生产戊基二羟基苯酸的方法与流程

2021-02-02 01:02:15|

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[0001]
本发明属于合成生物学领域，涉及生产戊基二羟基苯酸的方法，具体地是涉及重组酿酒酵母生产戊基二羟基苯酸的方法。

背景技术：

[0002]
几千年来大麻由于其药用特性而在全球范围内种植和使用。一些大麻素——大麻的标志性成分，及其类似物针对其潜在的医学应用已被广泛研究。在一些国家，某些大麻素制剂已被批准作为处方药用于治疗各种人类疾病。然而，大麻素的结构复杂性限制了大麻素的批量化学合成。戊基二羟基苯酸(olivetolic acid，oa)是大麻素生物合成途径的初始中间体，当前提高大麻素的方法也包括提高oa的产量，但是现有技术中一般用化学合成法合成oa，化学合成oa成本较高，有机试剂及强酸强碱使用量大，对研究人员造成较大危害，且容易造成环境污染，不利于环境的可持续发展；同时大麻的结构复杂性也限制了oa的批量化学合成。所以，如何产生高产量的大麻素依旧是本领域当前的一大难题。

技术实现要素：

[0003]
据报道，有两种大麻酶，四酮化合物合酶(ols(cannabis sativa tks，cstks)) 和戊基二羟基苯酸环化酶(oac(cannabis sativa oac，csoac))，可以催化己酰基
ꢀ-
coa和丙二酰-coa产生戊基二羟基苯酸。
[0004]
所以，经过多年的研究，发明人发现通过将aae、ols和oac蛋白的编码基因针对宿主(例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))进行密码子优化后，导入宿主可以实现oa(戊基二羟基苯酸，olivetolic acid)的生物合成。
[0005]
具体地，本发明提供以下方面：
[0006]
[1].重组酿酒酵母，其由将aae、ols和oac蛋白的编码基因导入酿酒酵母 (saccharomyces cerevisiae)而制备。其中所述aae全称为endogenous acyl activating enzyme，是内源性酰基活化酶，ols为四酮化合物合酶，oac为戊基二羟基苯酸环化酶，其中
[0007]
所述aae蛋白的编码基因优选来源于烟草(nicotiana tabacum)、荷花(nelumbo nucifera)、胡萝卜(daucus carota subsp.sativus)、大麻(cannabis sativa)、蓖麻(aae-ricinus communis)、苜蓿(medicago truncatula)或苹果(malus domestica)，或是人工合成的，优选地，其来源于烟草；
[0008]
所述ols蛋白的编码基因来源于大麻(cannabis sativa)、玫瑰木属(rhodamnia argentea)、蜜柑(citrus unshiu)、黄瓜(cucumis sativus)、蛇麻籽(humulus lupulus)或落花生(arachis hypogaea)，或是人工合成的，优选地，其来源于玫瑰木属；
[0009]
所述oac蛋白的编码基因来源于大麻(cannabis sativa)、三叶草(trifolium pratense)、羽扇豆(lupinus albus)、大豆(glycine max)或木槿(hibiscus syriacus)，或是人工合成的，优选地，其来源于大麻。
[0010]
[2].项[1]所述的重组酿酒酵母，其中
[0011]
来源于烟草的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示，优选地其编码基因如seq id no：2所示；
[0012]
来源于荷花的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示，优选地其编码基因如seq id no：4所示；
[0013]
来源于胡萝卜的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：5所示，优选地其编码基因如seq id no：6所示；
[0014]
来源于大麻的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：27所示，优选地其编码基因如seq id no：28所示；
[0015]
来源于蓖麻的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：29所示，优选地其编码基因如seq id no：30所示；
[0016]
来源于苜蓿的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：31所示，优选地其编码基因如seq id no：32所示；
[0017]
来源于苹果的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：33所示，优选地其编码基因如seq id no：34所示；
[0018]
来源于玫瑰木属的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：7所示，优选地其编码基因如seq id no：8所示；
[0019]
来源于蜜柑的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：9所示，优选地其编码基因如seq id no：10所示；
[0020]
