。可见，海洋来源芽孢杆菌产酶微生物在鱼露、蛋白肽等生产方面应用潜力巨大。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的一项技术问题是，如何以海洋来源芽孢杆菌高效制取碱性蛋白酶。
[0007]
本发明要解决的另一技术问题是，如何通过发酵方法的改进，来提升海洋来源芽孢杆菌产碱性蛋白酶的效率和酶活水平。
[0008]
本发明要解决的再一技术问题是，在鱼露生产工艺中，如何加快鱼露的发酵进程。
[0009]
本发明要解决的又一技术问题是，在虾蛋白肽生产工艺中，如何加速虾头虾壳中蛋白的自溶酶解变性。
[0010]
本发明要解决的又一技术问题是，在海参肽生产工艺中，如何加速赤条参、沙虫参等低值海参的酶解变性。
[0011]
本发明要解决的又一技术问题是，在牡蛎肽生产工艺中，如何加速牡蛎蛋白的酶解变性。
[0012]
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0013]
利用漳州芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0014]
1)取漳州芽孢杆菌菌种转接于平板培养基中，于37℃恒温培养48h，后转接于种子液培养基中，于37℃、150r/min下培养24h，得到种子液；其中所述平板培养基含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l、琼脂15g/l，所述平板培养基的ph为7；所述种子液培养基含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l，所述种子液培养基的ph为7；
[0015]
2)向初始ph为6～10的发酵培养基中接入2％～10％v/v的所述种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h，而后离心收集上清液，即为液体酶。
[0016]
作为优选，所述发酵培养基含有酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、nacl 10g/l。
[0017]
作为优选，发酵条件为：种子液接种量为6.33％v/v、发酵初始ph为8.47、发酵温度为26.5℃。
[0018]
作为优选，步骤1)中所述的恒温培养，是在恒温培养箱中完成的。
[0019]
作为优选，还包括以下步骤3)：测定所述上清液的碱性蛋白酶活力。
[0020]
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述方法在低盐风味速酿鱼露生产中的应用，包括以下步骤：将鱼原料与等重量的纯化水混合，并加入所述鱼原料重量10％的海盐，粉碎成匀浆，调节其ph至6～10，向其中加入乳酸菌、酵母菌、清酒曲，再接入2％～10％v/v的所述种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h～30d，而后离心收集上清液，即为鱼露。
[0021]
作为优选，所述鱼原料为蓝圆鲹、巴浪鱼等低值鱼原料。
[0022]
作为优选，乳酸菌、酵母菌、清酒曲三者的用量比为：乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1或2∶1∶1或2∶1∶2或2∶2∶1或3∶1∶1。
[0023]
作为优选，发酵条件为：种子液接种量为4.62％v/v、发酵初始ph为9.12、发酵温度为36.2℃，菌种比例为乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1。
[0024]
作为优选，还包括以下步骤：测定所述鱼露氨基态氮含量。
[0025]
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述方法在虾蛋白肽生产中的应用，包括以下步骤：将虾头虾壳原料粉碎后与等重量的纯化水混合，调节其ph至9，接入5％v/w的所述种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，而后离心收集上清液，冻干，即得到虾蛋白肽。
[0026]
作为优选，还包括以下步骤：测定所述虾蛋白肽的总氮含量。
[0027]
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述方法在海参肽生产中的应用，包括以下步骤：将已泡发的海参粉碎后与等重量的纯化水混合，调节其ph至9，接入5％v/w的所述种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，而后离心收集上清液，冻干，即得到海参肽。
[0028]
作为优选，所述海参是赤条参、沙虫参等低值海参。
[0029]
作为优选，还包括以下步骤：测定所述海参肽的总氮含量、游离氨基酸含量及肽分子量。
