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起点商标网 专利名称：氨基胆固醇的制法的制作方法
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本发明涉及(25R)-26-氨基胆固醇的制备方法，(25R)-26-氨基胆固醇是胆固醇生物合成的有效抑制剂。
胆固醇是动物组织的主要类固醇成分，也是血浆和几乎所有细胞膜的正常成分。胆固醇是一种带活性羟基的疏水的烃化合物。它是在C-17位置上带有脂族侧链的3-羟基固醇(具有全氢-1，2-环戊烯基菲环骨架)。理论上，胆固醇通过在膜的磷脂之间形成一插入结构，从而在调节细胞膜的透过性和流动性方面起重要作用。
胆固醇可从饮食中获取，或在肝中合成。如果需要，也可在细胞中制造，但实际上大多数细胞是从外部接受胆固醇。胆固醇的合成是酶催化的生物合成，其中，限制酶的速率的被认为是羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG CoA reductase)。例如参见Javitt，美国专利4，427，668号。此酶催化由羟甲基戊二酸生成胆固醇前体二羟基甲基戊酸。理论上，通过用HMG CoA还原酶干扰可以调节胆固醇的产生。
Goodman & Gilman，“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”7th Ed.，MacMillan(New York1985)，pp.841-843;Kandustsch et al.，Science，201，498(1978).
胆固醇过量累积已被认为是许多疾病的主要诱发因素。特别是高浓度的胆固醇能引起和/或加速动脉粥样硬化，后者的特征是由于脂肪物质(包括胆固醇)的累积和沉积，动脉壁呈现不正常的硬化和变厚。这又导致血栓和血块生成。关于胆固醇有关的病理，请参见“Hormones and Metabolic Control，”D.A.White，B.Middleton，and M.Baxter，editors;Edward Arnold Publisher;London，1984，pages 73-90.
最近用于抑制胆固醇合成的药物主要作用于肝脏。其功能主要引起肝脏的LDL(低密度脂蛋白)感受器的向上调节，以增加肝对胆固醇的吸收，降低血清水平，或阻抑HMG CoA还原酶，从而降低胆固醇的生成。
最近使用的药物的代表有mevinolin和消胆胺。这些药物能引起肝中LDL感受器的向上调节。mevinolin是一种HMG CoA还原酶的变构抑制剂，通过抑制肝脏中胆固醇的合成而完成这一调节效应。这模拟肝脏中增加LDL感受器活性，引起肝对胆固醇的吸收，从而使血浆中胆固醇的降低。消胆胺提高了肝脏中由胆固醇合成胆汁酸的需要，对某些人来说，这会产生LDL感受器的向上调节，这样下去，降低了血清中的胆固醇。因此，这两种化合物的主要作用限于肝脏。这些已知化合物对肝脏外的细胞不产生明显效果。应用所知化合物以肝脏为目标的战略是有效的，因为和其它细胞不同，肝细胞可专一地将胆固醇代谢(和除去)成胆汁酸。实际上，像mevinolin这样的化合物，如果以肝脏外细胞为目标，会对组织中胆固醇的累积有害。因为该化合物能向上调节LDL感受器，并引起，而不是降低胆固醇的累积。
另一种周知的化合物是26-羟基胆固醇，此化合物是美国专利4，427，668号的讨论主题。参见Javitt et al.，(1981)J.Biol.Chem，Vol.256(24)，pages 12644-12646;Brooks et al.，(1983)Biochem Soc.Trans.，Vol.11，pages 700-701;Koopman et al.，(1987)J.Chromatoqr.，Vol.416，pages 1-13;Esterman et al.，(1983)J.Lipid Res.，Vol.24，pages 1304-1309;and Taylor et al.，(1984)J.Biol.Chem.，Vol.259(20)，pages 12382-12387.
26-羟基胆固醇是胆汁酸的中间体，据说它可调节细胞的胆固醇的体内平衡。为评述26-羟基胆固醇的生物效应，参见Javitt，N.B.(1990)J.Lipid Res.Vol31，Pages1527-1533。在文献中已报导了制备26-羟基胆固醇的合成方法。参见Tschesche et al.(1979)Chem Ber.，Vol.112，Pages2680-2691和Seo et al.(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans，I.Pages411-416。所讨论的方法常涉及苛刻的多步反应，羟基类固醇的产量也低。
26-氨基胆固醇被认为是LDL感受器的有效的向下调节剂和体外胆固醇生物合成的抑制剂，比羟基中间体具有相等或更大的生物效应。参见Miao et al.(1988)Biochem.J.Vol255，Pages1049-1052和美国专利4，939，134号(′134专利)。这些资料作为本文的参考资料。此化合物可选择性地抑制和降低LDL结合在人的成纤维细胞上，同时对人肝癌(HepG2)细胞很少或无影响。此外还发现，此化合物可通过非肝细胞调低胆固醇的合成。
制备(25R)-26-氨基胆固醇的合成方法已有报导。例如，Miao等人(1988)和′134专利讨论了通过26-叠氮基胆固醇3-醋酸酯的锂铝化氢还原，制备26-氨基胆固醇。Tschesche et al.(1979)Chem.Ber.，Vol.112，Pages2680-2691，讨论了26-苯二酰亚胺基胆固醇的制备，及其加氢转化成(25R)-26-氨基胆固醇。然而，这些方法制备氨基类固醇，需要26-羟基胆固醇作原料，使用复杂的保护和脱保护反应，以及所希望的产品产率低。
Klimova等人，(1982)Khim.Pharm.Zh.，Vol.16，Page451，讨论了从水解羟基茄碱制备胆固醇的26-乙酰基氨基类似物。水解羟基茄碱是一种植物生物碱，为薯蓣皂苷配基(diosgenin)的氨基类似物。根据讨论的方法，将由O，N-二酰基化的水解羟基茄碱氧化得到的3β-乙酰氧-26-乙酰氨基16，22二酮进行克莱门森还原，还原剂用活化的锌汞合金。反应得到一个混合物，主要产品是26-氨基胆固醇-5烯-22酮的二乙酰基衍生物，副产品是26-氨基胆固醇。因为26-氨基胆固醇的产率低，此公开了的反应还适用于制备氨基类固醇化合物。至今，尚未发现高产率的制备26-氨基胆固醇的方法。
现在已经意外地发现，(25R)-26-氨基胆固醇可以直接由简单的中间体高产率地制得，这就避免了用26-羟基胆固醇作原料，并避免了采用保护基反应。
本发明提供通过肼还原反应，例如Wolff-Kishmer反应，直接由(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)制备(25R)-26-氨基胆固醇(1)。肼还原反应同时还原16-氧部分，并断裂苯二酰亚氨基。流程1和流程2说明由(25R)-26-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)制备(25R)-26-氨基胆固醇(1)的方法。
按照流程1，由薯蓣皂苷配基一步制成的(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)在C-26羟基同对-甲苯磺酰氯进行选择性反应，生成(25R)-16β-26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)，然后(3)同苯二酰亚胺钾反应。产生的(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)随之进行改进的Jones氧化反应，选择性地将16β-羟基氧化，形成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。
另种作法是，同过量的对-甲苯磺酰氯反应，(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)可转化为(25R)-16β-26-二羟基胆固醇的3，26-二甲苯磺酸酯(6)。然后，(6)进行改进的Jones氧化反应，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇的3，26-二甲苯磺酸酯(7)。将化合物(7)用酸性的丙酮水溶液处理，选择性地水解除掉C-3甲苯磺酰基，得到(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇的26-甲苯磺酸酯(8)。然后用苯二酰亚胺钾置换化合物(8)中的C-26甲苯磺酸酯，生成上述的重要的中间体化合物(5)。
按照流程2，(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)在C-16位置上进行选择性氧化生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。随之，化合物(9)直接地，或间接地由化合物(9)衍生的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇的3β，26-二甲苯磺酸酯溶剂分解，转化为单甲苯磺酸酯的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。化合物(8)的C-26甲苯磺酸酯然后用苯二酰亚胺钾置换，生成上述的关键化合物(5)。
因此，本发明的目的是提供一种制造26-氨基胆固醇的简单方法。
本发明的另一目的是提供一种制造26-氨基胆固醇的方法，此法避免用26-羟基胆固醇作中间体和避免使用保护基化学反应。
本发明还有一目的是提供以高产率制备26-氨基胆固醇的简单而直接的方法，此法使用容易取得的中间体(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。
从下面的详细说明中，可以清楚地了解本发明的这些以及其它目的。
在本说明中引用的全部专利和文献，以其整体作为参考。
此处提到的化学试剂和溶剂都是从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI，USA)、Sigma Co.(St.Louis，Mo，USA)、Steraloids(Wilton，NH，USA)、Research Plus(Bayonne，NJ.USA)或Fischer Scientific(Pittsburgh，PA，USA)购得的。所有反应是在氨或氩气等惰性气氛下进行的。
