一种索玛鲁肽的纯化方法与流程

[0001]
本领域涉及一种肽的纯化方法，特别涉及索玛鲁肽的纯化方法。
技术背景
[0002]
索玛鲁肽，英文名称为semaglutide，是由丹麦诺和诺德公司开发生产的一种新型长效胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，用于治疗ii型糖尿病。索玛鲁肽具有降血糖、减肥和保护心血管的功效，已于2017年10月18日被fda建议批准上市。索玛鲁肽的lys侧链经peg、glu和十八碳二羧酸修饰后，亲水性大大提高、与白蛋白的结合力增强；同时n端第2位的ala突变为aib后，有效的避免了被dpp-iv酶解而失活，半衰期达到40h，患者每周只需注射一次，目前该药物的口服剂型也正在研制当中。索玛鲁肽的cas号为910463-68-2，分子式为c187h291n45o59，分子量为4113.64g/mol，肽序列为：
[0003]
h-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(octadecanedioic-γ-glu-aeea-aeea)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh。
[0004]
索玛鲁肽的肽链较长、支链结构复杂，在合成过程中产生的杂质多，其中索玛鲁肽中的his1极易消旋，产生的d-his1杂质物理和化学性质与索玛鲁肽极其相似，因此需要对索玛鲁肽粗肽进行纯化。然而现有的技术纯化效果差，并不足以将索玛鲁肽杂质控制在单杂0.1％以下，且未对此主要杂质d-his1杂质进行针对性的控制策略。因此，需要探索一种索玛鲁肽的纯化方法，以提高索玛鲁肽的纯度，并且操作简便，有利于实现索玛鲁肽的规模化制备。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是针对现有的技术不足，提供一种纯化索玛鲁肽的方法，使单杂降低到0.1％以下，同时解决索玛鲁肽d-his1杂质纯化的问题。为了实现该目的，本发明提供的索玛鲁肽的纯化方法如下：
[0006]
步骤1：将索玛鲁肽粗品溶于稀氨水中，得到索玛鲁肽粗品溶液，将粗品溶液于45～50℃水中水浴1～2h后用0.45μm过滤，收集滤液；
[0007]
步骤2：取上述滤液，以反相硅胶填料为固定相，以氨水调节ph至7～9的盐溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到索玛鲁肽一次纯化溶液；
[0008]
步骤3：取索玛鲁肽一次纯化溶液，以反相硅胶填料为固定相，以磷酸调节ph至2～3的盐溶液为流动相a，乙腈和异丙醇的混合溶液为流动相b，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸去除部分溶剂，得到索玛鲁肽二次纯化溶液；
[0009]
步骤4：取索玛鲁肽二次纯化溶液，以反相硅胶填料为固定相，以碳酸氢铵的水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱，收集馏分，旋蒸、冻干，得到索玛鲁肽的无盐精肽。
[0010]
其中，反相硅胶填料优选为八烷基键合硅胶填料。
[0011]
八烷基键合硅胶柱对索玛鲁肽及其杂质有较优的选择性。
[0012]
优选地，步骤2、3中的旋蒸参数为：25～35℃，真空度≤30mba，步骤4中的旋蒸参数为：25～35℃，真空度≤20mba。
[0013]
温度越高，旋蒸效率越高，索玛鲁肽属于多肽化合物，在35℃以下旋蒸相对稳定，因此选择旋蒸温度25～35℃。
[0014]
步骤1中的稀氨水浓度优选为1％～5％，磷酸调节ph至7.5～9。作为更优选方案，稀氨水浓度为2％，磷酸调节ph至8.0～8.5。
[0015]
索玛鲁肽在酸性条件中，溶解度较低，在1％～5％氨水易溶解，同时，粗品溶液在弱碱性条件下，既保证样品的溶解度，也保护了八烷基键合硅胶固定相。
[0016]
步骤2中的盐溶液优选20～100mm/l的氯化铵溶液，进一步优选为50mm/l的氯化铵溶液，同时采用氨水调节ph为8.5；洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0017]
该步骤除去了大部分较易去除的合成工艺杂质，使样品纯度在一步纯化后达到90％以上。
[0018]
步骤3中的盐溶液优选20～100mm/l的磷酸盐溶液，进一步优选为50mm/l的磷酸二氢钾溶液，同时采用磷酸调节ph为2.6；流动相b为乙腈：异丙醇＝7:3～9:1，作为更优选方案，流动相b为乙腈：异丙醇＝7:3；洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0019]
在流动相a的ph＝2.6的条件下，d-his1杂质有较好的分离，同时，ph＝2.6又略小于索玛鲁肽的等电点，使其又有一定的溶解度，有利于纯化。并且，磷酸盐对索玛鲁肽及其d-his1杂质有较好的分离效果。流动相b加入异丙醇能提高分离效果，降低索玛鲁肽在八烷基键合硅胶柱上的残留，此步骤能使索玛鲁肽的纯度达99.0％以上。
[0020]
步骤4中盐溶液优选为10～50mm/l碳酸氢铵溶液，进一步优选为20mm/l碳酸氢铵溶液，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0021]
索玛鲁肽用碳酸氢铵进行离子置换后，其溶液中的碳酸氢根和铵根离子极不稳定，在真空干燥条件下，降解为二氧化碳及氨气后去除，使样品转化为无盐形式，避免索玛鲁肽醋酸盐水溶性差等问题。此步骤能使索玛鲁肽的纯度达99.5％以上，同时控制单杂在0.1％以下。
附图说明
[0022]
图1为实施例4中索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图
[0023]
图2为实施例4中索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图放大图
[0024]
图3为实施例4中索玛鲁肽一次纯化溶液的hplc谱图
[0025]
图4为实施例4中索玛鲁肽一次纯化溶液的hplc谱图放大图
[0026]
图5为实施例4中索玛鲁肽二次纯化溶液的hplc谱图
[0027]
图6为实施例4中索玛鲁肽二次纯化溶液的hplc谱图放大图
[0028]
图7为实施例4中索玛鲁肽三次纯化溶液的hplc谱图
[0029]
图8为实施例4中索玛鲁肽三次纯化溶液的hplc谱图放大图
具体实施方式
[0030]
本发明公开了一种索玛鲁肽的纯化方法。本领域技术人员可以参本文内容，实施该方法，特別需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的纯化方法已经通过较佳的实施例进行了描述相关人员明显能在脱离本发明内容范围内对本发明进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031]
实施例1
[0032]
(1)样品预处理：
[0033]
取索玛鲁肽粗品2.0g(约含索玛鲁肽0.8g)样品溶于1％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为7.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0034]
(2)一步纯化：
[0035]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：20mm/l氯化铵，氨水调ph＝7的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.8g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0036]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0037]
(3)二步纯化：
[0038]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：20mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝3的水溶液，流动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.63g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0039]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0040]
(4)三步纯化：
[0041]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：10mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.45g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0042]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0043]
(5)冷冻、干燥
[0044]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.41g，收率为51％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0045]
实施例2
[0046]
(1)样品预处理：
[0047]
取索玛鲁肽粗品2.7g(约含索玛鲁肽1.08g)样品溶于5％的氨水溶液中，完全溶解
后用磷酸调节溶液的ph为9，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0048]
(2)一步纯化：
[0049]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：100mm/l氯化铵，氨水调ph＝9的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1.08g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0050]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0051]
