一种富含类胡萝卜素蛹虫草饼干的制备方法与流程

本发明属于蛹虫草技术领域，尤其涉及一种富含类胡萝卜素蛹虫草饼干的制备方法。

背景技术：

目前，蛹虫草(cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草，是虫草属的一种真菌子实体，在中国传统医学中，它常被用来治疗肝肾疾病。蛹虫草具有多种药理活性功能成分，其中包括虫草多糖、腺苷、麦角甾醇等虫草属真菌中普遍存在的活性分子，以及蛹虫草菌特有的虫草素和抗癌药物喷司他丁。此外，蛹虫草菌中部分活性物质的含量远远超过冬虫夏草，而冬虫夏草本身又有产量低、消耗少等缺点，使蛹虫草顺势发展成为“餐桌上的新宠”，也成为科研人员“心头肉”。此外，2009年蛹虫草被国家卫生部正式批准为新资源食品，更是给蛹虫草资源的综合利用带来了无限的发展潜力。针对野生蛹虫草菌资源匮乏、分布限制等问题，为满足市场需求，对蛹虫草人工规模栽培技术进行了研究，取得了一定的成果，目前已处于高度成熟阶段。目前比较流行的人工培养方法主要有液态发酵菌丝培养、人工子体培养和昆虫活体人工培养。在这些方法中，用液态发酵的方法培养出了蛹虫草的菌丝体；用蚕蛹活体进行寄生培养，用菌丝体发酵的方法培养出了固态培养基，常见的人工固体子实体培养法又以大米或小麦为培养基，多以获取子实体为目的；第一种方法通常以柞蚕、家蚕或活蚕等为营养基质，最后收获的是蛹虫草菌和虫的复合体addin.cite。当然，也有一些创新的培养方法，如刘红等学者就采用杂粮培养基培养蛹虫草菌；赵庆枫等则更多地采用直接用鸡蛋作为培养基培养“蛋虫草”。总而言之，不同的培养方法也会使采收的蛹虫草实体或菌丝体在产量和活性物质含量方面产生显著差异，突出了培养基质在蛹虫草人工培养过程中的作用。

野生蛹虫草和人工培养的蛹虫草之所以能迅速得到研究者的青睐并得到大众的认可，其根本原因在于蛹虫草比冬虫夏草具有更高或更好的活性。虽然有很多研究表明蛹虫草培养基在使用后仍有很多活性成分残留，因此很有可能被再次利用。但目前对蛹虫草的研究主要集中于其子实体部分。以下对目前国内外有关蛹虫草子实体活性的研究进展作一简要综述：

蛹虫草类胡萝卜素的研究概况：真菌中的类胡萝卜素因其天然、安全等特性，已成为天然类胡萝卜素的重要来源。虽然对真菌产生类胡萝卜素的研究已有许多，而且目前对三孢布拉霉产生类胡萝卜素的研究已进入工业化规模生产阶段，但对其它真菌产类胡萝卜素的研究却是一项长期的工作，因为三孢布拉霉存在着生产周期过长和菌种容易衰退等问题。自从2005年付鸣佳利用紫外可见光谱法和硅胶层析法对蛹虫草进行了首次鉴定以来，关于蛹虫草类胡萝卜素的大量研究已陆续开展。此外，蛹虫草还被确定为目前已报道的所有大型食药用真菌中类胡萝卜素含量最高的菌种，使人们对蛹虫草这种真菌的研究意义更加明确。为富集蛹虫草类胡萝卜素，人们对其色素合成机理进行了大量研究。付鸣佳等研究发现，蛹虫草类胡萝卜素的产生离不开温度和蓝光，且两者相互作用；杨莹等发现，不同来源的氮源及其浓度也会影响子实体类胡萝卜素含量的变化，这种变化会引起菌体内活性成分含量的变化；李济之探究蛹虫草子实体培养过程中co2浓度变化是否会造成菌体中活性成分含量变化时，最后发现，co2的浓度对菌体内类胡萝卜素含量的变化影响不大，但对子实体外观品质及其他活性物质的含量影响较大；孙德军等采用研磨法提取类胡萝卜素，比较不同菌株来源的子实体中含量的差异，为其色素在具体生产中菌株的选择提供重要参考意义；另外，刘聪还采用真菌作为激发子辅助蛹虫草菌共同发酵富集类胡萝卜素，发现起到激发作用的物质其实是除去蛋白质和多糖之后的小分子且其激发效果十分显著。为了有效地提取蛹虫草中的类胡萝卜素，人们进行了各种提取方法的试验。此前张志军等就采用了酸热浸提法，发现在此方法中丙酮为最佳溶剂；王陶等在酸热提取法的基础上增加了超声波辅助处理步骤，有效地提高了类胡萝卜素的收率。关于蛹虫草类胡萝卜素结构鉴定方面的工作一直是一项进行式的任务，2010年，闫喜涛等首次从人工栽培蛹虫草中分离出叶黄素ivl2成分；可能培养基中的配方差异也会影响到类胡萝卜素的类型，2012年，陈策等从蛹虫草中分离出另一种重要的天然色素--玉米黄素，这也是第一次从真菌中分离得到玉米黄素；2013年，dong等还从蛹虫草子实体中分离鉴定出四种色素，即：cordyxanthin-i，cordyxanthin-ii，cordyxanthin-iii，cordyxanthin-iv，这四种色素被认定是与叶黄素类似的物质，具有极强的水溶性，这是其不同于传统类胡萝卜色素的一大特征，理论上应具有更强的生物活性功能。关于蛹虫草类胡萝卜素的生物活性研究主要集中在抗氧化性方面以及抑菌性方面，但关于其是否具有与叶黄素相似的保护视网膜的作用尚不清楚。继dong以后，也有许多学者相继从各种来源的蛹虫草子实体中提取到类胡萝卜素成分，其中水溶性色素成分是一大研究热点。色素纯化的手段目前主要集中在薄层色谱法、大孔树脂吸附、硅胶柱层析等，鉴定大多采用紫外分光光度法、红外光谱法、液质联用以及高分辨质谱等。目前，蛹虫草类胡萝卜素的实际应用尚未普遍推广，有关方面的学者们也一直在研究蛹虫草产品的开发，目前蛹虫草产品的开发主要集中在三个方向：第一是调味品方向；第二是复合饮料，即蛹虫草的子实体浸提液或者其干制粉末与其他辅料按照一定比例勾兑而成；第三类是添加有蛹虫草的干制产品，如烘烤型产品曲奇饼干等。除此之外，简锦辉等人还利用固体发酵获得的蛹虫草色素，开发出蛹虫草黄素粉末、虫草膏等一系列新产品。但是这些产品还处于研发阶段，目前还不能上市销售；此外还有学者另辟蹊径，尝试用蛹虫草色素在蛋白质纤维织物上染色，发现经蛹虫草色素染色的织物对大肠杆菌有47.8％的抑制率，对金黄色葡萄球菌几乎能够100％的抑制率，这无疑增加了蛹虫草色素进入服装和其他领域的理论依据。