按照本发明的方法，(25R)-16β，26-羟基胆固醇(2)用作制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)的原料。(25R)-16β，26-二羟基胆固醇是由薯蓣皂苷配基制得的。薯蓣皂苷配基是一种植物碱，可由Sigma Co或Steraloids购得。各种制备此种中间体的方法已在文献中讨论过。例如可参见
Tschesche et al，(1979)Chem.Ber.，Vol.112，pages 2680-2691;Arunachalam et al.(1981)J.Org.Chem.，Vol.46，pages 2966-2968;Seo et al.(1986)J.Chem，Soc，Perkin Trans.I，Pages 411-414;and Javitt et al.(1990)以及这些论文中引证的参考文献，一种特别优选的制备中间体(2)的方法可在实施例1中找到，这个方法的克莱门森还原反应中使用未活化的锌粉。
克莱门森还原是一众所周知的反应，主要用于有机物中羰基官能团的还原和缩醛基团的还原断裂。例如，克莱门森还原已用于醛类和环状和非环状酮类各自还原为甲撑基和甲基，以及环状类固醇缩醛(如薯蓣皂苷配基)的还原断裂。为评述这个反应及其提出的机理，请参见E.Vedejs“Organic Reactions”，John Wiley Publishers，NY，1975，Page401。
在进行这个反应时，需要将活化的锌制成粉碎状，例如粉末或颗粒。生产活化锌金属(或锌汞合金)的方法包括在酸性溶液中同汞盐，例如氯化汞进行化学反应。
现在已经发现，当非活化形式的锌粉用于薯蓣皂苷配基的(克莱门森还原反应时，获得极高产率(＞90%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)。而所报告过的用锌汞合金制造此中间体的方法中尚未有达到这样高的产率的。
在实施本发明中，用于由薯蓣皂苷配基制备(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)的金属锌粉大小为-325目，颗粒大小分布广泛，在约3微米和7微米之间，优选为约4微米。一种特别优选的用于此反应的锌粉可由Aldrich Chemical Company(St.Louis，Mo，USA)获得。
金属锌粉用量一般为每摩尔薯蓣皂苷配基约50摩尔和约150摩尔之间，优选是约138摩尔。
按照流程1所示的合成路线，通过每摩尔中间体(2)使用约1和约2摩尔之间，优选是约1.2和1.5摩尔之间的甲苯磺酰氯，可使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)在其C-26位置进行选择性甲苯磺酰化，以产生中间体(3)。
在进行甲苯磺酰化反应中，将对-甲苯磺酰氯加入到含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)的溶液中。用于此反应的适宜的但非限制的溶剂有吡啶或吡啶同CH2Cl2(作为共溶剂)。用于本发明的优选溶剂是吡啶。
反应温度为约0℃和约25℃之间，优选是约0℃，时间约10小时和约48小时之间，优选是约48小时。此后，将反应混合物倾入水中，用合适的溶剂，如乙醚，醋酸乙酯或二氯甲烷从反应混合物中提取单甲苯磺酰化产品(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)，并用传统方法加以提纯。非限制提纯方法中有柱或薄层色层分离法和重结晶。优选的提纯法是从甲醇中重结晶。
然后，(25R)-16β，26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)与苯二酰亚胺盐反应生成置换产品(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)。适宜的苯二酰亚胺盐有苯二酰亚胺钠或钾。用于本发明中的优选盐是苯二酰亚胺钾，因为它可大量购得。
在进行置换反应中，将苯二酰亚胺盐同含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)的溶液混合。用于此反应的适宜的但非限制溶剂有N，N-二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲基亚砜。用于本发明的优选溶剂是N，N-二甲基甲酰胺。
反应进行的温度是在约25℃和约100℃之间，优选为约40℃。反应时间为约2和约8小时之间，优选为约3小时。
此后，将反应混合物倾入水中，用一适宜的溶剂，例如二氯甲烷、醋酸乙酯或优选氯仿从反应混合物中提取反应产物(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)，并用传统方法，例如薄层或柱色层分离法提纯。优选的提纯法是从醋酸乙酯中重结晶。
用一适宜的氧化体系选择氧化(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的C-16位置，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。特别优选的用于本发明的体系是含三氧化铬和醋酸钠的冰醋酸溶液。
在进行氧化反应中，(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)同含三氧化铬和醋酸钠的冰醋酸溶液混合。三氧化铬含量为每升冰醋酸约1.0到约2.0摩尔，优选是约1.5摩尔，醋酸钠含量为每升冰醋酸约20到约30摩尔，优选是约25摩尔。然而可理解为，选择性地氧化C-16羟基的任何适宜的氧化体系能用于实施本发明。
氧化反应一般在温度约25℃到约100℃之间进行，优选是约25℃，反应时间为约10小时到约24小时，优选为24小时。
此后，反应混合物中的过量氧化剂通过加入醇，例如甲醇，使之骤冷。用一合适的溶剂，例如二氯甲烷从反应混合物中提取(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)，并且传统方法，如薄层或色层分离法和重结晶提纯。优选的提纯方法是从丙酮中重结晶。
然后，将(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)进行改进的Wolff-Kishner还原，同时还原C-16氧的部分，并使苯二酰亚氨基断裂，生成(25R)-26-氨基胆固醇(1)。
还原反应混合物含(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)、肼的单水合物、和溶于聚乙二醇的氢氧化钾。三者的摩尔比在约1∶60∶15。和约1∶75∶16之间，优选1∶66∶15。所用的聚乙二醇的量一般在每克类固醇化合物约30毫升和约40毫升之间，优选为约35毫升。
反应混合物被加热到约195℃到约215℃间的恒温，优选为约200℃，并在此温度下回流直到水蒸发掉。然后，将反应维持在此温度约1小时到约3小时之间，优选是约2小时，然后冷至室温。接着，将反应混合物做入水中，用一适宜的溶剂，例如氯仿提取(25R)-26-氨基胆固醇(1)，并且传统的方法，例如薄层或柱色层分离法和重结晶提纯。优选的提纯法是从二氯甲烷-醚混合物中重结晶。
另外一种制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)的方法也示于流程1。按照流程1，(25R)-16，26-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(6)由中间体(2)制备。在制备中间体(6)中，甲苯磺酰氯的用量一般在每摩尔中间体(2)的约2和约4摩尔之间，优选是至少2摩尔。甲苯磺酰化反应的条件和上述相同。
然后，(25R)-16，26-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(6)的C-16位置进行化学氧化，生成(25R)-16-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。任何可选择性地氧化C-16羟基的氧化系统可完成此转化反应。用于制备中间体(7)的优选氧化剂是Jones试剂。化学氧化的条件同上述的相同。
将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3β-26-二甲苯磺酸酯进行溶剂分解，使在C-3位置进行选择水解，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯(8)。一般来说，用含一有机溶剂和一催化剂量的酸的酸性水溶液进行分解是有效的。进行溶剂分解的适宜的温度范围是从约20℃到约100℃之间，优选的是由约25℃到约60℃之间。选择温度的原则是，要根据选择何种溶剂系统，并且反应时间要短(不到24小时)，而又不足以引起中间体(8)的所不希望的消除或降解反应。
实施溶剂分解的适宜的但非限制的酸催化剂有硫酸、盐酸和对-甲苯磺酸吡啶盐(PPTs)。用于实施本发明的优选酸是硫酸。酸的用量范围为每100毫升溶剂约10微升到约1毫升之间。应该懂得，酸的用量应不足以引起所不希望的中间体的消除或降解反应。
适宜的溶剂的非限制实例有丙酮、二噁烷环己烷、四氢呋喃、醇类，例如甲醇，及它们的混合物。用于此反应的优选溶剂是丙酮。溶剂的用量应在反应条件下足以至少溶解类固醇化合物。
流程2说明本发明的另一具体实施方案。按照此流程，(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)先进行氧化，在C-16醇位置上选择氧化，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。在文献中已报导了许多方法制备此中间体及其衍生物。例如，参见Tschesche等人(1979);Arunachalam等(1981);和Seo等(1986)以及此处引用的参考文献。
然后，将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)直接或通过将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(7)溶剂分解间接地转化为(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26甲苯磺酸酯(8)。中间体(8)随之用苯二酰亚胺盐进行置换反应生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。实施这些转化的反应条件和试剂和上述的相同。
下述实施例是说明性的，不能作为对本发明权利要求范围的限制。