(3)二步纯化：
[0052]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：100mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝2的水溶液，流动相b：90％乙腈+10％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.85，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0053]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0054]
(4)三步纯化：
[0055]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.57g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0056]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0057]
(5)冷冻、干燥
[0058]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.53，收率为49％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0059]
实施例3
[0060]
(1)样品预处理：
[0061]
取索玛鲁肽粗品2.3g(约含索玛鲁肽0.92g)样品溶于2％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0062]
(2)一步纯化：
[0063]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l氯化铵，氨水调ph＝8的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.92g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0064]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0065]
(3)二步纯化：
[0066]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝3的水溶液，流动相b：80％乙腈+20％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.73g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0067]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0068]
(4)三步纯化：
[0069]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：30mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.53g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0070]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0071]
(5)冷冻、干燥
[0072]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.48g，收率为52％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0073]
实施例4
[0074]
(1)样品预处理：
[0075]
取索玛鲁肽粗品2.5g(约含索玛鲁肽1g)样品溶于2％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图见图1，索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图放大图见图2，谱图数据见表1。
[0076]
表1索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图数据
[0077]
detector a 215nm
[0078]
peak#ret.timeareaheightarea％tailing factorresolutionnumber of theoretical plate17.67138156840.10
------
27.7881771517810.46
----
681937.9331085411450.28
------
48.413162695177774.19
----
1601358.5462800158400.72
------
69.1081168711330.30
----
1474879.5317795344012.01
--
1.064593189.8344682542641.20
--
0.70911845910.0862909924350.75
--
0.61980071010.4424642238321.19
--
0.878134891110.7647470657001.92
--
0.896142551211.1188935469982.30
--
1.012172521311.4837087153341.82
--
0.61629441411.6883815553590.98
------
1511.934256435326888765.980.998
--
35635
1612.3245081539981.31
--
0.73737331712.6469755083262.51
--
0.590315171813.1541499915210.39
------
1913.3669777383502.52
----
277352013.5211273520880.33
------
2114.1381682822750.43
------
[0079]
续表1索玛鲁肽粗品溶液的hplc谱图数据
[0080]
peak#ret.timeareaheightarea％tailing factorresolutionnumber of theoretical plate2214.3629339650202.40
----
123482314.69236104360.09
--
0.35018452414.90554345100.14
--
0.255385292515.46133113480.090.9681.945530162616.2101259011970.321.1142.710521872717.0108778777852.261.1722.734511062817.4942355215540.61
--
1.411329802917.92182208090.21
--
1.219515483018.2094149741351.07
--
0.679187963118.3654386538601.13
--
0.2469781total 3886463387782100.00
ꢀꢀꢀ
[0081]
(2)一步纯化：
[0082]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l氯化铵，氨水调ph＝8.5的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0083]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。索玛鲁肽一次纯化溶液的hplc谱图见图3，索玛鲁肽一次纯化溶液的hplc谱图放大图见图4，谱图数据见表2。
[0084]
表2索玛鲁肽一次纯化溶液的hplc谱图数据
[0085]
detector a 215nm
[0086]
peak#ret.timeareaheightarea％tailing factorresolutionnumber of theoreticalplate18.38912211340.04
----
1860729.25628882110.10
--
2.637808139.6842931729360.97
--
1.27622300410.1752471224210.82
--
1.89624784510.5381829515890.61
--
0.6932858610.982285009633231694.430.9320.86935624711.4318415594812.79
--
1.90336624811.63859864110.20
------
912.38716531390.05
----
21910total 3018323349639100.00
ꢀꢀꢀ
[0087]
(3)二步纯化：
[0088]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝2.6的水溶液，流
动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.83g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0089]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。索玛鲁肽二步纯化溶液的hplc谱图见图5，索玛鲁肽二步纯化溶液的hplc谱图放大图见图6，谱图数据见表3。
[0090]
表3索玛鲁肽二次纯化溶液的hplc谱图数据
[0091]
datector a 215nm
[0092]
peak#ret.timeareaheightarea％tailing factorresolutionnumber of theoretical plate19.136777830.11
----
1976629.281148340.02
--
0.421755739.692312320.04
--