类胡萝卜素是类异戊二烯的代谢产物，基础化学分子式为c40h56，其中绝大多数的类胡萝卜素均是亲脂性成分，当然，在后续研究中也发现了一些水溶性较强的类胡萝卜素。天然类胡萝卜素有多种来源，主要有两种：一种是光合生物，包括植物类、藻类和蓝藻细菌；另一种是非光合生物，例如古生菌、细菌、真菌类以及蚜虫类动物等。对于所有的光合生物来说，类胡萝卜素在进行光合作时，主要起吸收光的作用，目的是使主体生物免遭光的伤害；对于非光合生物，类胡萝卜素主要是作为一种色素物质存在，其颜色从橘色到红色变化。除了蚜虫类动物外，一般的动物都没有自主合成的能力，只能依靠摄食来补充。根最新研究报告，类胡萝卜素的主要功能活性大致可以归纳为以下几点：①作为维生素a的前体物质；②作为视网膜色素的主要组成色素：叶黄素和玉米黄质；③提高认知表现能力；④预防和治疗心血管疾病；⑤有利于促进骨骼健康；⑥类胡萝卜素能通过吸收周围环境中的紫外线，使机体免遭损伤；⑦良好的体重管理剂；⑧有利于增强免疫力；⑨有效预防和改善肿瘤疾病等。

(1)类胡萝卜素的类别

类胡萝卜素是一大类亲脂性生物活性化合物，可按不同的分类标准对类胡萝卜素进行分类，按其化学结构组成可将其分为两大类。其中之一是叶黄素类物质(含氧)，分子式为c40h56o2，主要包括叶黄素和玉米黄质，它们彼此间具有同分异构性结构，称为眼底黄斑色素；另一种是胡萝卜素物质(纯碳氢化合物)，分子式为c40h56，其中具有代表性成分有β-胡萝卜素和番茄红素等。

类胡萝卜素的提取工艺研究进展：虽然近几年专家学者为提高类胡萝卜素的提取效率做了很多工作，但对某些组成基质比较复杂的原料，仍然存在着提取效率低、不易提取等问题。这种情况可能是因为这些原料自身结构中存在的物理或者化学屏障阻碍了类胡萝卜素的流动，例如：植物和藻类的细胞壁就是复杂多样且坚固难破的，因此，获得色素的第一步就应该是打破细胞壁。研究人员michelon等人从法夫酵母菌中提取虾青素的时候就发现，合适的破壁手段可以大大提高色素的产量，与提取效率最低的方法相比，色素的产量增加最多可高达8～10倍；此外，组织中有的一些类胡萝卜素会和周围的大分子(如蛋白质、脂肪酸等)形成交联，这需要一些前处理方法来将它们与大分子分离开来。此外，不同原料中的类胡萝卜素的极性本来就有差异，那么萃取溶剂的选择也是一个很大的考验。举例来说，对含水量较高的提取原料，有研究表明，与其他有机溶剂相比，丙酮和乙醇这两种溶剂萃取色素效率更高。总之，样品提取前的预处理过程是非常重要的。常见的样品前处理方法主要包括物理、化学或者生物方法，这些方法的原理都是破坏样品细胞壁或某些存在的内在屏障，使得胞内色素物质能够更容易提取。物理手段主要有：烹饪、脱水、浸泡、冷冻、低温粉碎等；化学手段主要有：酸化、碱化和表面活性剂的添加等；生物手段主要通过添加生物酶使细胞壁破碎。综上所述，针对不同的样本细胞的组成和特性，前期处理的方法是不同的。目前国内外主流的类胡萝卜素的获取手段主要是在溶剂提取的基础上，通过微波，压力，超声波，脉冲电场，生物酶等辅助处理。此外，针对原料特性的不同，也有采用超临界流体萃取的方法，鉴于传统溶剂提取法多采用有机试剂，对环境等造成不可避免的污染伤害，因此出现了一种新的提取方法--绿色溶剂提取法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)目前对三孢布拉霉产生类胡萝卜素的研究已进入工业化规模生产阶段，但对其它真菌产类胡萝卜素的研究却是一项长期的工作，因为三孢布拉霉存在着生产周期过长和菌种容易衰退等问题。

(2)近几年专家学者为提高类胡萝卜素的提取效率做了很多工作，但对某些组成基质比较复杂的原料，仍然存在着提取效率低、不易提取等问题。

(3)传统的类胡萝卜素溶剂提取法多采用有机试剂，对环境等造成不可避免的污染伤害。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种富含类胡萝卜素蛹虫草饼干的制备方法。

本发明是这样实现的目的在于提供一种所述的富含类胡萝卜素蛹虫草干的制备方法，所述蛹虫草功能性饼干的制备方法包括以下步骤：

第一步，原辅料的预处理：鲜蛹虫草子实体与培养基一起置于恒温干燥箱中，温度设为60℃，时间12h；用中草药超微粉碎机对全干后的原料进行初步粉碎，再手工过筛得到蛹虫草全粉；在避光、-4℃低温环境下保存原料粉备用；

第二步，面团调制：将黄油置于容器中，在室温下放置至软化或者水浴加热；待黄油充分融化之后，加入木糖醇，打发至糖油不分离状态；将全蛋液加入糖油混合体系中，再次打发混匀；依次将其它材料加入容器中拌匀，整个过程采用从下往上翻拌的手法反复揉捏面团直至面团表面出油且达到不粘手套的状态即得到虫草饼干面团，面团静置10min；最后将面团置于模具中塑型，放入冰箱中冷冻30min；

第三步，成品：取出第二步中冷冻好的饼干胚，均匀切片；将烤箱调好上下火温度后，预热；将烤箱设置成上下烤模式，上烤温度160℃、下烤温度110℃，烘烤时间为10分钟至饼干表面颜色在虫草粉颜色的基础之上呈现微微发黄，出锅冷却之后即可制得成品；

第四步，冷却与包装：烤制成熟的产品需冷却，包装形式采用真空避光包装。

进一步，所述蛹虫草粉末的制备，将新鲜蛹虫草子实体放置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，再将其置于高速中药粉碎机中进行初步粉碎再过60目筛，装于干净容器中，在低温干燥避光条件下密封保存备用。

进一步，所述提取溶剂为丙酮和60％体积分数的乙醇溶液，比例为2：1。

进一步，所述复合酶的选择以及添加比例，采用纤维素酶和果胶酶两种酶共同作用以裂解细胞壁提取色素，选取纤维素酶：果胶酶＝2：1。

进一步，所述复合酶协助提取法提取蛹虫草类胡萝卜素，新鲜蛹虫草子实体在60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用；称取蛹虫草粉末2g，加入体积比为2：1的20ml丙酮和60％体积分数乙醇混合溶液以及复合酶并调溶液的ph至所需，将混合液置于恒温水浴中酶解一定时间，4500r/min离心10min，将上清液稀释100倍，并准确吸取200μl置于96孔板中，用酶标仪在445nm波长条件下扫描测定提取液的吸光度值，根据标准曲线方程得到蛹虫草类胡萝卜素的提取得率。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的富含类胡萝卜素蛹虫草饼干，率先采用生物酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素，该方法环保方便、可操作性强，产品得率较高，适用于工业化生产；不同品种来源的蛹虫草中提取的色素，虽有差异，但均表现出较强的水溶性。综合多种鉴定手段，可确定该色素为类胡萝卜素一类物质。实验结果如下：