[0030]
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述方法在牡蛎肽生产中的应用，包括以下步骤：将牡蛎粉碎后与等重量的纯化水混合，调节其ph至9，接入5％v/w的所述种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，而后离心收集上清液，冻干，即得到牡蛎肽。
[0031]
作为优选，还包括以下步骤：测定所述牡蛎肽的总氮含量、游离氨基酸含量及低聚肽含量。
[0032]
本发明提供了一种利用漳州芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶的方法及其应用，属于生物技术领域。该方法包括菌种活化、种子液培养、发酵生产碱性蛋白酶等步骤；本发明通过单因素条件优化和响应面实验设计筛选了漳州芽孢杆菌的最适发酵条件，在该发酵条件下，碱性蛋白酶的活力达到最高。在此基础上，本发明将该方法分别应用于低盐风味速酿鱼露、海参肽、牡蛎肽、虾蛋白肽等产品的生产工艺中，使鱼露发酵进程得到显著加快，虾头虾壳、海参、牡蛎的蛋白酶解速度得到提升，有助于提高上述产品的生产效率和工艺水平，同时，为低值海产品的高值化利用提供了一种新的途径。
[0033]
本发明的有益效果集中体现在以下方面：
[0034]
1、本发明通过单因素条件优化和响应面实验设计筛选了漳州芽孢杆菌的最适发酵条件，在该发酵条件下，漳州芽孢杆菌产碱性蛋白酶活力最高。
[0035]
2、本发明通过添加漳州芽孢杆菌，极大加速了鱼蛋白的酶解，大幅度推进了鱼露的发酵进程。开发的低盐风味速酿鱼露生产工艺，实现了蓝圆鲹、巴浪鱼等低值资源的高值化利用。
[0036]
3、本发明在虾蛋白肽生产中，通过添加漳州芽孢杆菌，加速了虾头虾壳中蛋白自溶酶解变性，实现了虾加工副产物的高效利用。
[0037]
4、本发明在海参肽生产中，通过添加漳州芽孢杆菌替代复合蛋白酶，加速了赤条参、沙虫参等低值海参酶解变性，降低了生产成本，实现了低值海参的高值化利用。
[0038]
5、本发明在牡蛎肽生产中，通过添加漳州芽孢杆菌替代复合蛋白酶，加速了牡蛎蛋白的酶解变性，降低了生产成本，实现了牡蛎资源的高值化利用。
附图说明
[0039]
图1是本发明实施例1中，接种量对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响的实验结果图。
[0040]
图2是本发明实施例1中，初始ph对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响的实验结果图。
[0041]
图3是本发明实施例1中，温度对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响的实验结果图。
[0042]
图4是本发明实施例2中，鱼露底物初始ph对氨基态氮含量的影响的实验结果图。
[0043]
图5是本发明实施例2中，发酵温度对氨基态氮含量的影响的实验结果图。
[0044]
图6是本发明实施例2中，接种量对氨基态氮含量的影响的实验结果图。
[0045]
图7是本发明实施例2中，混菌比例对氨基态氮含量的影响的实验结果图。
[0046]
图8是本发明实施例3中，发酵时间对氨基态氮含量的影响的实验结果图。
[0047]
图9是本发明实施例3中，发酵时间对总氮含量的影响的实验结果图。
[0048]
图10是本发明实施例4中，是否添加漳州芽孢杆菌，对虾蛋白肽总氮含量的影响的实验结果图。
[0049]
图11是本发明实施例5中，是否添加漳州芽孢杆菌，对海参肽总氮含量、游离氨基酸含量、分子量的影响的实验结果图。
[0050]
图12是本发明实施例6中，是否添加漳州芽孢杆菌，对牡蛎肽总氮含量、游离氨基酸含量、低聚肽含量的影响的实验结果图。
具体实施方式
[0051]
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0052]
实施例1漳州芽孢杆菌发酵条件优化
[0053]
菌种活化与种子液培养：取冻存管保存的漳州芽孢杆菌(bacillus zhangzho uensis)普通菌种转接于平板培养基中，于37℃恒温培养箱中培养48h，后转接于种子液培养基中，于37℃，150r/min下培养24h。平板培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，琼脂15g/l，ph为7。种子液培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph为7。
[0054]
发酵生产：向初始ph为6～10的发酵培养基中接入2～10％(v/v)的种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h。发酵完毕后，离心去除菌体，收集上清液即为液体酶。测定上清液的碱性蛋白酶活力。
[0055]
