一种红曲色素的生物表面活性剂提取方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一种红曲色素的生物表面活性剂提取方法。

背景技术：

红曲色素的商品名叫红曲红，是由红曲霉菌产生的一类重要次级代谢产物，在食品行业有广泛应用，也是目前世界上唯一获得批准的食用微生物色素。红曲的抑菌作用最早在《天工开物》中即有明确记载：“凡丹曲一种，法出近代。其义臭腐神奇，其法气精变化。世间鱼肉最朽腐物，而此物薄施涂抹，能固其质于炎暑之中，经历旬月蛆蝇不敢近，色味不离初，盖奇药也”。有关红曲色素抑菌性的报道很多，但关于红曲对何种菌株有抑制作用的结果并不完全相同，多数资料显示，红曲对金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑制作用，对黑曲霉、青霉、黄曲霉没有抑制作用，但对大肠杆菌抑制作用的报道并不一致。并且由于采用红曲来源、种类、生产方式不同，可能所含的抑菌成分也并不相同(赵树欣，张建玲.红曲抑菌物质研究的现状与展望.中国酿造.2011；3:5-8)。现有市售红曲色素的抑菌效果往往十分有限，这主要是受提取技术的影响，导致抑菌物质的成分和含量不同以及抑菌活性的差异。

红曲色素的提取一般采用水提、乙醇等有机溶剂萃取和浊点萃取等。水提法成本低，但提取效率较低，产品的抑菌效果较差(赵树欣，李凤美.酿酒红曲、色素红曲、功能红曲的对比及抑菌性研究.中国食品添加剂.2007；1:96-99)。乙醇等有机溶剂萃取应用最广泛，但成本较高，也增加了提取过程的爆炸风险。近年来，利用化学合成的非离子表面活性剂进行原位萃取发酵的方法受到关注。cn103224958a公开了一种萃取发酵和调控ph制备红曲色素的方法，通过调节含非离子表面活性剂tritonx-100的发酵培养基的ph值，实现了胞内色素的萃取发酵和浊点萃取，可提高红曲色素的产量。cn108251457a公开了一种复合萃取剂及利用复合萃取剂促进红曲色素生产的方法，将非离子表面活性剂span80的胶束溶液和花生油按一定比例结合作为萃取剂，实现了胞内红曲色素的萃取发酵和浊点萃取，增加了色素产量。然而，化学表面活性剂不可食用，色素需进一步提纯才能符合标准，分离步骤繁琐、也给色素产量带来了损失。

生物表面活性剂是一类由微生代谢产生具有表面活性的物质。常见的生物表面活性剂包括鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、表面活性剂素和皂苷等，生物安全性好，部分生物表面活性剂已实现规模化生产，成本较低，并且在医药、食品、洗涤和生态修复等领域得到广泛应用。

因此，提供一种无需分离化学表面活性剂、生物安全性好的红曲色素生物表面活性剂提取方法具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明对红曲色素的提取剂和提取方法进行筛选和优化，预料不到地发现：通过将鼠李糖脂和槐糖脂两种生物表面活性剂按一定比例复配，用于提取红曲霉固态发酵产生的红曲色素，可明显提高红曲色素的提取率，具有抑菌活性物质——糖肽的提取率也进一步提高，同时，糖肽被包裹在生物表面活性剂形成的胶束中，可与生物表面活性剂协同强化抑菌作用，实现广谱抑菌特性，且无需分离表面活性剂，生物安全性好，有利于拓展红曲色素在食品等行业中更广泛的应用。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供一种红曲色素的生物表面活性剂提取方法，包括以下步骤：

s1：取红曲菌种，利用麦芽汁培养基活化后形成种子液，备用；

s2：将大米蒸熟制成熟米饭，室温放凉，备用；

s3：将s1制得的种子液接种到s2制得的熟米饭中，以熟米饭重量计的接种量为40～60ml/kg，固态发酵形成红曲米；

s4：取复配生物表面活性剂，加水形成胶束水溶液，调ph至6.5～7.5，作为复配提取剂；所述复配生物表面活性剂由鼠李糖脂和槐糖脂按3～5:1的质量比复配得到；

s5：取s4制得的复配提取剂按5～15ml:1g的体积质量比加入到s3制得的红曲米中，浸提得到浸提液，浸提条件为：160～250r/min、22～27℃、浸提8～12h；

s6：将s5制得的浸提液离心，收集上清液，得到红曲色素提取液。

采用上述技术方案，鼠李糖脂为阴离子型生物表面活性剂，槐糖脂是酸型和内酯型的混合型生物表面活性剂，通过将鼠李糖脂和槐糖脂两种生物表面活性剂按一定比例复配，用于提取红曲霉固态发酵产生的红曲色素，可明显提高红曲色素的提取率，具有抑菌活性物质——糖肽的提取率也进一步提高，同时，糖肽被包裹在生物表面活性剂形成的胶束中，可与生物表面活性剂联合强化抑菌作用，实现广谱抑菌特性，且无需分离表面活性剂，生物安全性好，有利于拓展红曲色素在食品等行业中更广泛的应用。