1.19321726410.2167058828380999.741.0362.13432191510.920577530.08
--
1.5394041total 70769684011100.00
ꢀꢀꢀ
[0093]
(4)三步纯化：
[0094]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：20mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.61g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0095]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。索玛鲁肽三步纯化溶液的hplc谱图见图7，索玛鲁肽三步纯化溶液的hplc谱图放大图见图8，谱图数据见表4。
[0096]
表4索玛鲁肽二次纯化溶液的hplc谱图数据
[0097]
detector a 215nm
[0098]
peak#ret.timeareaheightarea％tailing factorresolutionnumber of theoretical plate19.161436520.05
----
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--
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--
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--
2.63532105total 96559411480710000
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[0099]
(5)冷冻、干燥
[0100]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.56g，收率56％。
[0101]
实施例5
[0102]
(1)样品预处理：
[0103]
取索玛鲁肽粗品3.0g(约含索玛鲁肽1.2g)样品溶于5％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为9，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为
索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0104]
(2)一步纯化：
[0105]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：80mm/l氯化铵，氨水调ph＝9的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1.2g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0106]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0107]
(3)二步纯化：
[0108]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：20mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝3的水溶液，流动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.96g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0109]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0110]
(4)三步纯化：
[0111]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.67g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0112]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0113]
(5)冷冻、干燥
[0114]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.61g，收率为51％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0115]
实施例6
[0116]
(1)样品预处理：
[0117]
取索玛鲁肽粗品2.8g(约含索玛鲁肽1.12g)样品溶于5％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为9，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0118]
(2)一步纯化：
[0119]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：100mm/l乙酸铵，氨水调ph＝9的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1.12g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0120]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0121]
(3)二步纯化：
[0122]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：100mm/l磷酸二氢钠，磷酸调ph＝2的水溶液，流动相b：90％乙腈+10％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.87g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0123]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0124]
(4)三步纯化：
[0125]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.57g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0126]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0127]
(5)冷冻、干燥
[0128]
将得到的三部纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.53g，收率为47％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0129]
实施例7
[0130]
(1)样品预处理：
[0131]
取索玛鲁肽粗品2.5g(约含索玛鲁肽1g)样品溶于2％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0132]
(2)一步纯化：
[0133]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l乙酸铵，氨水调ph＝8.5的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0134]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0135]
(3)二步纯化：
[0136]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/磷酸二氢钠，磷酸调ph＝2.6的水溶液，流动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.77g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0137]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0138]
(4)三步纯化：
[0139]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：20mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波
长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.53g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0140]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0141]
(5)冷冻、干燥
[0142]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.48g，收率为48％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0143]
实施例8
[0144]
(1)样品预处理：
[0145]
取索玛鲁肽粗品2.4g(约含索玛鲁肽0.96g)样品溶于4％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0146]
(2)一步纯化：
[0147]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：70mm/l硫酸铵，氨水调ph＝8的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.96g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0148]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0149]