来源于黄瓜的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：11所示，优选地其编码基因如seq id no：12所示；
[0021]
来源于大麻的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：35所示，优选地其编码基因如seq id no：36所示；
[0022]
来源于蛇麻籽的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：37所示，优选地其编码基因如seq id no：38所示；
[0023]
来源于落花生的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：39所示，优选地其编码基因如seq id no：40所示；
[0024]
来源于大麻的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：13、seq id no：15或 seq id no：17所示(分别对应oac1、oac2、oac1蛋白)，优选地其编码基因分别如seq id no：14、seq id no：16或seq id no：18所示；
[0025]
来源于三叶草的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：41所示，优选地其编码基因如seq id no：42所示；
[0026]
来源于羽扇豆的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：43所示，优选地其编码基因如seq id no：44所示；
[0027]
来源于大豆的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：35所示，优选地其编码基因如seq id no：46所示；
[0028]
来源于木槿的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：47所示，优选地其编码基因如seq id no：48所示。
[0029]
[3].项[1]-[2]中任一项所述的重组酿酒酵母，其中所述aae、ols和oac的编码基因分别独立存在于一个表达盒上，或aae、ols和oac的编码基因中的两个编码基因存在于
一个表达盒上并且第三个编码基因存在于另一个表达盒上，或三个全部存在于一个表达盒上。
[0030]
[4].项[3]所述的重组酿酒酵母，其中所述表达盒包含启动子或含启动子的5
′-
utr 元件、增强子、3
′-
utr元件和/或终止子。
[0031]
[5].项[1]-[4]中任一项所述的重组酿酒酵母，其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母 s288c、酿酒酵母w303、酿酒酵母by4742或酿酒酵母by4741。
[0032]
本发明中的酿酒酵母均可商购，例如购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0033]
在一个实施方案中，所述己酰基-coa也可以通过异源生物合成途径产生。在一个实施方案中，可以在所述重组酿酒酵母基因组中进一步导入富养罗尔斯通氏菌的 rebktb编码基因、贪铜菌吊钩虫的cnpaah1编码基因、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌的cacrt 编码基因和密闭螺旋体的tdter编码基因。
[0034]
[6].项[1]-[5]中任一项所述的重组酿酒酵母，其中所述酿酒酵母的基因组被整合了分别来自富养罗尔斯通氏菌(ralstonia eutropha)、贪铜菌吊钩虫(cupriavidus necator)、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(clostridium acetobutylicum)和密闭螺旋体(treponema denticola) 的β-酮硫解酶(beta-ketothiolase，bktb)、3羟基己二酰基辅酶a脱氢酶 (3-hydroxyadipyl-coa dehydrogenase，paah1)、钙网蛋白(calreticulin，crt)、反烯酰辅酶a还原酶(trans-enoyl-coa reductase，ter)、蛋白的编码基因，优选地所述β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶a脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶a还原酶蛋白的编码基因分别如seq id no：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26所示。优选地上述编码基因通过同源重组于酿酒酵母yorcdelta15整合位点，催化乙酰基coa，经过四步酶的催化产生己酰基coa。优选地所述β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶a 脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶a还原酶蛋白的氨基酸序列分别如seq id no：19、 seq id no：21、seq id no：23、seq id no：25所示。
[0035]
[7].生产戊基二羟基苯酸(oa)的方法，其包括将如项[1]-[5]中任意一项所述的重组酿酒酵母菌进行发酵。
[0036]