优选地，所述红曲菌种为紫色红曲，其拉丁学名为monascuspurpureus。本发明中使用的紫色红曲购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：cicc5013。

优选地，所述胶束水溶液中，复配生物表面活性剂的浓度为2～5g/l。

更优选地，所述胶束水溶液中，复配生物表面活性剂的浓度为4g/l。

优选地，所述复配生物表面活性剂由鼠李糖脂和槐糖脂按4:1的质量比复配得到。

优选地，所述麦芽汁培养基的浓度为4～6°bé。

优选地，所述活化的条件为：25～30℃、100～200r/min下通风震荡培养40～50h。

优选地，所述固态发酵的条件为：25～30℃、通风培养10～15d。

优选地，所述离心的条件为：18～22℃、3500～4500r/min离心5～15min。

此外，本发明还提供红曲色素的生物表面活性剂提取方法制得的红曲色素提取液。红曲色素提取液在-45～-80℃下预冷5～10h后，真空冷冻干燥8～12h直至样品室压力降至10bar以下，制得红曲色素干粉。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明将生物表面活性剂用于形成胶束进行红曲色素的提取，通过将鼠李糖脂和槐糖脂两种生物表面活性剂按一定比例复配，在提高红曲色素提取率的同时，实现了抑菌活性物质——糖肽的高效提取。与水提技术相比，本发明的提取率高，产品抑菌效果好；与乙醇等有机溶剂萃取技术相比，本方法没有易燃易爆风险，安全系数高，提取率更高，同时产品抑菌范围更广、效果更好；与以化学合成非离子表面活性剂为基础的浊点萃取相比，本发明所用生物表面活性剂无需与红曲色素进一步分离，节省成本的同时也避免了纯化步骤过多导致色素产量的损失。

附图说明

图1本发明方法得到的红曲色素提取液的抑菌原理示意图；其中，1指糖肽；2指生物表面活性剂胶束；3指增溶了糖肽的生物表面活性剂胶束；4指糖肽入侵细胞；5指胶束破坏细胞膜；6指胶束破坏细胞膜后向细胞内释放糖肽；7指微生物细胞膜。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明实施例中，所涉及的材料均为市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。例如：紫色红曲购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：cicc5013。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1红曲色素的生物表面活性剂提取方法

一种红曲色素的生物表面活性剂提取方法，包括以下步骤：

s1：取紫色红曲，利用5°bé麦芽汁培养基活化后形成种子液，备用；活化的条件为：28℃、150r/min下通风震荡培养48h；

s2：将大米蒸熟制成熟米饭，室温放凉，备用；

s3：将s1制得的种子液接种到s2制得的熟米饭中，以熟米饭重量计的接种量为50ml/kg，固态发酵形成红曲米；固态发酵的条件为：28℃、通风培养14d。

s4：取复配生物表面活性剂，加水形成胶束水溶液，作为复配提取剂；所述复配生物表面活性剂由鼠李糖脂和槐糖脂按4:1的质量比复配得到，复配生物表面活性剂的浓度为4g/l；

s5：取s4制得的复配提取剂按10ml:1g的体积质量比加入到s3制得的红曲米中，浸提得到浸提液，浸提条件为：200r/min、25℃、浸提10h；

s6：将s5制得的浸提液离心，离心的条件为：20℃、4000r/min离心10min，收集上清液，得到红曲色素提取液。

实施例2红曲色素的生物表面活性剂提取方法

一种红曲色素的生物表面活性剂提取方法，包括以下步骤：

s1：取紫色红曲，利用6°bé麦芽汁培养基活化后形成种子液，备用；活化的条件为：30℃、200r/min下通风震荡培养40h；

s2：将大米蒸熟制成熟米饭，室温放凉，备用；

s3：将s1制得的种子液接种到s2制得的熟米饭中，以熟米饭重量计的接种量为45ml/kg，固态发酵形成红曲米；固态发酵的条件为：30℃、通风培养10d。

s4：取复配生物表面活性剂，加水形成胶束水溶液，作为复配提取剂；所述复配生物表面活性剂由鼠李糖脂和槐糖脂按3:1的质量比复配得到，复配生物表面活性剂的浓度为4g/l；