①
接种量对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响
[0056]
由图1可知，蛋白酶活力随接种量的增加呈先上升后下降的趋势，当接种量为2％-6％时，由于漳州芽孢杆菌浓度升高，蛋白酶活力越来越大，当接种量为6％-10％时，由于漳州芽孢杆菌菌体浓度过高，耗尽了发酵培养基中的营养物质，导致蛋白酶活力迅速下降。当接种量为6％时，蛋白酶活力最大为280.64u/ml。因此，选择接种量为6％作为发酵培养基的最佳接种条件，并应用于下一步的条件优化。
[0057]
②
初始ph对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响
[0058]
由图2可知，蛋白酶活力随初始培养基ph值的增加呈先上升后下降的趋势，当ph为6～9时，碱性蛋白酶因适应碱性条件活力缓慢上升，在ph＝9时，活力达到最大为225.47u/ml，当ph大于9时，超出了漳州芽孢杆菌的碱性耐受范围，蛋白酶活力迅速下降。因此，选择ph＝9作为发酵培养基的最初ph条件，并应用于下一步的条件优化。
[0059]
③
温度对漳州芽孢杆菌产酶活力的影响
[0060]
由图3可知，碱性蛋白酶的活力随发酵温度的升高先上升，后下降，温度为25℃时，碱性蛋白酶活力最大为205.31u/ml，当温度为20-25℃范围内时，由于温度升高，接近漳州芽孢杆菌最适生长温度，促进了其蛋白酶的分泌，使得蛋白酶活力迅速上升。当温度超过25℃后，海洋来源的漳州芽孢杆菌几乎不生长，导致酶活力下降，且温度越高，酶活力下降越小。因此，选择25℃作为漳州芽孢杆菌发酵培养的最佳温度。
[0061]
④
响应面(rsm)实验设计与结果
[0062]
由单因素实验结果，确定漳州芽孢杆菌的最佳发酵条件为接种量6％，初始ph＝9，发酵温度为25℃，根据中心组合实验设计原理，设计三因素三水平响应面分析实验，选取接种量、初始ph和发酵温度三个因素分别用a、b、c表示，且每个自变量的低、中、高水平分别用-1、0、1编码，以碱性蛋白酶酶活力为响应值(y)，通过响应面分析对发酵条件进行优化。每次试验设3个平行，取平均值。数据采用design expert和microsoft office excel 2003软件进行统计分析。其中p＜0.01表示差异极显著，p＜0.05差异显著，p＞0.05差异不显著。具体设计方案如表1所示。
[0063]
表1响应面分析因素和水平
[0064][0065]
根据box-benhnken中心组合实验设计原理结合单因素实验结果，并利用design expert软件对二次回归方程进行分析得到碱性蛋白酶活力的最优条件为接种量6.33％、ph为8.47、发酵温度为26.5℃，在此条件下，预测出的碱性蛋白酶活力可达到最大为318.75u/ml。经过三次验证实验得到碱性蛋白酶的酶活力分别为323.67/ml、325.42/ml和310.80/ml与预测的实验结果相差不大，说明该模型具有一定的准确性和可靠性，可用作碱性蛋白酶活力值的预测。
[0066]
实施例2漳州芽孢杆菌对鱼露底物发酵条件优化
[0067]
称取巴浪鱼原料，加入等比例原料重量的纯化水和原料重量10％的海盐，粉碎均浆作为发酵生产鱼露底物，调初始ph为6～10，加入不同配比的乳酸菌、酵母菌和清酒曲(乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1，2∶1∶1，2∶1∶2，2∶2∶1，3∶1∶1)，接入2～10％(v/v)的漳州芽孢杆菌种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h，离心，收集上清液即为鱼露，测定鱼露氨基态氮含量。
[0068]
①
鱼露底物初始ph对氨基态氮含量的影响
[0069]
由图4可知，鱼露中氨基态氮含量随ph值的升高先迅速上升后急速下降，表明ph值对鱼露发酵菌种有极大的影响，当ph为6时，由于漳州芽孢杆菌和乳酸菌不耐酸性，氨基态氮含量较小，随后由于缓慢接近乳酸菌的最适生长ph，氨基态氮含量随ph值的升高而升高，当ph为9时，培养基中充满了漳州芽孢杆菌和乳酸菌，氨基态氮含量达到最大。当ph为10时，超出了所有菌种的碱性耐受范围，导致氨基态氮含量下降。
[0070]
②
发酵温度对氨基态氮含量的影响
[0071]
由图5可知，鱼露培养基中氨基态氮含量随发酵温度的升高总体呈先上升后下降趋势，当温度为35℃时，乳酸菌在鱼露发酵过程占主导作用，氨基态氮含量达到最高，20-30℃时，漳州芽孢杆菌在培养基中浓度最高，氨基态氮含量随发酵温度升高而升高，30℃时，达到漳州芽孢杆菌的最适生长温度，氨基态氮含量迅速升高。当温度达到40℃后，由于漳州芽孢杆菌和乳酸菌耐热性差，生长受到抑制，酵母菌在鱼露发酵过程占主导作用，导致氨基态氮含量略微下降。
[0072]
③
漳州芽孢杆菌接种量对氨基态氮含量的影响
[0073]