在对所述重组酿酒酵母发酵的过程中，可以增加己酰基-coa的供应量来提高oa 的产量，其中增加己酰基-coa的供应量也可以通过额外添加己酸(作为aae(来自大麻的csaae1)的底物)来增加己酰基-coa的供应量。己酸可通过aae转化为己酰基
ꢀ-
coa。
[0037]
[8].项[7]所述的方法，其包括在发酵初始在发酵培养基中添加己酸，其中己酸的终浓度为1mm-10mm，优选5mm。
[0038]
[9].生产戊基二羟基苯酸(oa)的方法，其包括将如项[6]所述的重组酿酒酵母菌进行发酵。
[0039]
在一个实施方案中，发酵过程中所用的培养基为本领域对酿酒酵母发酵常用的培养基，例如由下列物质组成：无氨基氮源、葡萄糖、核苷酸和l型氨基酸。
[0040]
在一个实施方案中，使用本发明的方法后，酿酒酵母中由本身不产生oa转变为产生oa，oa产量约为20-999mg/l。
[0041]
在一个实施方案中，本发明的方法能够稳定地进行oa的生物合成，反应条件温和，不污染环境，特异性好，能够实现结构复杂性大麻素类物质的合成。
[0042]
在一个实施方案中，本发明的重组酿酒酵母具有生长速度快、oa稳定合成且表达
量高的优点，可以通过相对简单的方法条件发酵培养，易于实现并控制，成本低。并可通过额外的途径增加己酸作为底物，增加了己酰基coa的产量，进一步增加了 oa的产量。
[0043]
在一个实施方案中，本发明提供的重组酿酒酵母还可以促进工业规模oa的生产，用于生物制药以及医药化工领域，一般发酵厂的设备和条件均可实现，生产投资较少，具有广阔的实际应用价值及前景。
[0044]
[10].来源于烟草(nicotiana tabacum)、荷花(nelumbo nucifera)、胡萝卜(daucus carota subsp.sahvus)、大麻(cannabis sativa)、蓖麻(aae-ricinus communis)、苜蓿 (medicago truncatula)或苹果(malus domestica)，优选地，来源于烟草的内源性酰基活化酶，
[0045]
来源于大麻(cannabis sativa)、玫瑰木属(rhodamnia argentea)、蜜柑(citrus unshiu)、黄瓜(cucumis sativus)、蛇麻籽(humulus lupulus)或落花生(arachis hypogaea)，优选地，其来源于玫瑰木属的四酮化合物合酶，和
[0046]
来源于大麻(cannabis sativa)三叶草(trifolium pratense)、羽扇豆(lupinus albus)、大豆(glycine max)或木槿(hibiscus syriacus)的戊基二羟基苯酸环化酶
[0047]
在制备戊基二羟基苯酸中的用途，优选地在酿酒酵母中制备戊基二羟基苯酸中的用途。
[0048]
[11].项[10]所述的用途，其中
[0049]
来源于烟草的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示，优选地其编码基因如seq id no：2所示；
[0050]
来源于荷花的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示，优选地其编码基因如seq id no：4所示；
[0051]
来源于胡萝卜的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：5所示，优选地其编码基因如seq id no：6所示；
[0052]
来源于大麻的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：27所示，优选地其编码基因如seq id no：28所示；
[0053]
来源于蓖麻的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：29所示，优选地其编码基因如seq id no：30所示；
[0054]
来源于苜蓿的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：31所示，优选地其编码基因如seq id no：32所示；
[0055]
来源于苹果的所述aae蛋白的氨基酸序列如seq id no：33所示，优选地其编码基因如seq id no：34所示；
[0056]
来源于玫瑰木属的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：7所示，优选地其编码基因如seq id no：8所示；
[0057]
来源于蜜柑的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：9所示，优选地其编码基因如seq id no：10所示；
[0058]
来源于黄瓜的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：11所示，优选地其编码基因如seq id no：12所示；
[0059]
来源于大麻的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：35所示，优选地其编码基因如seq id no：36所示；
[0060]
来源于蛇麻籽的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：37所示，优选地其编码基因如seq id no：38所示；
[0061]
来源于落花生的所述ols蛋白的氨基酸序列如seq id no：39所示，优选地其编码基因如seq id no：40所示；