实施例1(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)的制备向一5升烧瓶中连续加入薯蓣皂苷配基(40克，0.0965摩尔)、锌粉(900克，-325目)和2升的无水乙醇。然后使此悬浮液回流，并在2.5小时内逐滴加入800毫升浓盐酸。将反应再回流30分钟，然后趁热在重力下立即过滤，所用滤纸为Whatman2号，以除去锌粉颗粒。随后在滤液中加入2升水，形成白色沉淀。混合物在室温下冷却，用抽滤(Whatman2号滤纸)收集沉淀，用水洗三次，然后干燥，得到35克(85%产率)的化合物(2)。
实施例2(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)的制备向在冰浴中冷却的含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.35克，0.84毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(0.44克，2.31毫摩尔)，然后在0℃下搅拌15小时。随之将反应混合物倾入水中并用醚提取。将有机层用2NHCl和水洗涤，用硫酸钠干燥，并在减压下蒸发。将残余物进行硅胶色层分离，用CHCl3/正己烷(3∶1)洗脱，得到0.29克(61%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)。产品由甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。产品的元素和结构分析(1H-NMR)结果如下元素分析(分子式C34H52O5S)C(%) H(%)计算值 71.29 9.15实验值 71.56 9.14NMR(ppm，CDCl3)2.43(3H，s，aryl-CH3);3.3-3.7(1H，m，3α-H);
3.83(2H，brd，26-CH2，J＝6Hz);4.1-4.5(1H，m，16α-H);
5.3-5.5(1H，m，6-H);7.29(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);
7.73(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)
实施例3(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)的制备。
在此实施例中，由(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)制备中间体(3)，反应条件和实施例2中讨论的相似，所不同的是本实施例的反应是在室温下进行。
向用冰浴冷却的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.30克，0.72毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(0.83克，4.35毫摩尔)，将混合物在室温下搅拌5小时。然后，将混合物倾入水中并用乙醚提取。有机层用2N HCl和水洗涤，并在减压下蒸发。在残余物中加入丙酮(50毫升)、水(20毫升)和催化剂量的硫酸(0.2毫升)，将此混合物回流6小时。蒸发丙酮，将得到的沉淀滤出。沉淀进行硅胶色层分离，用CHCl3洗脱，得到0.37克(90%)的和实施例2相同的产品。将此化合物从甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。
实施例4(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的制备在室温下，将(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)(0.21克，0.37毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.21克，1.13毫摩尔)和二甲基甲酰胺(16毫升)的反应混合物搅拌4天。然后将反应混合物倾入水中，用二氯甲烷提取两次。用2N HCl和水洗合并的提取物，经硫酸钠干燥，在减压下蒸发，得到0.18克(90%)的(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)。产品经醋酸乙酯重结晶，测得熔点为134.5°-136℃。
元素分析(分子式C35H49NO4)C% H% N%计算值 76.74 9.02 2.56试验值 76.61 9.09 2.40NMR(ppm，CDCl3)3.2-3.8(3H，m，3α-H，26-CH2);4.1-4.5(1H，m，16α-H);5.2-5.4(1H，m，6-H);7.5-7.9(4H，m，aryl-H)实施例5(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的制备在此实施例中，在同实施例4中讨论的相似反应条件下由(25R)-16β，16-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)制备中间体(4)。所不同的是本实施例的反应温度为100℃。
将(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)(0.20克，0.35毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.20克，1.08毫摩尔)和二甲基酰胺(10毫升)的反应混合物在100℃下搅拌1.5小时。然后，将反应混合物倾入水中，用二氯甲烷提取。用2N HCl和水洗涤提取物，经硫酸钠干燥，在减压下蒸发，得到0.18克(94%)的和实施例4得到的相同的产品。将产品从醋酸乙酯中重结晶，测得熔点为134.5℃-136℃。
实施例6(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(6)的制备向用冰浴冷却的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(1.89克，4.52毫摩尔溶于20毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(3.44克，28.0毫摩尔)，在室温下将混合物搅拌5小时。然后将反应混合物倾入水中并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层。经硫酸钠干燥后，在减压下蒸发，得到油状的3.04克(93%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，经IR(红外光谱和1H-NMR进行的结构分析结果如下NMR(ppm，CDCl3)2.43(6H，s，aryl-CH3);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);4.0-4.6(1H，m，3α-H，16α-H);5.1-5.4(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.75(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)IR(KBr)3550，2930，2850，1600，1360，1190，1180，1100，940，670，560cm-1实施例7由中间体(6)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。
在室温下将Jone试剂逐滴加入到(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(6)(3.04克，5.41毫摩尔溶于70毫升丙酮)的溶液中，直到棕-橙颜色不再消失，然后再搅拌10分钟。用饱和的NaHSO3水溶液骤冷反应混合物，然后用水稀释，并用乙醚提取。将有机层用水洗，经硫酸钠干燥后，减压蒸发，得到2.85克(94%)的油状(25R)-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。用IR和1H-NMR对产品进行结构分析，结果如下NMR(ppm，CDCl3)2.43(6H，s，aryl-CH3);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);4.0-4.6(1H，m，3α-H);5.1-5.4(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.75(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)IR(KBr)3450，2930，2850，1730，1600，1360，1190，1180，1100，930，660，560 cm-1实施例8(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)的制备将(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)(2，00克，2.76毫摩尔)、丙酮(60毫升)、水(25毫升)和催化剂量的硫酸的混合物回流6小时。从混合物中除去丙酮，用水稀释混合物，并用醚提取。将有机层用水洗，经硫酸钠干燥后，进行减压蒸发，得到1.51克(96%)的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。将产品在四氯化碳中重结晶。测得的熔点为114°-115℃。元素和结构(1H-NMR)分析结果如下元素分析(分子式C34H50O5S)
C(%) H(%)计算值 71.54 8.83实验值 71.15 8.75NMR(ppm，CDCl3)2.43(3H，s，aryl-CH3);3.3-3.7(1H，m，3α-H);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);5.2-5.5(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.73(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)实施例9由中间体(4)制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)将三氧化铬(0.04克，0.4毫摩尔)在水(0.15毫升)和醋酸(0.3毫升)中的溶液滴加到(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)(0.26克，0.49毫摩尔)和醋酸钠(1.00克，12.19毫摩尔)在醋酸(35毫升)的溶液中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后用甲醇(15毫升)破坏过量试剂，在减压下将溶剂蒸发。得到的残余物用水稀释，并且二氯乙烷提取。用5%K2CO3和水洗有机层，经硫酸钠干燥后减压蒸发，得到0.23克(89%)的(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。产品从丙酮中重结晶，测得熔点为178°-180℃。元素和结构(1H-NMR)分析结果如下元素分析(分子式C35H47NO4)C(%) H(%) N(%)