1)生物酶辅助提取最佳工艺条件：ph＝3.8、酶解时间43.62min、酶解温度52.41℃、酶浓度0.5％。在此条件下，蛹虫草类胡萝卜素的得率为3888.34μg/g。2)蛹虫草色素纯化物的特征显色反应、紫外及红外光谱分析结果均表明，蛹虫草色素具有类胡萝卜素的一般特征，其中质谱分析表明，该色素中主要含5种成分，占总物质含量的66.24％。在正离子模式下，它们的精确质量数分别是m/z629.1862，m/z525.4265，m/z495.3362，m/z523.2778，m/z537.1624。根据本配方得到的产品质量符合国家有关标准。

经质构特性分析最优配方下得到的富含类胡萝卜素蛹虫草饼干，硬度达1377.5±30.57g，内聚性0.226±0.018，咀嚼性为2.246±15.95g，符合酥性饼干的感官要求。另外，其理化及微生物检测结果均符合国标要求。主要营养成分分析结果显示每100g饼干中含有脂肪22.4g、蛋白质24.8g、碳水化合物58.5g、膳食纤维11.4g，总能量达2341.8kj/100g。三大营养素的供能比也符合中国肠内肠外营养学会(cspen)指南要求。本产品中未额外添加类胡萝卜素强化剂，成品中总类胡萝卜素含量达67.9mg/100g。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的蛹虫草功能性饼干的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的蛹虫草类胡萝卜素粗提物的光谱扫描图。

图3是本发明实施例提供的不同浓度乙醇溶液中色素的溶解性示意图。

图4是本发明实施例提供的不同溶剂体系中色素的溶解性示意图。

图5是本发明实施例提供的β-类胡萝卜素标准曲线示意图。

图6是本发明实施例提供的酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图7是本发明实施例提供的ph对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图8是本发明实施例提供的酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图9是本发明实施例提供的酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图10是本发明实施例提供的ph与酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图11是本发明实施例提供的ph与酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图12是本发明实施例提供的酶解时间与酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响示意图。

图13是本发明实施例提供的大孔吸附树脂的活化步骤示意图。

图14是本发明实施例提供的大孔吸附树脂洗脱液的吸光值结果示意图。

图15是本发明实施例提供的蛹虫草类胡萝卜素uplc色谱图。

图16是本发明实施例提供的紫外可见光全波长扫描图。

图17是本发明实施例提供的各组分正离子ms/ms质谱分析图。

图18是本发明实施例提供的蛹虫草类胡萝卜素红外光谱图。

图19是本发明实施例提供的不同粒径蛹虫草全粉对感官评定的影响示意图。

图20是本发明实施例提供的蛹虫草全粉添加比例对产品感官品质的影响示意图。

图21是本发明实施例提供的木糖醇的添加量对产品感官品质的影响示意图。

图22是本发明实施例提供的小苏打的添加量对产品感官品质的影响示意图。

图23本发明实施例提供的蛹虫草功能性饼干产品展示示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛹虫草功能性饼干、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的蛹虫草功能性饼干的制备方法包括以下步骤：

s101，以类胡萝卜素的提取率为考察指标，通过单因素以及响应面试验共同确定生物酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取工艺。

s102，采用hp20型大孔树脂对色素粗样进行纯化，样品上样浓度为0.1mg/ml，洗脱液为10～90％乙醇溶液，洗脱速度2bv/h。

s103，色素纯化物鉴定：采用酶标仪在445nm下检测色素洗脱液的紫外光谱吸收情况；对纯化后的蛹虫草色素物进行类胡萝卜素的特征显色反应试验、uplc-dad-ms液质联用分析以及傅里叶红外光谱扫描分析。

s104，以产品感官质量为评定指标，采用单因素和正交试验设计，研制蛹虫草功能性饼干并建立了质量标准。

本发明提供的蛹虫草功能性饼干的制备方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的蛹虫草功能性饼干的制备方法仅仅是一个具体实施例而已。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、概述

1.1立题意义及主要内容

1.1.1立题意义

(1)天然来源的类胡萝卜素一直是研究的重点，其中，近几年在微生物来源方面尤其受到重视。蛹虫草作为现已报道的所有大型食药用真菌中类胡萝卜素含量最高的真菌，拥有巨大的研究潜力。但蛹虫草类胡萝卜素的提取工艺一直存在方法繁琐，提取效率低以及工业化生产不适宜等问题，因此本发明首次利用生物酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素并对其进行工艺优化，目的是提供一种更高效的提取方式，为其实现工业化生产提供理论支撑。

(3)随着居民生活水平的提高以及对健康营养意识的加强，未来以食疗为主的保健形式将成为主要发展方向。本发明拟计划以蛹虫草全粉为原料(子实体和培养基)研发一款富含类胡萝卜素蛹虫草饼干，将其主要适众人群定位于上班一族。

1.1.2主要内容

(1)以溶剂提取法为基础，利用纤维素酶和果胶酶两种生物酶协同提取蛹虫草子实体中的类胡萝卜素；通过单因素以及四因素三水平响应面试验，对该色素的提取工艺进行优化；

(2)构建体外人arpe-19细胞氧化应激损伤模型，探究蛹虫草类胡萝卜素对损伤模型的保护作用；

(3)以蛹虫草子实体及其培养基粉末为原料，研制出一款蛹虫草功能性饼干。采用感官评分作为主要参考标准，通过单因素以及正交试验，确定产品的最佳配方，制定质量标准。测定最佳配方下产品的理化指标、微生物指标、质构特性以及营养成分含量等。

1.2发明概述

而蛹虫草的类胡萝卜素具有很强的水溶性，这也是目前报道的所有大型食药用真菌中类胡萝卜素含量最高的一种。从理论上讲，蛹虫草类胡萝卜素应该具有很强的生物活性。本发明采用蛹虫草全粉为原料，研制出一款富含类胡萝卜素蛹虫草饼干。

方法：1)以类胡萝卜素的提取率为考察指标，通过单因素以及响应面试验共同探究生物酶(纤维素酶和果胶酶)辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取工艺；2)采用hp20型大孔树脂对色素粗样进行纯化，样品上样浓度为0.1mg/ml，洗脱液为10～90％乙醇溶液，洗脱速度2bv/h。3)色素纯化物鉴定：a、采用酶标仪在445nm下检测色素洗脱液的紫外光谱吸收情况；b、对纯化后的蛹虫草色素物进行类胡萝卜素的特征显色反应试验、uplc-dad-ms液质联用分析以及傅里叶红外光谱扫描分析。4)以产品感官质量为评定指标，采用单因素和正交试验设计，研制蛹虫草功能性饼干并建立了质量标准。