[0062]
来源于大麻的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如seq id no：13、 seq id no：15或seq id no：17所示，优选地其编码基因分别如seq id no：14、seq id no：16或seq id no：18所示；
[0063]
来源于三叶草的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：41所示，优选地其编码基因如seq id no：42所示；
[0064]
来源于羽扇豆的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：43所示，优选地其编码基因如seq id no：44所示；
[0065]
来源于大豆的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：35所示，优选地其编码基因如seq id no：46所示；
[0066]
来源于木槿的所述oac蛋白的氨基酸序列如seq id no：47所示，优选地其编码基因如seq id no：48所示。
[0067]
[12].如项[10]或[11]所述的用途，其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母s288c、酿酒酵母w303、酿酒酵母by4742或酿酒酵母by4741。
[0068]
本发明为生产天然和非天然大麻素提供了一个平台，这将允许对这些化合物进行更严格的研究，并可用于开发各种人类健康问题的治疗方法。
附图说明
[0069]
图1显示了现有技术中预测的合成戊基二羟基苯酸的生物合成途径。
[0070]
图2显示实施例1所构建的重组酿酒酵母a的菌株形态照片。
[0071]
图3显示液相检测图。其中
[0072]
图3a显示oa对照品溶液的色谱图，对照品为1000mg/l、100mg/l、50mg/l 的oa对照品溶液，出峰时间为2.68min；
[0073]
图3b显示1000mg/l oa对照品溶液、样品1及样品2的拟合色谱图。
[0074]
图4显示实施例3所构建的重组酿酒酵母b的菌株形态照片。
[0075]
图5显示1000mg/l oa对照品溶液、样品3及样品4的拟合色谱图。
[0076]
图6显示1000mg/l oa对照品溶液、样品5及样品6的拟合色谱图。
[0077]
图7显示100mg/l oa对照品溶液、样品7及样品8的拟合色谱图。
[0078]
图8显示不同物种来源的aae基因活性比较，以大麻物种中ols和oac1基因作为固定因素，比较不同来源aae基因催化产生oa的产量差异来表征aae基因催化活性。
[0079]
图9显示不同物种来源的ols基因活性比较，以大麻物种中aae和oac1基因作为固定因素，比较不同ols基因催化产生oa的产量差异来表征ols基因催化活性。
[0080]
图10显示不同物种来源的oac基因活性比较，以大麻物种中aae和ols基因作为固定因素，比较不同oac基因催化产生oa的产量差异来表征oac基因催化活性。
[0081]
图11显示bktb、paah1、crt、ter基因在酿酒酵母by4741中的整合位点图谱。
具体实施方式
[0082]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0083]
实施例1：构建重组酿酒酵母a
[0084]
将aae基因构建于ycplac22酵母表达载体(购自biovector中国质粒基因库)， ols和oac基因构建于ycplac33载体(购自biovector中国质粒基因库)，形成载体 y22-aae-leu和y33-ols(cstks)-oac-ura，将这两个载体共转染至酿酒酵母 s288c(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)中，得到重组酿酒酵母a。
[0085]
所述重组酿酒酵母a在ypd平板上为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐，如图2(包含正面和背面)，最适生长温度为30℃，ph为6.5。
[0086]
所述aae、ols和oac基因的核苷酸序列依次如源自烟草的seq id no：2、源自玫瑰木属的seq id no：8、源自大麻的seq id no：14所示。
[0087]
实施例2：oa产量检测
[0088]
1、菌种活化扩大培养
[0089]
将实施例1得到的重组酿酒酵母a试管斜面保存，使用前需要将试管内保存的菌种接种到cm-his-leu-ura平板培养基中活化，扩大培养。
[0090]
2、液体发酵培养
[0091]
液体发酵培养基配方为：(液体1l)6.7g ynb(yeast nitrogen base without aminoacids)，20g葡萄糖，0.84g dropout powder，0.05g腺嘌呤，0.1g色氨酸，余量为水的体积，ph调至5.6。250ml三角瓶，每瓶装100ml液体培养基，121℃，0.12-0.17mpa。 30min灭菌备用，以重量百分比计。
[0092]
挑取平板培养基中单菌落，接种到三角瓶液体培养基中，再额外添加己酸，至终浓度5mm，置于摇床，30℃，220rpm培养(此处的培养等同于发酵，在小瓶中称为培养，在发酵罐中则称为发酵)120h，同时以相同的条件发酵未添加外源基因的酿酒酵母s288c。
[0093]
3、oa液相检测，包括如下步骤：
[0094]