计算值 77.03 8.68 2.57实验值 76.83 8.71 2.40NMR(ppm，CDCl3)3.4-3.8(3H，m，3α-H，26-CH2);5.2-5.5(1H，m，6-H);7.5-8.0(4H，m，aryl-H)实施例10由中间体(8)制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(8)在100℃下，将(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)(0.96克，1.71毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.62克，3.35毫摩尔)和二甲基甲酰胺(7毫升)的混合物搅拌2小时。然后将反应混合物倾入水中，并用醋酸乙酯提取。用2N HCl和水洗涤提取液两次，经硫酸钠干燥后进行减压蒸发，得到0.84克(92%)的和实施例9得到的相同的产品。将产品从丙酮中重结晶，测得的熔点为178°-180℃。
实施例11(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)的制备将三氧化铬(80毫克)在水(0.4毫升)和醋酸(0.8毫升)的溶液逐滴加到(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.500克)和醋酸钠(2.48克)在冰醋酸(90毫升)的溶液中，在室温下搅拌18小时。然后用甲醇(15毫升)将过量试剂破坏，在减压下蒸发溶剂。得到的残余物用水稀释，并用二氯甲烷提取。用5%K2CO3和水洗涤有机层，经硫酸钠干燥后进行减压蒸发，得到0.48克粗产品，经硅胶快速柱色层分离(己烷∶醋酸乙酯)将混合物分离。得到0.313克的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。熔点167°-169℃。
实施例12由中间体(9)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)向用冰浴中冷却的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇(9)(4.52毫摩尔溶于20毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(3.44克18.0毫摩尔)，将混合物在室温下搅拌5小时。然后将反应混合物倾入水中，并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层，经硫酸钠干燥后，在减压下蒸发，得到3.04克(93%)的油状的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。此产品和实施例8的产品相同。
实施例13由中间体(9)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)向用冰浴冷却的含(25R)-26羟基-16-氧胆固醇(9)(0.84毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中加入对-甲苯磺酰氯(0.44克，2.31毫摩尔)，在0℃下搅拌15小时。然后将反应混合物倾入水中，并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层，经硫酸钠干燥后，减压蒸发。残余物经硅胶色层分离，用CHCl3/正-己烷(3∶1)洗脱，得到0.29克(61%)的和实施例8产品相同的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。将产品从甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。
实施例14(25R)-26-氨基胆固醇(1)的制备将(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)(0.70克，1.32毫摩尔)、肼单水合物(5毫升，102.8毫摩尔)、氢氧化钠(2.85克，50.8毫摩尔)和三甘醇(20毫升)的混合物加热到150℃约30分钟。然后在2小时加热到200℃。这时，水蒸汽从混合物中蒸出。将反应混合物在氮气下维持在此温度约16小时，直到通过薄层色层分离测定反应完成为止。此后，将反应混合物冷却，并倾入水中，经硫酸钠干燥后，减压蒸发。残余物经硅胶色层分离，用CHCl3洗脱，得到0.34克(66%)的(25R)-26-氨基胆固醇。将产品从二氯甲烷-醚中重结晶，测得其熔点为150°-152℃。产品的元素分析结果如下元素分析(分子式C27H47NO)C(%) H(%) N(%)计算值 80.74 11.79 3.49实验值 80.49 11.97 3.3权利要求
1.制备(25R)-26-氨基胆固醇的方法，包括还原(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
2.根据权利要求1的方法，包括在碱盐存在下用肼进行还原。
3.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应前，使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯与苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇;以及氧化(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
4.根据权利要求3的方法，包括用二氧化铬在醋酸中进行氧化反应。
5.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应之前，使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇与对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;氧化(25R)-16β，26-羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;氧化(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;水解(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲磺酸酯;和使(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
6.根据权利要求5的方法，包括用三氧化铬在醋酸中进行氧化反应。
7.根据权利要求5的方法，包括用含水酸溶液进行水解。
8.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应前，氧化(25R)-16β，26-二羟基胆固醇，生成(25R)，16-氧-26-羟基胆固醇;使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇同对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯;和使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
9.根据权利要求1的方法，还包含在所说还原反应前，氧化(25R)-16β-26-二羟基胆固醇，生成(25)-16-氧-26-羟基胆固醇，使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇同对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3，36-二甲苯磺酸酯;水解(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3，26-二甲苯磺酸酯生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯;和使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
10.(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
全文摘要
本发明涉及由(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇制备(25R)-26-氨基胆固醇的方法，(25R)-26-氨基胆固醇是胆固醇生物合成的一个有效的抑制剂。
文档编号C07J9/00GK1084856SQ9310809
公开日1994年4月6日 申请日期1993年7月2日 优先权日1992年7月2日
发明者S·R·威尔森 申请人:纽约大学
技术领域：
本发明涉及(25R)-26-氨基胆固醇的制备方法，(25R)-26-氨基胆固醇是胆固醇生物合成的有效抑制剂。
胆固醇是动物组织的主要类固醇成分，也是血浆和几乎所有细胞膜的正常成分。胆固醇是一种带活性羟基的疏水的烃化合物。它是在C-17位置上带有脂族侧链的3-羟基固醇(具有全氢-1，2-环戊烯基菲环骨架)。理论上，胆固醇通过在膜的磷脂之间形成一插入结构，从而在调节细胞膜的透过性和流动性方面起重要作用。
胆固醇可从饮食中获取，或在肝中合成。如果需要，也可在细胞中制造，但实际上大多数细胞是从外部接受胆固醇。胆固醇的合成是酶催化的生物合成，其中，限制酶的速率的被认为是羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG CoA reductase)。例如参见Javitt，美国专利4，427，668号。此酶催化由羟甲基戊二酸生成胆固醇前体二羟基甲基戊酸。理论上，通过用HMG CoA还原酶干扰可以调节胆固醇的产生。
Goodman & Gilman，“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”7th Ed.，MacMillan(New York1985)，pp.841-843;Kandustsch et al.，Science，201，498(1978).