2、生物酶辅助提取蛹虫草类胡萝卜素的工艺优化

类胡萝卜素是一大类胞内色素，通常需要通过细胞壁破壁等预处理手段来达到最大程度的溶解。采用生物酶法进行破壁处理，是一种较为温和的方法，利用酶的特异性打开细胞壁，使胞内素得到充分释放。虽然生物酶辅助提取法已被广泛应用于许多原材料中，但尚未有报道运用该方法提取蛹虫草类胡萝卜素的相关研究。所以本发明拟在溶剂提取法的基础上，利用纤维素酶和果胶酶两种生物酶协同提取蛹虫草子实体中类胡萝卜素。先通过前期试验筛选出合适的有机提取溶剂，再通过单因素以及响应面试验共同确定色素提取的最佳工艺。本发明的开展一方面提供了一种更加高效、更适应于工业化生产的蛹虫草类胡萝卜素提取方式，另一方面也为该来源的色素得到进一步纯化鉴定、后续深入研究及生产应用奠定基础。

2.1材料与方法

2.1.1材料与试剂

(1)实验材料

本实验所使用的原材料蛹虫草新鲜子实体均由四川省巴中市南江宏信生物有限公司提供，其中该蛹虫草子实体的培养基为小麦培养基。

(2)主要试剂

表1主要试剂清单

2.1.2仪器与设备

表2主要仪器与设备

2.1.3试验方法

(1)蛹虫草粉末的制备

样品制备的方法参照邵颖等的方法并进行改进。将新鲜蛹虫草子实体放置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，再将其置于高速中药粉碎机中进行初步粉碎再过60目筛，装于干净容器中，在低温干燥避光条件下密封保存备用。

(2)提取溶剂的确定

为使得样品定量测定时溶剂体系与标准品保持一致，以便用酶标仪直接测定样品提取液吸光度时直接定量。本实验以溶解度为表征，参照dong的方法用乙醇溶液对色素粗提物进行溶解度探究，结果显示其在乙醇浓度为60％下的乙醇溶液中具有良好的溶解性。再选择丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜(dmso)、乙腈、60％乙醇溶液和丙酮与60％体积分数的乙醇混合溶液(2：1)作为探究对象，将蛹虫草子实体色素粗提物分别溶解于上述7种溶剂中，最终通过颜色辨别判断其溶解性从而确定最佳提取溶剂。结果显示丙酮和60％体积分数的乙醇溶液(2：1)能够溶解标准品β-类胡萝卜素，同时蛹虫草子实体当中的类胡萝卜素在其中能够很好的提取出来，因而最终确定本试验开展的提取溶剂为丙酮和60％体积分数的乙醇溶液，两者的比例为2：1，在此条件下提取得率最高。

(3)复合酶的选择以及添加比例的确定

蛹虫草类胡萝卜素为胞内色素，所以需要先破坏细胞壁然后才能使色素很好的释放出来。由于细胞壁是由纤维素和果胶构成，所以本试验拟采用纤维素酶和果胶酶两种酶共同作用以裂解细胞壁从而提取色素。为探究纤维素酶和果胶酶的最佳复合比例，本试验选取了纤维素酶：果胶酶(1：2)；纤维素酶：果胶酶(2：1)；纤维素酶：果胶酶(1：1)以及对照组，共四种方案进行预实验，预实验结果以提取溶液的吸光值来表征，结果显示复合酶比例为纤维素酶：果胶酶(2：1)条件下，吸光值可达到3.322，而其余两种条件下吸光值分别为2.355(纤维素酶：果胶酶＝1：2)，2.985(纤维素酶：果胶酶＝1：1)，对照组的吸光值为2.097。因此本试验选择纤维素酶和果胶酶按照2：1的比例进行复合。

(4)β-胡萝卜素标准曲线方程的建立

由于目前暂无蛹虫草类胡萝卜素标准品，所以本试验中蛹虫草类胡萝卜素的定量测定是参照dong等的方法，并在其方法的基础上进行改进。首先将预试验得到的蛹虫草类胡萝卜素粗提物用丙酮和60％体积分数乙醇水溶液(按2：1)比例配制而成并溶解，经酶标仪在380～600nm波长范围内进行光谱扫描分析，之后确定本试验的样品溶液的最大吸收峰在445nm处，以便提取之后对类胡萝卜素进行定量。配制标准曲线时，精确称取0.05mgβ-胡萝卜素标准品，加入50μl二氯甲烷试剂使之溶解，之后也用丙酮和60％体积分数乙醇混合溶液(比例＝2：1)定容到10ml。从配置好的母液(c＝5μg/ml)中分别吸取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml，用丙酮和60％乙醇的混合溶液定容至10ml，再用酶标仪在445nm下测定不同浓度β-胡萝卜素溶液的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准β-胡萝卜素溶液浓度为横坐标，作标准曲线，标准曲线图见图5。

线性回归方程：y＝0.1093x+0.0801，r2＝0.9992(2.1)

式中：x，β-类胡萝卜素的浓度，μg/ml；y，吸光值

类胡萝卜素含量计算公式：

式中：c，β-类胡萝卜素的含量，μg/g；v，丙酮和60％乙醇混合液体积，ml；m，粉末样品质量，g。

(5)复合酶协助提取法提取蛹虫草类胡萝卜素

新鲜蛹虫草子实体在60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用。称取蛹虫草粉末2g，加入20ml丙酮和60％体积分数乙醇混合溶液(体积比＝2：1)以及复合酶并调溶液的ph至所需，将混合液置于恒温水浴中酶解一定时间，4500r/min离心10min，将上清液稀释100倍，并准确吸取200μl置于96孔板中，用酶标仪在445nm波长条件下扫描测定提取液的吸光度值，根据标准曲线方程从而得到蛹虫草类胡萝卜素的提取得率。其中蛹虫草类胡萝卜素含量的计算方法见公式2.2。

(6)复合酶协助提取法的单因素试验

①酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：新鲜蛹虫草子实体在60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用。分别称取5份2g的原料粉末置于5个已编好号的锥形瓶中，然后分别加入丙酮和60％体积分数乙醇混合溶液(体积比＝2：1)20ml和复合酶，其中纤维素酶与果胶酶的混合酶添加量为0.5％，纤维素酶和果胶酶的添加比例按照预实验结果最佳比例2：1添加，调至ph为4，之后将5个锥形瓶分别置于温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的5个恒温水浴锅中进行酶解提取，酶解时间为50min，4500r/min离心10min，将上清液稀释100倍，并准确吸取200μl置于96孔板中，用酶标仪在445nm波长条件下扫描测定提取液的吸光度值，根据标准曲线方程从而得到蛹虫草类胡萝卜素的提取得率；

②ph对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他试验条件不变的基础上，探究ph＝(3、4、5、6、7)对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同上面①中所述；

③酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他试验条件不变的基础上，探究酶解时间＝(20、30、40、50、60min)对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同①；

④酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响：保持其他试验条件不变的基础上，探究酶浓度(质量分数)＝(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6％)对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响，实验操作同①。

(7)酶协助提取法的响应面工艺优化试验

根据上面单因素实验结果，根据box-behnken试验设计原理，选取酶解ph、酶解温度、酶解时间3个因素为响应因素，以蛹虫草类胡萝卜素的提取率为响应值，共设计17个试验点开展响应面试验分析，试验设计与结果见表3。

表3响应面试验因素水平表

(8)数据分析方法

采用design-expert10.0软件进行响应面试验设计与分析，每组实验重复3次，采用ibmspssstatistics软件处理数据，采用office2016软件进行绘图分析。