1)对照品溶液的制备：精密称取oa 5mg(购自上海源叶生物科技有限公司)，用加色谱级甲醇溶解并稀释，即得1000mg/l、100mg/l、50mg/l的oa对照品溶液。
[0095]
2)样品溶液的制备：准确量取10ml od600约为7-8的液体发酵后的的重组酿酒酵母a的培养基，加入2ml乙酸乙酯，振荡10min。静置待液体分层后，吸取1ml上层溶液，在真空旋转蒸发仪中，60℃蒸干。使用100μl甲醇溶解获得的干物质，12000rpm，离心20min，取上清，即得样品1，针对未添加外源基因的酿酒酵母s288c，以与获得样品1相同的过程处理，得到样品2。
[0096]
3)将样品1、2以及oa对照品溶液分别进行色谱层析。色谱条件：使用c18柱，流动相为a：1
‰
甲酸、b：甲醇，进样量10μl，流速0.25ml/min，检测波长280nm，柱温30℃。
[0097]
4)梯度洗脱样品组方法如表1：(a为1
‰
甲酸、b为甲醇)
[0098]
表1oa液相梯度洗脱样品组方法
[0099]
[0100][0101]
5)检测结果如图3所示：
[0102]
由图3a-图3b可知，样品1和对照品出峰时间均为2.68min，一致，说明样品1 确实产出了oa；
[0103]
由图3b可知，在其他条件均相同时，未添加外源基因的s288c酿酒酵母的样品2 在2.68min处未出峰，说明没有产出oa，添加了外源基因的s288c酿酒酵母的样品1 峰面积为9225，约为850mg/l，说明外源基因的导入是s288c酿酒酵母酵母产oa的原因。
[0104]
实施例3：重组酿酒酵母b的构建和oa产量检测
[0105]
将aae基因构建于ycplac22酵母表达载体，ols基因构建于ycplac33酵母表达载体，oac基因构建于prs427-lys酵母表达载体(购自biovector ntcc典型培养物保藏中心)，形成载体y22-aae-leu和y33-ols(cstks)-ura，prs427-lys-oac将这三个载体共转染至酿酒酵母w303(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)中，得到重组酿酒酵母b。
[0106]
所述重组酿酒酵母b在ypd平板上为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐，如图4(包含正面和背面)，最适生长温度为30℃，ph为6.5。
[0107]
所述aae、ols和oac基因的核苷酸序列依次如源自胡萝卜的seq id no：6、源自黄瓜的seq id no：12、源自大麻的seq id no：16所示。
[0108]
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的重组酿酒酵母b的培养上清为样品 3，未添加外源基因的酿酒酵母w303的培养上清为样品4并测定oa产量，不同之处仅在于，添加己酸至终浓度1mm。检测结果如图5所示。
[0109]
由图5可知，样品3和对照品oa出峰时间均为2.68min，一致，说明样品3与样品4相比，确实产出了oa；
[0110]
由图5可知，在其他条件均相同时，未添加外源基因的样品4在2.68min处没有出峰，说明没有产出oa，添加了外源基因的样品3峰面积为217，约为20mg/l，说明外源基因的导入是酿酒酵母w303产oa的原因。
[0111]
实施例4：重组酿酒酵母c的构建及其oa产量检测
[0112]
将aae基因、ols基因和oac基因均构建于ycplac22酵母表达载体，形成载体 ycplac22-aae-ols-oac将这个载体共转染至酿酒酵母by4742(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)中，得到重组酿酒酵母c。
[0113]
所述aae、ols和oac基因的核苷酸序列依次如源自荷花物种的seq id no：4、源自蜜柑物种的seq id no：10、源自大麻物种的seq id no：18所示。
[0114]
所述重组酿酒酵母c在ypd平板上为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐，最适生长温度为30℃，ph为6.5。
[0115]
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的重组酿酒酵母c的培养上清为样品 5，未添加外源基因的酿酒酵母by4742的培养上清为样品6)并测定oa产量，不同之处仅在于，添加己酸至终浓度10mm。
[0116]
检测结果如图6所示，样品5和对照品出峰时间一致，说明样品5确实产出了oa。
[0117]
在其他条件均相同时，未添加外源基因的样品6在对照品出峰的位置没有出峰，说明没有产出oa，添加了外源基因的样品5峰面积为379，约为35mg/l，说明外源基因的导入是酿酒酵母w303产oa的原因，同时，不同己酸浓度会对酵母的oa产量有影响。
[0118]
实施例5重组酿酒酵母d的构建及其oa产量检测
[0119]
重组酿酒酵母的构建过程与实施例1相同，不同之处在于，上述重组酿酒酵母为 by4741(购自上海唯地生物技术有限公司)，另外在菌株构建时候，在酿酒酵母by4741 整合位点yorcdelta15，以yorcdelta15为同源臂，用同源重组和醋酸锂转化的方法，整合分别来自富养罗尔斯通氏菌、贪铜菌吊钩虫、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌和密闭螺旋体的bktb、paah1、crt、ter基因(如图11)，这四个基因的编码序列分别如序列seq idno：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26所示。此四个基因可以通过催化乙酰基coa，产生己酰基coa。得到重组酿酒酵母d。