胆固醇过量累积已被认为是许多疾病的主要诱发因素。特别是高浓度的胆固醇能引起和/或加速动脉粥样硬化，后者的特征是由于脂肪物质(包括胆固醇)的累积和沉积，动脉壁呈现不正常的硬化和变厚。这又导致血栓和血块生成。关于胆固醇有关的病理，请参见“Hormones and Metabolic Control，”D.A.White，B.Middleton，and M.Baxter，editors;Edward Arnold Publisher;London，1984，pages 73-90.
最近用于抑制胆固醇合成的药物主要作用于肝脏。其功能主要引起肝脏的LDL(低密度脂蛋白)感受器的向上调节，以增加肝对胆固醇的吸收，降低血清水平，或阻抑HMG CoA还原酶，从而降低胆固醇的生成。
最近使用的药物的代表有mevinolin和消胆胺。这些药物能引起肝中LDL感受器的向上调节。mevinolin是一种HMG CoA还原酶的变构抑制剂，通过抑制肝脏中胆固醇的合成而完成这一调节效应。这模拟肝脏中增加LDL感受器活性，引起肝对胆固醇的吸收，从而使血浆中胆固醇的降低。消胆胺提高了肝脏中由胆固醇合成胆汁酸的需要，对某些人来说，这会产生LDL感受器的向上调节，这样下去，降低了血清中的胆固醇。因此，这两种化合物的主要作用限于肝脏。这些已知化合物对肝脏外的细胞不产生明显效果。应用所知化合物以肝脏为目标的战略是有效的，因为和其它细胞不同，肝细胞可专一地将胆固醇代谢(和除去)成胆汁酸。实际上，像mevinolin这样的化合物，如果以肝脏外细胞为目标，会对组织中胆固醇的累积有害。因为该化合物能向上调节LDL感受器，并引起，而不是降低胆固醇的累积。
另一种周知的化合物是26-羟基胆固醇，此化合物是美国专利4，427，668号的讨论主题。参见Javitt et al.，(1981)J.Biol.Chem，Vol.256(24)，pages 12644-12646;Brooks et al.，(1983)Biochem Soc.Trans.，Vol.11，pages 700-701;Koopman et al.，(1987)J.Chromatoqr.，Vol.416，pages 1-13;Esterman et al.，(1983)J.Lipid Res.，Vol.24，pages 1304-1309;and Taylor et al.，(1984)J.Biol.Chem.，Vol.259(20)，pages 12382-12387.
26-羟基胆固醇是胆汁酸的中间体，据说它可调节细胞的胆固醇的体内平衡。为评述26-羟基胆固醇的生物效应，参见Javitt，N.B.(1990)J.Lipid Res.Vol31，Pages1527-1533。在文献中已报导了制备26-羟基胆固醇的合成方法。参见Tschesche et al.(1979)Chem Ber.，Vol.112，Pages2680-2691和Seo et al.(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans，I.Pages411-416。所讨论的方法常涉及苛刻的多步反应，羟基类固醇的产量也低。
26-氨基胆固醇被认为是LDL感受器的有效的向下调节剂和体外胆固醇生物合成的抑制剂，比羟基中间体具有相等或更大的生物效应。参见Miao et al.(1988)Biochem.J.Vol255，Pages1049-1052和美国专利4，939，134号(′134专利)。这些资料作为本文的参考资料。此化合物可选择性地抑制和降低LDL结合在人的成纤维细胞上，同时对人肝癌(HepG2)细胞很少或无影响。此外还发现，此化合物可通过非肝细胞调低胆固醇的合成。
制备(25R)-26-氨基胆固醇的合成方法已有报导。例如，Miao等人(1988)和′134专利讨论了通过26-叠氮基胆固醇3-醋酸酯的锂铝化氢还原，制备26-氨基胆固醇。Tschesche et al.(1979)Chem.Ber.，Vol.112，Pages2680-2691，讨论了26-苯二酰亚胺基胆固醇的制备，及其加氢转化成(25R)-26-氨基胆固醇。然而，这些方法制备氨基类固醇，需要26-羟基胆固醇作原料，使用复杂的保护和脱保护反应，以及所希望的产品产率低。
Klimova等人，(1982)Khim.Pharm.Zh.，Vol.16，Page451，讨论了从水解羟基茄碱制备胆固醇的26-乙酰基氨基类似物。水解羟基茄碱是一种植物生物碱，为薯蓣皂苷配基(diosgenin)的氨基类似物。根据讨论的方法，将由O，N-二酰基化的水解羟基茄碱氧化得到的3β-乙酰氧-26-乙酰氨基16，22二酮进行克莱门森还原，还原剂用活化的锌汞合金。反应得到一个混合物，主要产品是26-氨基胆固醇-5烯-22酮的二乙酰基衍生物，副产品是26-氨基胆固醇。因为26-氨基胆固醇的产率低，此公开了的反应还适用于制备氨基类固醇化合物。至今，尚未发现高产率的制备26-氨基胆固醇的方法。
现在已经意外地发现，(25R)-26-氨基胆固醇可以直接由简单的中间体高产率地制得，这就避免了用26-羟基胆固醇作原料，并避免了采用保护基反应。
本发明提供通过肼还原反应，例如Wolff-Kishmer反应，直接由(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)制备(25R)-26-氨基胆固醇(1)。肼还原反应同时还原16-氧部分，并断裂苯二酰亚氨基。流程1和流程2说明由(25R)-26-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)制备(25R)-26-氨基胆固醇(1)的方法。
按照流程1，由薯蓣皂苷配基一步制成的(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)在C-26羟基同对-甲苯磺酰氯进行选择性反应，生成(25R)-16β-26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)，然后(3)同苯二酰亚胺钾反应。产生的(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)随之进行改进的Jones氧化反应，选择性地将16β-羟基氧化，形成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。
另种作法是，同过量的对-甲苯磺酰氯反应，(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)可转化为(25R)-16β-26-二羟基胆固醇的3，26-二甲苯磺酸酯(6)。然后，(6)进行改进的Jones氧化反应，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇的3，26-二甲苯磺酸酯(7)。将化合物(7)用酸性的丙酮水溶液处理，选择性地水解除掉C-3甲苯磺酰基，得到(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇的26-甲苯磺酸酯(8)。然后用苯二酰亚胺钾置换化合物(8)中的C-26甲苯磺酸酯，生成上述的重要的中间体化合物(5)。
按照流程2，(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)在C-16位置上进行选择性氧化生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。随之，化合物(9)直接地，或间接地由化合物(9)衍生的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇的3β，26-二甲苯磺酸酯溶剂分解，转化为单甲苯磺酸酯的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。化合物(8)的C-26甲苯磺酸酯然后用苯二酰亚胺钾置换，生成上述的关键化合物(5)。
因此，本发明的目的是提供一种制造26-氨基胆固醇的简单方法。
本发明的另一目的是提供一种制造26-氨基胆固醇的方法，此法避免用26-羟基胆固醇作中间体和避免使用保护基化学反应。
本发明还有一目的是提供以高产率制备26-氨基胆固醇的简单而直接的方法，此法使用容易取得的中间体(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。
从下面的详细说明中，可以清楚地了解本发明的这些以及其它目的。
在本说明中引用的全部专利和文献，以其整体作为参考。
此处提到的化学试剂和溶剂都是从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI，USA)、Sigma Co.(St.Louis，Mo，USA)、Steraloids(Wilton，NH，USA)、Research Plus(Bayonne，NJ.USA)或Fischer Scientific(Pittsburgh，PA，USA)购得的。所有反应是在氨或氩气等惰性气氛下进行的。
按照本发明的方法，(25R)-16β，26-羟基胆固醇(2)用作制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)的原料。(25R)-16β，26-二羟基胆固醇是由薯蓣皂苷配基制得的。薯蓣皂苷配基是一种植物碱，可由Sigma Co或Steraloids购得。各种制备此种中间体的方法已在文献中讨论过。例如可参见
Tschesche et al，(1979)Chem.Ber.，Vol.112，pages 2680-2691;Arunachalam et al.(1981)J.Org.Chem.，Vol.46，pages 2966-2968;Seo et al.(1986)J.Chem，Soc，Perkin Trans.I，Pages 411-414;and Javitt et al.(1990)以及这些论文中引证的参考文献，一种特别优选的制备中间体(2)的方法可在实施例1中找到，这个方法的克莱门森还原反应中使用未活化的锌粉。