(9)验证性试验

按照上面2.1.3中试验原料的处理方法制备原料粉末，根据响应面实验设计的最佳工艺条件进行试验，测定该工艺条件下的蛹虫草类胡萝卜素的提取率。

2.2结果与分析

2.2.1样品测定扫描波长确定

将预先准备的样品采用酶标仪在380～600nm波长范围内进行紫外可见光光谱扫描，类胡萝卜素由于其中的共轭双键体系形成的光吸收载色体，除了使其有特殊的颜色外还有特征的吸收光谱，它可作为类胡萝卜素进行初步鉴定的依据。扫描结果见图2，光谱扫描图呈明显的三指特征峰，表示本试验提取出的蛹虫草色素提取物属于类胡萝卜素物质，这为试验的进一步开展提供了理论支撑。除此之外，出现三指特征吸收峰的位置分别在420nm、445nm、475nm处。其中，本试验中采用的原料蛹虫草的类胡萝卜素提取物在445nm处有最大的吸收峰，因此蛹虫草类胡萝卜素提取物的定量测定，扫描波长设定在445nm。

2.2.2提取溶剂的确定

通过溶解性试验判断，比较乙醇浓度在0～100％范围内，色素粗提物的溶解性。最终确定乙醇浓度为60％条件下色素提取物的溶解性最佳，该结果与dong的实验结果保持一致，其在不同浓度的乙醇溶液中的溶解性对照图结果见图3，其中色素溶液的浓度为1mg/ml；其中色素粗提取在不同溶剂体系中的溶解结果见图4，色素浓度为0.3mg/ml。图4从左至右溶剂体系分别为：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、dmso(二甲亚砜)、丙酮与60％乙醇溶液(2：1)、60％乙醇溶液，根据颜色深浅以及溶解程度的判断，最终确定复合酶共同作用提取蛹虫草子实体色素的最佳提取溶剂为丙酮与60％乙醇混合溶液，其中两者的混合比例为丙酮：60％乙醇＝2：1。

2.2.3β-胡萝卜素标准曲线的绘制

以β-胡萝卜素浓度为横坐标(μg/ml)，其吸光度值为纵坐标绘制标准工作曲线，得到β-胡萝卜素的标准工作曲线如图5所示。线性回归方程为y＝0.1093x+0.0801，相关系数r²为0.9992，说明β-胡萝卜素浓度在2～5μg/ml范围内与其吸光度值呈良好的线性关系。

2.2.4单因素试验结果

(1)酶解温度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

保持其它提取条件一致，提取ph＝4，提取时间为50min，复合酶添加浓度为0.5％，料液比为1：10，通过单因素试验来考查温度对于提取率的影响，结果见图6。结果显示，试验初期随着提取温度的上升，蛹虫草类胡萝卜素的提取率呈现上升的趋势，其中，当提取温度提高到50℃时，提取率最高，达到3082.34μg/g，但是，当提取温度继续增加到60℃时，提取率骤降，但仍旧高于其它几个温度下的提取率。分析其原因当提取温度上升到60℃时，高温使复合酶失去活性，因而提取率会有所降低；另外，60℃高温可能会造成蛹虫草类胡萝卜素结构损伤分解，致使其提取效果降低。

(2)ph对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

控制复合酶协助提取蛹虫草类胡萝卜素的其它提取条件一致，探究ph为3、4、5、6、7五种条件下，类胡萝卜素的提取率的变化。图7结果显示，提取体系的ph对于提取率具有显著的影响作用。从图7可以看出，当ph增加到4时，提取率达到最大值，为2249.77μg/g，继续增加提取体系ph，提取率反而呈现下降的趋势。这主要是因为酸性条件下有利于蛹虫草子实体细胞壁的降解从而更有利于色素的溶出，但是当提取环境过酸时会对色素分子本身结构造成一定的破坏，从而导致提取率呈现降低的趋势。

(3)酶解时间对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

保持其它提取条件一致的基础上，探究不同的酶解时间：20、30、40、50、60min下提取率的变化情况。从图8可以看出，在时间范围为20到50min范围内，提取率与提取时间呈正相关性，但是，当提取时间延长到60min时，酶解的效果反而会降低，分析造成这种结果的原因，导致是因为反应时间过长溶液中的色素堆积过多，这会对酶促反应带来抑制作用且类胡萝卜素暴露在细胞外时间过长易被破坏和氧化。

(4)酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响

在其它酶解条件一致的基础上，探究酶浓度对蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响作用。本试验设置5个酶浓度(质量分数)，分别为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％，保持其它提取条件一致的基础上，即提取温度为50℃，ph为4、酶解的时间为50min，探究不同的酶浓度对于提取效果的影响，试验结果见图9。由图9结果可以看出，酶的添加浓度的大小对于酶解效果的影响不是特别显著，其中提取率最低值为2667.12μg/g，最高值达2909.79μg/g。由下图曲线的变化趋势可以看出在0.2％～0.5％这一酶浓度范围内，提取率与酶浓度呈正相关的趋势，当继续增加酶的浓度为0.6％时，提取率反而有所降低，降到2898.64μg/g。这是因为0.5％的酶添加量已经足够整个反应体系中蛹虫草子实体粉末的细胞壁破裂，酶的浓度过大不能够增加反应底物的数量，因而提取率不会有明显变化。

2.2.5响应面试验结果

为优化复合酶共同作用提取蛹虫草当中的类胡萝卜素的工艺条件，根据上面单因素试验开展的结果，选取ph、酶解时间、酶解温度三个因素为响应面试验的三个因素，设定为三水平，分别为ph＝3、4、5；酶解温度为40、50、60℃；酶解时间为40、50、60min，根据box-behnken试验设计原理共设计17个试验点，以提取率为响应值开展试验。其中，响应面的试验设计与结果见表4，回归方程方差分析结果见表5；各因素间相关性试验结果见图10、图11、图12。