(3)二步纯化：
[0150]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：85mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝3的水溶液，流动相b：75％乙腈+25％异丙醇；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.73g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0151]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0152]
(4)三步纯化：
[0153]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：30mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.52g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0154]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0155]
(5)冷冻、干燥
[0156]
将得到的三部纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽0.47g，收率为49％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0157]
实施例9
[0158]
(1)样品预处理：
[0159]
取索玛鲁肽粗品25g(约含索玛鲁肽10g)样品溶于2％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0160]
(2)一步纯化：
[0161]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为100*250mm。流动相a：50mm/l氯化铵，氨水调ph＝8.5的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为220ml/min，上样量为10g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0162]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0163]
(3)二步纯化：
[0164]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为100*250mm。流动相a：50mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝2.6的水溶液，流动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为220ml/min，上样量为8.35g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0165]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0166]
(4)三步纯化：
[0167]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为100*250mm。流动相a：20mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为220ml/min，上样量为6.12g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0168]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0169]
(5)冷冻、干燥
[0170]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽5.71g，收率57％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0171]
实施例10
[0172]
(1)样品预处理：
[0173]
取索玛鲁肽粗品50g(约含索玛鲁肽20g)样品溶于2％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的ph为8.5，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0174]
(2)一步纯化：
[0175]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为150*250mm。流动相a：50mm/l氯化铵，氨水调ph＝8.5的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为400ml/min，上样量为20g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0176]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba
以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0177]
(3)二步纯化：
[0178]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为150*250mm。流动相a：50mm/l磷酸二氢钾，磷酸调ph＝2.6的水溶液，流动相b：70％乙腈+30％异丙醇；检测波长为230nm，流速为400ml/min，上样量为16.21g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0179]
收集纯度大于99.0％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0180]
(4)三步纯化：
[0181]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行三步纯化，色谱条件：制备色谱柱：八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为150*250mm。流动相a：20mm/l碳酸氢铵水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为400ml/min，上样量为11.46g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0182]
收集纯度大于99.5％，单杂小于等于0.1％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽三步纯化样品溶液。
[0183]
(5)冷冻、干燥
[0184]
将索玛鲁肽三步纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的索玛鲁肽无盐精肽10.79g，收率54％(各步骤样品溶液的hplc谱图与实施例4相似)。
[0185]
对比例
[0186]
(1)样品预处理：
[0187]
取索玛鲁肽粗品2.5g(约含索玛鲁肽1g)样品溶于60％的乙腈水溶液中，完全溶解，后于45℃～50℃中水浴1～2h，用0.45um滤膜过滤，收集滤液为索玛鲁肽粗品水溶液备用。
[0188]
(2)一步纯化：
[0189]
将索玛鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l碳酸氢钠，氨水调ph＝6.5的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为1g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～26％；5～120min：b％为26％～46％。
[0190]
收集纯度大于90％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽一步纯化样品溶液。
[0191]
(3)二步纯化：
[0192]
将索玛鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：50mm/l硫酸钾，磷酸调ph＝3的水溶液，流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.55g，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～45％；5～120min：b％为45％～70％。
[0193]
收集纯度大于95％，单杂小于等于0.4％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在30mba以下除去部分乙腈，得到索玛鲁肽二步纯化样品溶液。
[0194]
(4)转盐：
[0195]
将索玛鲁肽二步纯化样品溶液进行转盐，色谱条件：制备色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相a：水；流动相b：乙腈；检测波长为230nm，流速为25ml/min，上样量为0.31g；先用含5％乙腈的50mm/l乙酸铵溶液(ph＝7.0)冲洗15min；最后用梯度洗脱，洗脱梯度为：0～5min：b％为10％～25％；5～60min：b％为25％～45％。
[0196]
收集纯度大于98.5％，单杂小于等于0.2％的索玛鲁肽馏分样品，用水浴温度为28～30℃，真空度在20mba以下除去乙腈和大部分水。得到索玛鲁肽转盐样品溶液。
[0197]
(5)冷冻、干燥
[0198]
将得到的三部纯化样品溶液进行冷冻、干燥，得到纯度大于98.5％，单杂大于0.1％，索玛鲁肽醋酸盐精肽0.25g，收率25％。

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