克莱门森还原是一众所周知的反应，主要用于有机物中羰基官能团的还原和缩醛基团的还原断裂。例如，克莱门森还原已用于醛类和环状和非环状酮类各自还原为甲撑基和甲基，以及环状类固醇缩醛(如薯蓣皂苷配基)的还原断裂。为评述这个反应及其提出的机理，请参见E.Vedejs“Organic Reactions”，John Wiley Publishers，NY，1975，Page401。
在进行这个反应时，需要将活化的锌制成粉碎状，例如粉末或颗粒。生产活化锌金属(或锌汞合金)的方法包括在酸性溶液中同汞盐，例如氯化汞进行化学反应。
现在已经发现，当非活化形式的锌粉用于薯蓣皂苷配基的(克莱门森还原反应时，获得极高产率(＞90%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)。而所报告过的用锌汞合金制造此中间体的方法中尚未有达到这样高的产率的。
在实施本发明中，用于由薯蓣皂苷配基制备(25R)-16β-26-二羟基胆固醇(2)的金属锌粉大小为-325目，颗粒大小分布广泛，在约3微米和7微米之间，优选为约4微米。一种特别优选的用于此反应的锌粉可由Aldrich Chemical Company(St.Louis，Mo，USA)获得。
金属锌粉用量一般为每摩尔薯蓣皂苷配基约50摩尔和约150摩尔之间，优选是约138摩尔。
按照流程1所示的合成路线，通过每摩尔中间体(2)使用约1和约2摩尔之间，优选是约1.2和1.5摩尔之间的甲苯磺酰氯，可使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)在其C-26位置进行选择性甲苯磺酰化，以产生中间体(3)。
在进行甲苯磺酰化反应中，将对-甲苯磺酰氯加入到含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)的溶液中。用于此反应的适宜的但非限制的溶剂有吡啶或吡啶同CH2Cl2(作为共溶剂)。用于本发明的优选溶剂是吡啶。
反应温度为约0℃和约25℃之间，优选是约0℃，时间约10小时和约48小时之间，优选是约48小时。此后，将反应混合物倾入水中，用合适的溶剂，如乙醚，醋酸乙酯或二氯甲烷从反应混合物中提取单甲苯磺酰化产品(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)，并用传统方法加以提纯。非限制提纯方法中有柱或薄层色层分离法和重结晶。优选的提纯法是从甲醇中重结晶。
然后，(25R)-16β，26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)与苯二酰亚胺盐反应生成置换产品(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)。适宜的苯二酰亚胺盐有苯二酰亚胺钠或钾。用于本发明中的优选盐是苯二酰亚胺钾，因为它可大量购得。
在进行置换反应中，将苯二酰亚胺盐同含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇的26-甲苯磺酸酯(3)的溶液混合。用于此反应的适宜的但非限制溶剂有N，N-二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲基亚砜。用于本发明的优选溶剂是N，N-二甲基甲酰胺。
反应进行的温度是在约25℃和约100℃之间，优选为约40℃。反应时间为约2和约8小时之间，优选为约3小时。
此后，将反应混合物倾入水中，用一适宜的溶剂，例如二氯甲烷、醋酸乙酯或优选氯仿从反应混合物中提取反应产物(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)，并用传统方法，例如薄层或柱色层分离法提纯。优选的提纯法是从醋酸乙酯中重结晶。
用一适宜的氧化体系选择氧化(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的C-16位置，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。特别优选的用于本发明的体系是含三氧化铬和醋酸钠的冰醋酸溶液。
在进行氧化反应中，(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)同含三氧化铬和醋酸钠的冰醋酸溶液混合。三氧化铬含量为每升冰醋酸约1.0到约2.0摩尔，优选是约1.5摩尔，醋酸钠含量为每升冰醋酸约20到约30摩尔，优选是约25摩尔。然而可理解为，选择性地氧化C-16羟基的任何适宜的氧化体系能用于实施本发明。
氧化反应一般在温度约25℃到约100℃之间进行，优选是约25℃，反应时间为约10小时到约24小时，优选为24小时。
此后，反应混合物中的过量氧化剂通过加入醇，例如甲醇，使之骤冷。用一合适的溶剂，例如二氯甲烷从反应混合物中提取(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)，并且传统方法，如薄层或色层分离法和重结晶提纯。优选的提纯方法是从丙酮中重结晶。
然后，将(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)进行改进的Wolff-Kishner还原，同时还原C-16氧的部分，并使苯二酰亚氨基断裂，生成(25R)-26-氨基胆固醇(1)。
还原反应混合物含(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)、肼的单水合物、和溶于聚乙二醇的氢氧化钾。三者的摩尔比在约1∶60∶15。和约1∶75∶16之间，优选1∶66∶15。所用的聚乙二醇的量一般在每克类固醇化合物约30毫升和约40毫升之间，优选为约35毫升。
反应混合物被加热到约195℃到约215℃间的恒温，优选为约200℃，并在此温度下回流直到水蒸发掉。然后，将反应维持在此温度约1小时到约3小时之间，优选是约2小时，然后冷至室温。接着，将反应混合物做入水中，用一适宜的溶剂，例如氯仿提取(25R)-26-氨基胆固醇(1)，并且传统的方法，例如薄层或柱色层分离法和重结晶提纯。优选的提纯法是从二氯甲烷-醚混合物中重结晶。
另外一种制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)的方法也示于流程1。按照流程1，(25R)-16，26-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(6)由中间体(2)制备。在制备中间体(6)中，甲苯磺酰氯的用量一般在每摩尔中间体(2)的约2和约4摩尔之间，优选是至少2摩尔。甲苯磺酰化反应的条件和上述相同。
然后，(25R)-16，26-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(6)的C-16位置进行化学氧化，生成(25R)-16-二羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。任何可选择性地氧化C-16羟基的氧化系统可完成此转化反应。用于制备中间体(7)的优选氧化剂是Jones试剂。化学氧化的条件同上述的相同。
将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3β-26-二甲苯磺酸酯进行溶剂分解，使在C-3位置进行选择水解，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯(8)。一般来说，用含一有机溶剂和一催化剂量的酸的酸性水溶液进行分解是有效的。进行溶剂分解的适宜的温度范围是从约20℃到约100℃之间，优选的是由约25℃到约60℃之间。选择温度的原则是，要根据选择何种溶剂系统，并且反应时间要短(不到24小时)，而又不足以引起中间体(8)的所不希望的消除或降解反应。
实施溶剂分解的适宜的但非限制的酸催化剂有硫酸、盐酸和对-甲苯磺酸吡啶盐(PPTs)。用于实施本发明的优选酸是硫酸。酸的用量范围为每100毫升溶剂约10微升到约1毫升之间。应该懂得，酸的用量应不足以引起所不希望的中间体的消除或降解反应。
适宜的溶剂的非限制实例有丙酮、二噁烷环己烷、四氢呋喃、醇类，例如甲醇，及它们的混合物。用于此反应的优选溶剂是丙酮。溶剂的用量应在反应条件下足以至少溶解类固醇化合物。
流程2说明本发明的另一具体实施方案。按照此流程，(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)先进行氧化，在C-16醇位置上选择氧化，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。在文献中已报导了许多方法制备此中间体及其衍生物。例如，参见Tschesche等人(1979);Arunachalam等(1981);和Seo等(1986)以及此处引用的参考文献。
然后，将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)直接或通过将(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3β，26-二甲苯磺酸酯(7)溶剂分解间接地转化为(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26甲苯磺酸酯(8)。中间体(8)随之用苯二酰亚胺盐进行置换反应生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。实施这些转化的反应条件和试剂和上述的相同。
下述实施例是说明性的，不能作为对本发明权利要求范围的限制。