表4响应面试验设计与结果

表5回归方程方差分析结果

注1):**p＜0.01,极显著；*p＜0.05,显著。

由表4的实验组合和结果进行分析得到表5的显著性和方差分析表，采用design-expert10.0软件对实验数据进行多项式回归分析，经拟合分析得到综合得率y对自变量a、b、c的回归方程：y＝3.74-0.36a-0.37b+0.18c+0.27ab-0.014ac-0.13bc-0.69a²-0.52b²-0.30c²。该模型的相关系数r²＝0.9852，p<0.0001，表示该试验模型极度显著。通过软件求解回归方程，得到蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取条件为：提取ph＝3.8、酶解时间为43.62min、酶解温度为52.41℃，在该提取条件下提取到的蛹虫草类胡萝卜素理论上可达到3888.34μg/g。由表5响应面分析试验方差分析结果可知该模型p<0.01，说明该试验回归模型达到极度显著水平。除此之外，失拟项p＝0.5927>0.05，表明该拟合方程能够很好的说明实验结果。通过表中各因素来源的方差分析可以得到显著性检验结果，模型一次项中ph、酶解时间、酶解温度都是极显著的，在二次项中a²、b²、c²也是极显著的，在交互作用影响当中只有ph和酶解时间的交互是显著的。另外，根据一次项系数的绝对值可以看出各因素对蛹虫草类胡萝卜素提取得率的影响主次顺序为：酶解时间＞酶解ph＞酶解温度。由图10结果分析可知，当固定酶解温度探究ph与酶解时间的交互作用时，等高线图呈现明显椭圆状，表明ph与酶解时间的交互作用十分明显。另外，响应曲面结果表明蛹虫草类胡萝卜素的提取率随着ph和酶解时间的增加呈先上升后迅速下降的趋势，其中当ph＝4、酶解时间为50min时，提取率达到最大；图11结果分析，当固定酶解时间探究ph与酶解温度之间的交互作用时，等高线中心部分呈现圆形，表明两种单因素之间的交互作用不显著。另外，响应曲面的走向也呈现先上升后缓慢下降的趋势，可能是因为ph和酶解温度过高影响酶的活力，从而导致提取率的降低；图12结果分析表明，ph不变的情况下，酶解时间和酶解温度之间的交互作用，由等高线图可以看出是不太显著的但是仍然有很强的相关性，响应曲面结果分析可以得出随着酶解时间和酶解温度的增加，提取率的变化呈先上升后下降的趋势，可能是因为酶解温度和时间在一定范围内达到最高值时，酶的活性会降低从而影响到提取率，另外提取时间过长色素堆积过多也会对酶促反应造成抑制。

2.2.6验证性实验结果

对响应拟合的方程通过软件求解回归方程，得到蛹虫草类胡萝卜素的最佳提取条件为：提取ph＝3.8、酶解时间为43.62min酶解温度为52.41℃。考虑到实际操作的可行性，将提取条件设定为ph＝4，酶解时间为45min，酶解温度为50℃，在此条件下开展提取试验，提取到的蛹虫草类胡萝卜素含量为3796.23μg/g，与理论预测值相近，偏差较低，说明该回归方程曲线能够很真实地反应各单因素对于蛹虫草类胡萝卜素提取率的影响同时也验证了用该模型来筛选提取蛹虫草类胡萝卜素的最佳工艺条件是可行的。

2.3本发明采用纤维素酶和果胶酶两种生物酶协同提取蛹虫草类胡萝卜素，以温度、ph、时间、酶浓度等单因素为考察指标，采用四因素三水平响应面方法优化提取工艺，试验表明提取蛹虫草类胡萝卜素的最佳工艺为：酶解温度52.41℃、酶浓度0.5％、ph3.8、时间43.62min，蛹虫草类胡萝卜素理论值为3888.34μg/g。该方法下获得的产品含量高于现已报道的其他方法。其中包括张志军等采用的酸热提取法，提取率为2158μg/g、张明亮等的超声辅助提取法，提取率仅为1990.4μg/g以及唐鸿标等采用的传统溶剂浸提法，得率为2259μg/g。本试验采用生物酶协同丙酮和乙醇两种有机试剂提取蛹虫草类胡萝卜的得率超过了目前报道的其他方法的提取率。分析认为一是酶对细胞壁的降解作用，增加了胞内色素溶出率；二是试验用丙酮和乙醇混合液作提取剂，不同极性有机溶液的协同作用增加了蛹虫草类胡萝卜素的溶解度。

3、蛹虫草类胡萝卜素的纯化及鉴定分析

经生物酶辅助提取获得的蛹虫草类胡萝卜素粗品，浓缩干燥之后较粘稠，存在不好保存使用等问题。针对这一情况，本发明拟计划对色素粗提液进行进一步的分离纯化，以期收获纯度更高的蛹虫草色素。考虑到纯化可能会造成产品本身的损耗，本发明还对纯化后的蛹虫草类胡萝卜素开展了显色反应检验、超高效液相色谱和质谱分析以及傅里叶红外光谱扫描分析，以期对该色素纯化物进行进一步的鉴定分析。

3.1材料与设备

3.1.1材料与试剂

表6主要试剂与材料

3.1.2仪器与设备

表7主要仪器与设备

3.2试验方法

3.2.1蛹虫草类胡萝卜素粗提样品的制备

本发明中需纯化的蛹虫草胡萝卜素粗提物均按照2.2.6中最佳提取方法下获得。

3.2.2蛹虫草类胡萝卜素粗提物的纯化

(1)大孔吸附树脂的活化

经试验前期查资料发现，hp系列大孔吸附树脂十分适合提取分离中草药中水溶性及脂溶性成分。所以本试验中选用hp20大孔吸附树脂来开展蛹虫草类胡萝卜素的的分离纯化工作。树脂的活化步骤见面流程图13。

(2)上样洗脱及鉴定

用二氯甲烷将蛹虫草类胡萝卜素粗品溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的样液，上样使其与大孔树脂进行充分吸附。分别配制浓度为10～90％的乙醇洗脱溶液，每一浓度下洗脱4倍柱体积，整个过程利用恒流泵控制洗脱速度为2bv/h。洗脱开始，收集每一浓度下的洗脱液于洁净干燥的10ml试管中，最后在445nm下测定各管洗脱液的吸光值。根据紫外光谱吸收结果将吸光值较高的洗脱液收集起来，经旋转浓缩干燥处理之后置于超低温冰箱中冻干备用。

3.2.3蛹虫草类胡萝卜素纯化物的鉴定

(1)类胡萝卜素的显色反应

含有类胡萝卜素的物质能够与浓硫酸或者三氯化锑的氯仿溶液发生颜色反应，生成蓝色或者绿色物质。若样品为单环氧化合物则颜色呈黄绿色，若其为双环氧化合物则为蓝绿色，即类胡萝卜素的特征反应。试验方法如下：将纯化之后的蛹虫草色素物质用甲醇溶解，然后往其中加入含浓硫酸的氯仿溶液(1：5)，静置10min后，观察溶液颜色变化；三氯化锑的氯仿溶液操作同上。

(2)uplc-hrms组分检测

取纯化后冷冻干燥的色素用纯甲醇溶解，此时可视情况使用超声波辅助使其溶解，配制好的色素溶液过0.22μm滤膜避光备用。

超高效液相色谱分析条件如下：watersc18，反相色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，柱温30℃，流速0.25ml/min，进样量2μl。洗脱梯度程序：a相为有机相(纯甲醇溶液)，b相为0.1％甲酸溶液。0min，100％a相；4min，70％a相；16min，45％a相；25～28min，10％a相；32～40min，45％a相，检测波长为445nm。

高分辨质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子模式，干燥温度：450℃，扫描范围m/z：50～1000，毛细管电压5500v，干燥气流速：40l/min，dad检测波长范围为380nm～600nm。

(3)傅里叶红外光谱检测

本发明采用溴化钾压片法进行红外光谱检测，将干燥后的色素样品与溴化钾按1:100比例混合，研磨成均匀干燥的粉末，压片后立即将溴化钾透明片置于500～4000cm-1波长范围内进行红外光谱扫描，以检测其红外吸光情况。