[0120]
所述重组酿酒酵母d在ypd平板上为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐，最适生长温度为30℃，ph为6.5。
[0121]
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的酿酒酵母d的培养上清为样品7，未添加外源基因的酿酒酵母by4741的培养上清为样品8)并测定oa产量。
[0122]
检测结果见图7，样品7和对照品出峰时间均为2.68min，一致，说明样品7确实产出了oa。
[0123]
在其他条件均相同时，未添加外源基因的样品8在对照品出峰的位置没有出峰，添加了外源基因的样品7峰面积为10842，约为999mg/l，说明外源基因的导入是酿酒酵母by4741产oa的原因，并且整合四个基因之后的菌株的oa产量会更高。
[0124]
实施例6aae基因不同物种来源的功能比较
[0125]
生产aae的主要物种有大麻、烟草、荷花、胡萝卜、蓖麻(aae-ricinus communis)、苜蓿(medicago truncatula)、苹果(malus domestica)，各物种对应的aee的氨基酸序列分别为
[0126]
seq id no：27、seq id no：1、seq id no：3、seq id no：5、seq id no：29、 seq id no：31、seq id no：33，将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优化，得到各自的优化后的编码核酸序列分别为
[0127]
seq id no：28、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：30、 seq id no：32、seq id no：34。
[0128]
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同，不同之处在于，以大麻中ols和oac1 基因作为固定因子，将上述不同来源的aae基因插入ycplac22酵母表达载体，在酵母by4741中表达，来比较不同aae基因催化作用下，产出oa的产量的区别，见图 8。可见催化产生oa的优选的aae基因来源为烟草。
[0129]
实施例7ols基因不同物种来源的功能比较
[0130]
生产ols的主要物种有大麻、玫瑰木属、蜜桔、黄瓜、蛇麻籽(humulus lupulus)、落花生(arachis hypogaea)，的氨基酸序列分别为各物种对应的ols的氨基酸序列分别为seq id no：35、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：37、 seq id no：39，将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优化，得到各自的优化后的编码核酸序
列分别为seq id no：36、seq id no：8、seq id no：10、seq idno：12、seq id no：38、seq id no：40。
[0131]
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同，不同之处在于，以大麻中aae和oac1 基因作为固定因子，将上述不同来源的ols基因插入ycplac33酵母表达载体，在酿酒酵母by4741中表达，来比较不同ols基因催化作用下，产出oa的产量的区别，见图9，可见催化产生oa的优选的ols基因来源为玫瑰木属。
[0132]
实施例8oac基因不同物种来源的功能比较
[0133]
生产oac的主要物种有大麻(大麻中有三个oac1，oac2，oac3，在图中对应指示为大麻1、大麻2、大麻3)、三叶草(trifoliium pratense)、羽扇豆(lupinus albus)、大豆(glycine max)、木槿(hibiscus syriacus)，各物种对应的ols的氨基酸序列分别为 seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17、seq id no：41、seq id no：43、 seq id no：45、seq id no：47，将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优化，得到各自的优化后的编码核酸序列分别为seq id no：14、seq id no：16、seq idno：18、seq id no：42、seq id no：44、seq id no：46、seq id no：48。
[0134]
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同，不同之处在于，以大麻中ols和aae 基因作为固定因子，将上述不同来源的oac基因插入prs427-lys酵母表达载体，在酵母by4741中表达，来比较不同oac基因催化作用下，产出oa的产量的区别，见图10，可见催化产生oa的优选的oac基因来源为大麻。
[0135]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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