实施例1(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)的制备向一5升烧瓶中连续加入薯蓣皂苷配基(40克，0.0965摩尔)、锌粉(900克，-325目)和2升的无水乙醇。然后使此悬浮液回流，并在2.5小时内逐滴加入800毫升浓盐酸。将反应再回流30分钟，然后趁热在重力下立即过滤，所用滤纸为Whatman2号，以除去锌粉颗粒。随后在滤液中加入2升水，形成白色沉淀。混合物在室温下冷却，用抽滤(Whatman2号滤纸)收集沉淀，用水洗三次，然后干燥，得到35克(85%产率)的化合物(2)。
实施例2(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)的制备向在冰浴中冷却的含(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.35克，0.84毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(0.44克，2.31毫摩尔)，然后在0℃下搅拌15小时。随之将反应混合物倾入水中并用醚提取。将有机层用2NHCl和水洗涤，用硫酸钠干燥，并在减压下蒸发。将残余物进行硅胶色层分离，用CHCl3/正己烷(3∶1)洗脱，得到0.29克(61%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)。产品由甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。产品的元素和结构分析(1H-NMR)结果如下元素分析(分子式C34H52O5S)C(%) H(%)计算值 71.29 9.15实验值 71.56 9.14NMR(ppm，CDCl3)2.43(3H，s，aryl-CH3);3.3-3.7(1H，m，3α-H);
3.83(2H，brd，26-CH2，J＝6Hz);4.1-4.5(1H，m，16α-H);
5.3-5.5(1H，m，6-H);7.29(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);
7.73(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)
实施例3(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)的制备。
在此实施例中，由(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)制备中间体(3)，反应条件和实施例2中讨论的相似，所不同的是本实施例的反应是在室温下进行。
向用冰浴冷却的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.30克，0.72毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(0.83克，4.35毫摩尔)，将混合物在室温下搅拌5小时。然后，将混合物倾入水中并用乙醚提取。有机层用2N HCl和水洗涤，并在减压下蒸发。在残余物中加入丙酮(50毫升)、水(20毫升)和催化剂量的硫酸(0.2毫升)，将此混合物回流6小时。蒸发丙酮，将得到的沉淀滤出。沉淀进行硅胶色层分离，用CHCl3洗脱，得到0.37克(90%)的和实施例2相同的产品。将此化合物从甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。
实施例4(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的制备在室温下，将(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)(0.21克，0.37毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.21克，1.13毫摩尔)和二甲基甲酰胺(16毫升)的反应混合物搅拌4天。然后将反应混合物倾入水中，用二氯甲烷提取两次。用2N HCl和水洗合并的提取物，经硫酸钠干燥，在减压下蒸发，得到0.18克(90%)的(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)。产品经醋酸乙酯重结晶，测得熔点为134.5°-136℃。
元素分析(分子式C35H49NO4)C% H% N%计算值 76.74 9.02 2.56试验值 76.61 9.09 2.40NMR(ppm，CDCl3)3.2-3.8(3H，m，3α-H，26-CH2);4.1-4.5(1H，m，16α-H);5.2-5.4(1H，m，6-H);7.5-7.9(4H，m，aryl-H)实施例5(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)的制备在此实施例中，在同实施例4中讨论的相似反应条件下由(25R)-16β，16-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)制备中间体(4)。所不同的是本实施例的反应温度为100℃。
将(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯(3)(0.20克，0.35毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.20克，1.08毫摩尔)和二甲基酰胺(10毫升)的反应混合物在100℃下搅拌1.5小时。然后，将反应混合物倾入水中，用二氯甲烷提取。用2N HCl和水洗涤提取物，经硫酸钠干燥，在减压下蒸发，得到0.18克(94%)的和实施例4得到的相同的产品。将产品从醋酸乙酯中重结晶，测得熔点为134.5℃-136℃。
实施例6(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(6)的制备向用冰浴冷却的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(1.89克，4.52毫摩尔溶于20毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(3.44克，28.0毫摩尔)，在室温下将混合物搅拌5小时。然后将反应混合物倾入水中并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层。经硫酸钠干燥后，在减压下蒸发，得到油状的3.04克(93%)的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，经IR(红外光谱和1H-NMR进行的结构分析结果如下NMR(ppm，CDCl3)2.43(6H，s，aryl-CH3);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);4.0-4.6(1H，m，3α-H，16α-H);5.1-5.4(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.75(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)IR(KBr)3550，2930，2850，1600，1360，1190，1180，1100，940，670，560cm-1实施例7由中间体(6)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。
在室温下将Jone试剂逐滴加入到(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(6)(3.04克，5.41毫摩尔溶于70毫升丙酮)的溶液中，直到棕-橙颜色不再消失，然后再搅拌10分钟。用饱和的NaHSO3水溶液骤冷反应混合物，然后用水稀释，并用乙醚提取。将有机层用水洗，经硫酸钠干燥后，减压蒸发，得到2.85克(94%)的油状(25R)-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。用IR和1H-NMR对产品进行结构分析，结果如下NMR(ppm，CDCl3)2.43(6H，s，aryl-CH3);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);4.0-4.6(1H，m，3α-H);5.1-5.4(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.75(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)IR(KBr)3450，2930，2850，1730，1600，1360，1190，1180，1100，930，660，560 cm-1实施例8(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)的制备将(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)(2，00克，2.76毫摩尔)、丙酮(60毫升)、水(25毫升)和催化剂量的硫酸的混合物回流6小时。从混合物中除去丙酮，用水稀释混合物，并用醚提取。将有机层用水洗，经硫酸钠干燥后，进行减压蒸发，得到1.51克(96%)的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。将产品在四氯化碳中重结晶。测得的熔点为114°-115℃。元素和结构(1H-NMR)分析结果如下元素分析(分子式C34H50O5S)