s5：取s4制得的复配提取剂按12ml:1g的体积质量比加入到s3制得的红曲米中，浸提得到浸提液，浸提条件为：180r/min、23℃、浸提9h；

s6：将s5制得的浸提液离心，离心的条件为：18℃、3800r/min离心12min，收集上清液，得到红曲色素提取液。

实施例3鼠李糖脂和槐糖脂复配比例及总浓度对红曲色素提取率的影响

s1：取紫色红曲斜面菌种，用接种环取一环到30ml5°bé麦芽汁培养基中，28℃、150r/min下通风震荡培养48h后，形成种子液，备用；

s2：将大米蒸熟制成熟米饭，室温放凉备用；

s3：取5ml种子液接种到100g熟米饭中，固态发酵形成红曲米；固态发酵的条件为：28℃、通风培养14d；

s4：按不同比例分别复配鼠李糖脂和槐糖脂，比例分别为1:2(w/w)、1:1(w/w)、2:1(w/w)、3:1(w/w)、4:1(w/w)、5:1(w/w)，形成复配生物表面活性剂；

s5：分别取2g、3g、4g和5g上述复配后的复配生物表面活性剂，用超纯水定容到1l，分别形成浓度为2g/l、3g/l、4g/l和5g/l胶束水溶液的复配提取剂；

s6：分别取10g红曲米，分别加入100ml相应的复配提取剂，在200r/min和25℃条件下、浸提10h；

s7：分别将上述浸提液在20℃、4000r/min下离心10min，去除沉淀，收集上清液即是红曲色素提取液；

s8：利用721型紫外可见分光光度计在od510nm下分别检测提取液中红曲色素的吸光度，结果如表1所示。

表1提取液中红曲色素在od510nm下的吸光度值

当鼠李糖脂和和槐糖脂的复配比例在4:1(w/w)时，提取液在od510nm下具有更高的光吸收(3.872)，说明红曲色素浓度更高。当提取液浓度从2g/l逐步提高时，提取液在od510nm下的光吸收先升高，随后在4g/l保持在3.8左右。再继续提高提取液浓度到5g/l并不会带来色素浓度的提高。说明当鼠李糖脂和槐糖脂的复配比例为4：1(w/w)，浓度为4g/l时，达到了红曲色素的最佳提取效果。接下来的实施例中，鼠李糖脂和槐糖脂复配提取剂的比例和浓度设置分别在4:1(w/w)和4g/l。

实施例4不同提取法对红曲色素提取效率的对比

1)：按照实施例3的方法制备红曲米，取18份红曲米，每份10g，随机分成6组，每组设置三个平行实验，分别加入100ml超纯水、70％乙醇水溶液、4g/l三七皂苷水溶液、4g/l鼠李糖脂水溶液、4g/l槐糖脂水溶液和4g/l复配提取剂水溶液作为提取剂，在200r/min和25℃条件下、浸提10h。

2)：按照实施例3的方法，浸提液离心后，分别得到不同组别的提取液，并分别检测其在od510nm下的吸光度值，如表2所示。

3)：以水提法为基准，计算乙醇提取法、不同生物表面活性剂提取法和复配生物表面活性剂提取法对红曲色素的相对提取率，如下式计算：

相对提取率＝(乙醇提取法/生物表面活性剂提取法提取液的od510值)/(水提法提取液的od510值)

表2不同提取方法提取率的对比

从表2可以看出，不同提取剂、不同提取方法下，红曲色素的提取率具有明显差异。常用的70％乙醇提取法比水提法提高了1.15倍，三七皂苷和槐糖脂提取法相比70％乙醇的提取率更低，鼠李糖脂提取法相比70％乙醇的提取率更高，而本方法的复配生物表面活性剂提取法可进一步提高相对提取率至3.34。这可能是因为阴离子型鼠李糖脂和内酯型与酸型槐糖脂按一定比例复配后，表面活性剂类型更丰富，可以对不同类型的红曲色素进行有效提取，提高效率。因此，相对于传统的水提和乙醇提取法以及单独的鼠李糖脂和槐糖脂提取法，本发明提供的复配生物表面活性剂提取方法的提取率更高。

实施例5不同提取方法对抑菌物质提取效率的对比

1)：分别取实施例4中超纯水、70％乙醇水溶液、4g/l鼠李糖脂水溶液、4g/l槐糖脂水溶液和4g/l复配提取剂水溶液的提取液各10ml，分别注入到90mm培养皿中。