由图6可知，当温度为35℃、ph＝9、菌种比例为3∶1∶1时，添加漳州芽孢杆菌对鱼露发酵后培养基中的氨基态氮含量有一定的影响，且不同浓度的漳州芽孢杆菌添加量不同程度的影响鱼露培养基中氨基态氮含量，随漳州芽孢杆菌浓度先升高后下降，当漳州芽孢杆菌浓度为4％时，氨基态氮含量最高，与空白对照组相比，混菌和漳州芽孢杆菌均能增加鱼露中的氨基态氮含量，当漳州芽孢杆菌浓度过高时，消耗了鱼露培养基中的营养物质，导致氨基态氮含量下降。
[0074]
④
混菌比例对氨基态氮含量的影响
[0075]
由图7可知，当温度为35℃，ph＝9，漳州芽孢杆菌接种量为4％时，添加混菌明显增加了鱼露发酵培养基中的氨基态氮含量，且不同的混菌比例对氨基态氮含量有不同的影响。当混菌比例为1∶1∶1时，氨基态氮含量最高。
[0076]
⑤
响应面实验设计与结果
[0077]
由单因素实验结果，确定鱼露的最佳发酵条件为接种量4％，初始ph＝9，发酵温度为30℃、混菌比例1∶1∶1。根据中心组合实验设计原理，设计四因素三水平响应面分析实验，选取发酵温度、漳州芽孢杆菌接种量和初始ph和菌种比例四个因素分别用a、b、c和d表示，且每个自变量的低、中、高水平分别用-1、0、1编码，以氨基态氮含量为响应值(y)，通过响应面分析对发酵条件进行优化。每次试验设3个平行，取平均值。数据采用design expert和microsoft office excel 2003软件进行统计分析。其中p＜0.01表示差异极显著，p＜0.05差异显著，p＞0.05差异不显著。具体设计方案如表2所示。
[0078]
表2响应面分析因素和水平
[0079]
[0080]
利用design expert软件对二次回归方程进行分析得到氨基态氮含量的最优条件为发酵温度为36.2℃、漳州芽孢杆菌接种量4.62％、ph＝9.12、乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1，在此条件下，预测出的氨基态氮含量可达到最大为0.682881g/100ml。
[0081]
实施例3低盐风味速酿鱼露的制备
[0082]
称取巴浪鱼原料100g，加入100g纯化水和海盐10g，粉碎均浆作为发酵生产鱼露底物，调初始ph为9.12，加入5g混菌(乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1)，接入4.62％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，控温36.2℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养，离心，收集上清液即为鱼露，测定鱼露氨基态氮、总氮和生物胺含量，并对其风味物质进行评价。
[0083]
由图8可知，随着时间的延长，鱼露的发酵过程整体呈先上升后下降的趋势。与空白对照组相比，漳州芽孢杆菌和混菌以及两者同时加入都能够对鱼露的发酵过程产生不同程度的影响，发酵15h时，混菌和两者加入能够明显增加鱼露中氨基态氮含量，而漳州芽孢杆菌对鱼露的发酵没有影响。发酵3d时，漳州芽孢杆菌、混菌以及两者同时加入后的鱼露中的氨氮含量相比对照组都有了明显的增加，其中混菌组的氨氮含量最大为0.9205g/100ml。随着发酵时间的继续增加，漳州芽孢杆菌组和混菌组的氨氮含量下降，而两者同时加入组的氨氮含量继续上升，在发酵7d时达到最大为0.9415g/100ml。发酵7-15d过程中，三组样品的氨氮含量都呈下降趋势，到发酵30d时，氨氮含量急速下降。
[0084]
由图9可知，鱼露中总氮含量随鱼露的发酵时间先缓慢上升，后迅速下降，发酵15h时，混菌组和两者同时加入组增加了鱼露中的总氮含量，但影响作用不大，随着时间的延长，与空白对照组相比，三组样品组中的总氮含量都有了一定增加，发酵7d时，混菌组的总氮含量达到最大为1.279g/100ml，当发酵7-30d时，其总氮含量迅速下降。
[0085]
实施例4虾蛋白肽的制备
[0086]
称取50g粉碎的虾头虾壳作为发酵酶解底物，按料液比为1∶1加入纯化水，调节初始ph为9.12，接入底物9.24％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，于摇床中控温36.2℃，转速150r/min条件下发酵酶解15h。待发酵完成后，于90℃水浴中灭活10min，冷却，离心，收集上清液，浓缩，冻干，即获得虾蛋白肽。并测定虾蛋白肽的总氮含量等指标。结果如图10所示，添加漳州芽孢杆菌种子液与未添加的虾蛋白肽相比，总氮含量增加0.44％，说明添加该菌种有促进蛋白质水解的作用。
[0087]
实施例5海参肽的制备
[0088]