C(%) H(%)计算值 71.54 8.83实验值 71.15 8.75NMR(ppm，CDCl3)2.43(3H，s，aryl-CH3);3.3-3.7(1H，m，3α-H);3.83(2H，br-d，26-CH2，J＝6Hz);5.2-5.5(1H，m，6-H);7.28(2H，d，aryl-H，J＝8Hz);7.73(2H，d，aryl-H，J＝8Hz)实施例9由中间体(4)制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)将三氧化铬(0.04克，0.4毫摩尔)在水(0.15毫升)和醋酸(0.3毫升)中的溶液滴加到(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇(4)(0.26克，0.49毫摩尔)和醋酸钠(1.00克，12.19毫摩尔)在醋酸(35毫升)的溶液中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后用甲醇(15毫升)破坏过量试剂，在减压下将溶剂蒸发。得到的残余物用水稀释，并且二氯乙烷提取。用5%K2CO3和水洗有机层，经硫酸钠干燥后减压蒸发，得到0.23克(89%)的(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)。产品从丙酮中重结晶，测得熔点为178°-180℃。元素和结构(1H-NMR)分析结果如下元素分析(分子式C35H47NO4)C(%) H(%) N(%)
计算值 77.03 8.68 2.57实验值 76.83 8.71 2.40NMR(ppm，CDCl3)3.4-3.8(3H，m，3α-H，26-CH2);5.2-5.5(1H，m，6-H);7.5-8.0(4H，m，aryl-H)实施例10由中间体(8)制备(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(8)在100℃下，将(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)(0.96克，1.71毫摩尔)、苯二酰亚胺钾(0.62克，3.35毫摩尔)和二甲基甲酰胺(7毫升)的混合物搅拌2小时。然后将反应混合物倾入水中，并用醋酸乙酯提取。用2N HCl和水洗涤提取液两次，经硫酸钠干燥后进行减压蒸发，得到0.84克(92%)的和实施例9得到的相同的产品。将产品从丙酮中重结晶，测得的熔点为178°-180℃。
实施例11(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)的制备将三氧化铬(80毫克)在水(0.4毫升)和醋酸(0.8毫升)的溶液逐滴加到(25R)-16β，26-二羟基胆固醇(2)(0.500克)和醋酸钠(2.48克)在冰醋酸(90毫升)的溶液中，在室温下搅拌18小时。然后用甲醇(15毫升)将过量试剂破坏，在减压下蒸发溶剂。得到的残余物用水稀释，并用二氯甲烷提取。用5%K2CO3和水洗涤有机层，经硫酸钠干燥后进行减压蒸发，得到0.48克粗产品，经硅胶快速柱色层分离(己烷∶醋酸乙酯)将混合物分离。得到0.313克的(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇(9)。熔点167°-169℃。
实施例12由中间体(9)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)向用冰浴中冷却的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇(9)(4.52毫摩尔溶于20毫升吡啶中)的溶液中，加入对-甲苯磺酰氯(3.44克18.0毫摩尔)，将混合物在室温下搅拌5小时。然后将反应混合物倾入水中，并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层，经硫酸钠干燥后，在减压下蒸发，得到3.04克(93%)的油状的(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯(7)。此产品和实施例8的产品相同。
实施例13由中间体(9)制备(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)向用冰浴冷却的含(25R)-26羟基-16-氧胆固醇(9)(0.84毫摩尔溶于10毫升吡啶中)的溶液中加入对-甲苯磺酰氯(0.44克，2.31毫摩尔)，在0℃下搅拌15小时。然后将反应混合物倾入水中，并用乙醚提取。用2N HCl和水洗有机层，经硫酸钠干燥后，减压蒸发。残余物经硅胶色层分离，用CHCl3/正-己烷(3∶1)洗脱，得到0.29克(61%)的和实施例8产品相同的(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯(8)。将产品从甲醇-水中结晶，测得熔点为55℃。
实施例14(25R)-26-氨基胆固醇(1)的制备将(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇(5)(0.70克，1.32毫摩尔)、肼单水合物(5毫升，102.8毫摩尔)、氢氧化钠(2.85克，50.8毫摩尔)和三甘醇(20毫升)的混合物加热到150℃约30分钟。然后在2小时加热到200℃。这时，水蒸汽从混合物中蒸出。将反应混合物在氮气下维持在此温度约16小时，直到通过薄层色层分离测定反应完成为止。此后，将反应混合物冷却，并倾入水中，经硫酸钠干燥后，减压蒸发。残余物经硅胶色层分离，用CHCl3洗脱，得到0.34克(66%)的(25R)-26-氨基胆固醇。将产品从二氯甲烷-醚中重结晶，测得其熔点为150°-152℃。产品的元素分析结果如下元素分析(分子式C27H47NO)C(%) H(%) N(%)计算值 80.74 11.79 3.49实验值 80.49 11.97 3.3权利要求
1.制备(25R)-26-氨基胆固醇的方法，包括还原(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
2.根据权利要求1的方法，包括在碱盐存在下用肼进行还原。
3.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应前，使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯与苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇;以及氧化(25R)-16β-羟基-26-苯二酰亚氨基胆固醇，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
4.根据权利要求3的方法，包括用二氧化铬在醋酸中进行氧化反应。
5.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应之前，使(25R)-16β，26-二羟基胆固醇与对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;氧化(25R)-16β，26-羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;氧化(25R)-16β，26-二羟基胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯;水解(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇3β，26-二甲苯磺酸酯，生成(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲磺酸酯;和使(25R)-26-羟基-16-氧胆固醇26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
6.根据权利要求5的方法，包括用三氧化铬在醋酸中进行氧化反应。
7.根据权利要求5的方法，包括用含水酸溶液进行水解。
8.根据权利要求1的方法，还包括在所说还原反应前，氧化(25R)-16β，26-二羟基胆固醇，生成(25R)，16-氧-26-羟基胆固醇;使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇同对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯;和使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
9.根据权利要求1的方法，还包含在所说还原反应前，氧化(25R)-16β-26-二羟基胆固醇，生成(25)-16-氧-26-羟基胆固醇，使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇同对-甲苯磺酰氯缩合，生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3，36-二甲苯磺酸酯;水解(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-3，26-二甲苯磺酸酯生成(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇26-甲苯磺酸酯;和使(25R)-16-氧-26-羟基胆固醇-26-甲苯磺酸酯同苯二酰亚胺盐反应，生成(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
10.(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇。
全文摘要
本发明涉及由(25R)-16-氧-26-苯二酰亚氨基胆固醇制备(25R)-26-氨基胆固醇的方法，(25R)-26-氨基胆固醇是胆固醇生物合成的一个有效的抑制剂。
文档编号C07J9/00GK1084856SQ9310809
公开日1994年4月6日 申请日期1993年7月2日 优先权日1992年7月2日
发明者S·R·威尔森 申请人:纽约大学
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