3.3试验结果与分析

3.3.1蛹虫草类胡萝卜素大孔吸附树脂纯化结果

蛹虫草类胡萝卜素粗产品经大孔树脂吸附之后，按照张晓君等的实验方法采用浓度为10～90％的乙醇溶液再对其进行解吸附。收集各浓度下的洗脱液，每个浓度各5管，最后在445nm下检测每管洗脱液的紫外光谱吸光值od445nm，结果见图14。其中，每一洗脱浓度范围内洗脱液的od445nm最大值已在图中用红色标志标识。结果显示，乙醇浓度在10％到60％这个范围内，洗脱效果呈明显变好趋势，其中乙醇浓度为60％下的洗脱液od445nm达到峰值。乙醇浓度上升至70％时，洗脱液的od445nm变化不大，但90％乙醇洗脱液的颜色大幅变浅甚至趋于无色。究其缘由，是因为蛹虫草类胡萝卜素本身的极性较一般类胡萝卜素大，其分子结构中应该含有亲水性官能团，因此当大孔树脂上吸附的色素物质被洗脱完全后，即使扩大洗脱剂浓度，解吸附过程已然被抑制并终止。总的说来，浓度为60％的乙醇溶液的解吸附能力十分适合本色素的分离纯化。

3.3.2蛹虫草类胡萝卜素的鉴定结果

(1)显色反应结果

纯化过后的蛹虫草色素溶液体系一遇浓硫酸溶液时，两相交接处颜色立即呈现明显的蓝绿色；与三氯化锑的氯仿溶液作用时，接触液面颜色变浅，呈青绿色。特征颜色变化均证明蛹虫草色素纯化物符合多烯烃类胡萝卜素的一般特征。

(2)液质联用分析结果

蛹虫草类胡萝卜素纯化物的色谱扫描结果如图15。纯化后的色素并非单一组分，主要含有5个主峰，分别编号为1～5号。由图可知各峰间的分离度较好，均大于1.5，即表明该色谱条件适用于蛹虫草色素组分的有效分离。各组分的保留时间及质谱结果见表8，其中精确质量数均在正离子[m+h]+模式下测得。通过精确质量数以及二级特征碎片离子峰比对分析，发现4号峰同dong等鉴定的色素组分cordyxantin-ⅲ基本一致，可以判定两者为同一组分。另外，2、3和5号峰的二级质谱ms/ms中均存在m/z为89.0593和301.0715的碎片离子，这表明三组此三种成分极大可能为同一类物质。本试验中还发现一种分子质量数较大的新物质峰1，其m/z为629，二级离子碎片中也含有m/z为301.0715左右的物质。总体看来，这5种组分在总的色素纯化物中含量占到66.24％。其中4号峰含量最高，它在这5种主要组分中含量占比超过半数。利用二极管阵列检测器检测这5种组分在380～600nm范围内的紫外吸收情况见图16，由图可知这5种组分均出现类胡萝卜素的紫外特征吸收峰即呈三指峰状，由一个主峰和两个肩峰组成，最大吸收峰均出现在波长为445nm附近。各组分正离子ms/ms质谱分析图见图17。

表8uplc图中主成分的保留时间及相对含量分析

(3)傅里叶红外光谱图结果分析

图18是蛹虫草色素纯化物在500～4000cm^-1波数范围内红外扫描结果。该色素样品主要在3410.97cm^-1处有明显-oh峰；分别在2853.74和2830.38cm^-1处有明显的c-h振动峰，符合类胡萝卜素的特征吸收峰；在1632.50和1565.31cm^-1两处具有较强的c＝c烯键伸缩振动；在1000～1300cm^-1范围内，出现明显c-o单键振动峰；在863.38cm^-1处出现较强吸收，说明该色素物质中存在多烯结构。综上，该色素的红外光谱结果符合类胡萝卜素的基本特征。

3.4小结及讨论

本发明首先采用大孔树脂对蛹虫草类胡萝卜素粗品进行纯化分离，再联合紫外可见光光谱、高效液相色谱、高分辨质谱以及红外光谱等分析手段共同对色素纯化物的结构以及组分进行鉴定，结果如下：

(1)利用大孔吸附树脂与色素纯化物中各组分间范德华力大小的不同从而完成吸附-解吸附过程，实现色素分离纯化。选择不同浓度洗脱剂进行洗脱，根据洗脱液颜色深浅变化最终筛选出浓度为60％的乙醇溶液作为最佳洗脱剂，在此浓度下洗脱出的色素溶液颜色最深，吸光值亦最大；

(2)对色素纯化物开展颜色反应实验、光谱以及质谱分析。证实该色素纯化物具有类胡萝卜素的一般特征，在本发明中称之为蛹虫草类胡萝卜素。该色素物被分离出5种主要成分，含量为66.24％。组分1～5的精确质量数分别为m/z629.1862，m/z525.4265，m/z495.3362，m/z523.2778，m/z537.1624。其中组分4的含量最多且与已报道的色素cordyxanthin-ⅲ的二级碎片离子峰基本一致。又cordyxanthin-ⅲ已被证实是来源于蛹虫草的独有色素，因此可以大胆猜测该组分的存在或许正是导致蛹虫草类胡萝卜素拥有较好水溶性的一大缘由。为验证这一猜想，可以考虑通过制备液相先获得单一组分再通过核磁共振分析等手段开展深入的结构鉴定分析。

(3)对纯化后的色素进行鉴定后，不难发现蛹虫草子实体的种类和来源的不同造成了色素组分及结构的差异。闫喜涛等用人工培养的蚕柞蛹虫草提取出了叶黄素成分，但本试验中却未发现叶黄素；dong等从大米培养基来源的蛹虫草子实体中纯化分离出了cordyxanthinⅰ～ⅳ四种成分；陈策等人还在人工培养的寄主蚕蛹及其子实体中发现了玉米黄质。毋庸置疑，这些来源的蛹虫草胡萝卜素比普通类胡萝卜素具有更好的水溶性。

4、富含类胡萝卜素蛹虫草饼干产品的开发

本发明采用食药用真菌蛹虫草为原料研制出一款富含类胡萝卜素蛹虫草饼干，主要适用于上班一族及用眼需求较强等人群。目前该产品的开发已经完成前期基础配方设计以及相关质量标准的制定工作，但尚未进入产品稳定性探究以及临床试验等阶段。

5.1试验材料与仪器

5.1.1试验材料与试剂

表14主要材料与试剂

5.1.2试验仪器与设备

表15主要试验仪器与设备

5.2试验方法

5.2.1富含类胡萝卜素蛹虫草饼干制作工艺的确定

本产品前期配方主要通过感官评分的高低来确定。目前工艺配方已经确定并形成专利成果。该产品的主要烘烤工艺流程如下：

(1)原辅料的预处理。鲜蛹虫草子实体与培养基一起置于恒温干燥箱中，温度设为60℃，时间12h。用中草药超微粉碎机对全干后的原料进行初步粉碎，再手工过筛得到蛹虫草全粉。在避光、低温环境(-4℃)下保存原料粉备用；

(2)面团调制。将一定量的黄油置于容器中，在室温下放置至其软化或者水浴加热，以加快其软化速度。待黄油充分融化之后，加入木糖醇，打发至糖油不分离状态，此时糖油混合物略微发白，体积变大，形成顺滑纹路；将全蛋液加入糖油混合体系中，再次打发混匀；依次将其它材料加入容器中拌匀，整个过程采用从下往上翻拌的手法反复揉捏面团直至面团表面出油且达到不粘手套的状态即得到虫草饼干面团，面团静置10min；最后将面团置于模具中塑型，放入冰箱中冷冻30min；