将低值海参沙虫参干加水泡发24h，粉碎，称取50g粉碎的沙虫参作为发酵酶解底物，按料液比为1∶2加入纯化水，调节初始ph为9.12，接入底物9.24％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，于摇床中控温36.2℃，转速150r/min条件下发酵酶解15h。待发酵完成后，于90℃水浴中灭活10min，冷却，离心，收集上清液，浓缩，冻干，即获得沙虫参肽。并测定沙虫参肽的总氮含量、低聚肽含量、分子量等指标。结果如图11所示，添加漳州芽孢杆菌种子液与未添加的沙虫参肽相比，总氮含量增加4.34％，游离氨基酸含量增加0.03％，相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物含量增加0.68％，说明添加该菌种有促进蛋白质水解的作用。
[0089]
实施例6牡蛎肽的制备
[0090]
称取50g粉碎的牡蛎作为发酵酶解底物，按料液比为1∶2加入纯化水，调节初始ph为9.12，接入底物9.24％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，于摇床中控温36.2℃，转速150r/min条件下发酵酶解15h。待发酵完成后，于90℃水浴中灭活10min，冷却，离心，收集上清液，
浓缩，冻干，即获得牡蛎肽。并测定牡蛎肽的总氮含量、低聚肽含量、分子量等指标。结果如图12所示，添加漳州芽孢杆菌种子液与未添加的牡蛎肽相比，总氮含量增加0.07％，游离氨基酸含量增加0.84％，低聚肽含量增加0.36％，说明添加该菌种有促进蛋白质水解的作用。
[0091]
实施例7
[0092]
一种利用漳州芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0093]
1)菌种活化与种子液培养：取冻存管保存的菌种转接于平板培养基中，于37℃恒温培养箱中培养48h，后转接于种子液培养基中，于37℃，150r/min下培养24h。平板培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，琼脂15g/l，ph为7。种子液培养基：酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，ph为7。
[0094]
2)发酵生产：向初始ph为6～10的发酵培养基中接入2～10％(v/v)的种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h。发酵完毕后，离心去除菌体，收集上清液即为液体酶。测定上清液的碱性蛋白酶活力。
[0095]
其中，所述的发酵培养基为酵母提取物5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l。最优发酵条件为种子液接种量6.33％、发酵初始ph为8.47、发酵温度为26.5℃，发酵时间15h，碱性蛋白酶活力达到最大。
[0096]
上述方法在低盐风味速酿鱼露生产中的应用，包括以下步骤：称取蓝圆鲹、巴浪鱼等低值鱼原料，加入等比例原料重量的纯化水和原料重量10％的海盐，粉碎均浆作为发酵生产鱼露底物，调初始ph为6～10，加入不同配比的乳酸菌、酵母菌和清酒曲(乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1，2∶1∶1，2∶1∶2，2∶2∶1，3∶1∶1)，接入2～10％(v/v)的漳州芽孢杆菌种子液，控温20～40℃，摇床转速150r/min条件下发酵培养15h，离心，收集上清液即为鱼露，测定鱼露氨基态氮含量。鱼露生产最优发酵条件为漳州芽孢杆菌种子液接种量4.62％，发酵初始ph为9.12，发酵温度为36.2℃，菌种比例为乳酸菌：酵母菌：清酒曲＝1∶1∶1，鱼露中氨基态氮含量达到最高。
[0097]
上述方法在虾蛋白肽生产中的应用，包括以下步骤：称取虾头虾壳原料，粉碎，加入等比例原料重量的纯化水，作为发酵酶解底物，调初始ph为9，接入5％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，离心，收集上清液，冻干，获得虾蛋白肽，测定虾蛋白肽的分子量。
[0098]
上述方法在海参肽生产中的应用，包括以下步骤：称取已泡发的赤条参、沙虫参等低值海参，粉碎，加入等比例原料重量的纯化水，作为发酵酶解底物，调初始ph为9，接入5％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，离心，收集上清液，冻干，获得海参肽，测定海参肽的分子量。
[0099]
上述方法在牡蛎肽生产中的应用，包括以下步骤：称取牡蛎，粉碎，加入等比例原料重量的纯化水，作为发酵酶解底物，调初始ph为9，接入5％(v/w)的漳州芽孢杆菌种子液，控温36℃，摇床转速150r/min条件下发酵酶解15h，离心，收集上清液，冻干，获得牡蛎肽，测定牡蛎肽的分子量。
[0100]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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