2)：将培养皿加盖后置于超低温冰箱，预冷至-80℃。

3)：将预冷的培养皿置于冷冻干燥机搁板上，冷冻干燥10h以上，直至形成红曲色素干粉。

4)：将上述干粉分别用10ml超纯水溶解，形成红曲色素水溶液，置于4℃下保存备用。

5)：分别取2g活性炭加入上述红曲色素水溶液中，25℃下震荡2h，至脱色完毕。

6)：分别用毛细管吸取等量脱色液，点样在gf254硅胶板上进行薄层层析，随后分别用茚三酮和蒽酮-硫酸法进行显色。

7)：观察斑点颜色并计算比移值(rf值)。

结果表明，超纯水提取液中没有观察到茚三酮显色和蒽酮-硫酸法显色后的斑点，70％乙醇水溶液、4g/l鼠李糖脂水溶液、4g/l槐糖脂水溶液和4g/l复配提取剂水溶液提取的红曲色素中分别观察到了茚三酮显色后的2个斑点。茚三酮显色后，2个斑点均显蓝紫色，说明这种物质含有肽组分。70％乙醇水溶液提取液样品的薄层层析板上，2个斑点经蒽酮-硫酸法显色后呈现墨绿色，说明这种物质含有糖组分；4g/l鼠李糖脂水溶液提取液和4g/l槐糖脂水溶液提取液的薄层层析板上蒽酮-硫酸法显色呈现3个墨绿色斑点，而复配提取剂水溶液的薄层层析板上蒽酮-硫酸法显色呈现4个墨绿色斑点。这是因为，除含有与70％乙醇水溶液提取液样品相同的斑点外，鼠李糖脂和槐糖脂提取液还呈现额外的墨绿色斑点，说明鼠李糖脂和槐糖脂提取液都含有额外的糖组分。70％乙醇水溶液和复配提取剂样品中观察到的相似斑点的rf值分别为0.2和0.5，与文献(赵树欣，李凤美，曾露燕.红曲中的一种糖肤类抑菌物质的研究.食品与发酵工业.2007；33:42-44)报道基本一致，可判断其为糖肽类物质。

实施例6不同提取法红曲色素的抑菌效果对比

采用滤纸片法对不同提取法的红曲色素进行抑菌实验测试。

s1：分别取实施例4中超纯水、70％乙醇水溶液、4g/l鼠李糖脂水溶液、4g/l槐糖脂水溶液和4g/l复配提取剂水溶液的提取液，分别用直径为5mm的滤纸片在提取液中浸泡10min，然后取出，晾干水分，备用。

s2：分别取实施例4中的超纯水和70％乙醇水溶液提取的提取液，分别加入与复配提取剂法中相同浓度的复配生物表面活性剂(4：1，w/v)，然后再分别用直径为5mm的滤纸片在溶液中浸泡10min，然后取出，晾干水分，备用。

s2：分别将上述滤纸片贴于已涂布不同微生物的营养琼脂平板上，30℃下静置培养48h。

s3：记录各个滤纸片的抑菌圈直径：直径大于10mm，用“+++”表示，代表抑菌效果显著；8mm和10mm之间，用“++”表示，代表抑菌效果较强；6mm到7mm之间，用“+”表示，代表抑菌效果一般；6mm以下，用“±”表示，代表抑菌效果不确定；“-”表示代表没有抑菌效果。结果如表3所示。

表3不同提取方法提取的红曲色素对不同测试菌的抑制效果

从表3可知，超纯水提取的红曲色素几乎没有抑菌效果；超纯水提取液添加复配生物表面活性剂后，也仅仅对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。70％乙醇水溶液的提取液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有显著的抑制作用，对蜡状芽孢杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌和黑曲霉一定的抑制效果，但对两种酵母菌和青霉菌没有抑制效果；70％乙醇水溶液的提取液添加复配生物表面活性剂后，对这两种酵母菌和青霉菌依然没有抑菌效果。单独使用鼠李糖脂的提取液可对铜绿假单胞菌、面包酵母和啤酒酵母以外的7种微生物产生抑菌效果，而单独使用槐糖脂的提取液可对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、变形杆菌和青霉菌以外的6种微生物产生抑菌效果；其中，单独使用鼠李糖脂的提取液对枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产生显著的抑菌效果，单独使用槐糖脂的提取液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、面包酵母和啤酒酵母产生显著的抑菌效果。复配两种生物表面活性剂的提取液，尽管复配提取法对面包酵母和啤酒酵母的抑菌能力没有单独使用槐糖脂提取法高，但依然能达到“++”的较强抑菌效果。总之，复配提取法的红曲色素提取液对测试的10种菌均具有抑菌效果，主要是因为复配提取剂能提取出更多糖肽类抑菌物质，并且生物表面活性剂与糖肽的抑菌效果起到了叠加作用，抑菌原理示意图如图1所示。

糖肽类抑菌物质单独侵入微生物细胞的时候，会受到细胞膜组分的阻挡作用；而复配生物表面活性剂形成的胶束单独侵入细胞时，只是破坏了细胞膜；当两者联合作用时，胶束在破坏细胞膜后，会将胶束内部增溶的糖肽类物质释放到细胞内，从外至内破坏微生物细胞活性。两者联合，抑菌作用得到协同强化。

本发明提供的红曲色素提取方法，操作简便、安全、提取率高、抑菌效果好，有利于拓展红曲色素的应用范围，易于推广。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

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