(3)成品。取出(2)中冷冻好的饼干胚，均匀切片。将烤箱调好上下火温度后，预热。将烤箱设置成上下烤模式，上烤温度160℃、下烤温度110℃，烘烤时间为10分钟至饼干表面颜色在虫草粉颜色的基础之上呈现微微发黄，出锅冷却之后即可制得成品。

(4)冷却与包装。烤制成熟的产品需要使其完全冷却才能具有良好的口感，本产品的包装形式拟采用真空避光包装。

5.2.2感官评定标准

本发明介绍了以蛹虫草全粉为原料研制的蛹虫草功能性饼干，其中产品的基础配方设计以感官评定为评价标准。感官质量的评定严格按照国家标准gb7100-2015进行，优选10名经过专业感官评分训练的人员对饼干的形态、色泽、香气和味道、松脆度五个方面进行综合评分，总评分100分，其中形态、色泽、香气和味道、松脆度各占25分，具体评分标准见表16。

表16蛹虫草功能性饼干感官评分标准

5.2.3蛹虫草功能性饼干基础配方设计

本产品原料蛹虫草采用的是小麦培养基，蛹虫草菌成熟之后会使得培养基中残留有一些矿物质元素和尚未消耗殆尽的营养成分等。若蛹虫草子实体成为唯一原料粉制成饼干的话，产品具有的蛹虫草独特风味会过于浓郁且有后苦味，考虑到大众的接受度问题，因此本试验决定将其小麦培养基一同粉碎成粉作为原料使用，既中和子实体的不适风味又增添小麦的香味。经前期试验确定，子实体与培养基粉末按比例为1：3混合使用时产品口感较佳。由于目前没有现行有效的功能性食品相关营养含量执行标准，因此本产品参照特医食品的标准进行营养素配方设计。除此之外，考虑到产品受众人群的特殊营养需求以及工作性质，本产品在严格掌握碳水化合物、脂肪、蛋白质以及膳食纤维四大主要营养素比例的基础之上，还选用木糖醇作为甜味补充剂。最终蛹虫草小麦饼干的基础配方确定为：低筋面粉100g、奶粉10g、鸡蛋全液30g、黄油40g、木糖醇40g、小苏打2g、蛹虫草全粉10g(过80目)。根据预实验中感官评价结果发现蛹虫草粉末粒径，蛹虫草全粉的添加比例、木糖醇以及小苏打这四个单因素对产品口感的影响十分大，因此需要单独对这四个单因素开展探究。

(1)蛹虫草粉末粒径大小的单因素试验

固定基本配方不变的条件下，即：低筋面粉100g、奶粉10g、鸡蛋全液30g、黄油40g、木糖醇40g、小苏打2g、蛹虫草全粉10g，其中子实体与培养基按1：3比例混合，探究蛹虫草子实体以及培养基粉末粒径为60目以下、40～60目、80～100目、120～140目、160目五个水平下对饼干产品感官品质的影响；

(2)蛹虫草全粉添加比例的单因素试验

固定基本配方不变的条件下，探究蛹虫草全粉的添加比例为10％、20％、30％、40％、50％五个水平下对饼干产品感官品质的影响；

(3)木糖醇添加量的单因素试验

固定基本配方不变的条件下，探究木糖醇的添加量为25g、30g、35g、40g、45g五个水平下对饼干产品感官品质的影响；

(4)小苏打添加量的单因素试验

固定基本配方不变的条件下，探究小苏打的添加量为0.50g、1.00g、1.50g、2.00g、2.50g五个水平下对饼干产品感官品质的影响；

(5)蛹虫草功能性饼干正交优化试验

为优化蛹虫草功能性饼干的制作工艺，得到口感酥脆、色泽诱人、接受度较高的饼干产品，试验采用正交实验设计对产品基本配方进行优化以确定最佳工艺配方。根据单因素试验结果最终将蛹虫草粉末的粒径确定为80～100目，蛹虫草粉末在此目数范围内粗细适宜，得到的感官评分最高。选取面粉与蛹虫草粉末的添加比例(a)、木糖醇的添加量(b)、小苏打的添加量(c)三个因素进行正交试验，通过三因素三水平试验设计来确定产品最佳工艺配方。蛹虫草饼干配方正交试验因素水平表见表17。

表17蛹虫草功能性饼干l9(33)正交试验因素水平表(以面粉100g计)

5.2.4蛹虫草功能性饼干的质量标准控制

(1)质构特性测定

质构特性是衡量饼干类产品质量的一大标准，本试验中采用ta-xtplus型质构仪对最优配方下的产品进行质构分析，其中质构特性测定方法按照表18进行，结果测定三次取平均。

表18蛹虫草功能饼干质构分析条件

(2)理化指标测定

①水分含量的测定

按照食品安全国家标准gb5009.3-2016中的方法执行，根据该产品的性质及属性，采用直接干燥法测定其水分含量。

②灰分的测定

按照食品安全国家标准gb5009.4-2016中的方法执行。

③重金属含量测定

由于本产品添加有食用菌蛹虫草，则需十分注重产品中重金属的残留。本试验对成品选取常见的6种重金属铅、镉、汞、砷、铬、镍进行测定。其中测定方法分别按照食品安全国家标准gb5009.12-2017、gb5009.15-2014、gb500917-2014、gb500911-2014、gb5009123-2014、gb5009138-2017执行。

④酸价测定

按照食品安全国家标准gb5009.229-2016中方法执行。

⑤过氧化值测定

按照食品安全国家标准gb5009.227-2016中方法执行。

(3)产品营养指标的测定

①脂肪含量的测定

按照食品安全国家标准gb5009.6-2016中的索氏抽提法执行。

②蛋白质含量的测定

按照食品安全国家标准gb5009.5-2016中的凯氏定氮法执行。

③碳水化合物含量的测定

按照食品安全国家标准gb5009.7-2016中的直接滴定法执行。

④膳食纤维含量测定

按照食品安全国家标准gb5413.6中方法执行。

⑤产品总类胡萝卜素色素含量的测定

按照食品安全国家标准gb5009.83-2016中方法执行。

(4)产品微生物指标测定

①菌落总数测定

按照食品安全国家标准gb4789.5-2016中方法执行。

②大肠杆菌菌群总数测定

按照食品安全国家标准gb4789.3-2016中方法执行。

③霉菌总数测定

按照食品安全国家标准gb4789.15-2016中方法执行。

④致病菌检测

按照食品安全国家标准gb29921-2013中方法执行。

5.2.5数据统计与分析

试验中的图表制作采用excel软件完成，数据分析采用spss22分析软件。

5.3试验结果与分析

5.3.1单因素试验结果

(1)蛹虫草粉末粒径的确定

由于蛹虫草培养基的添加，小麦基质会极大增加产品的粗糙感，因而需要对蛹虫草全粉进行过筛处理，探究其最佳的粗细度即粉末粒径，其中粒径试验结果见图19。由下图可知粒径在80～100目之间时，产品感官得分最高。分析其原因，粉末粒径的大小不仅会影响口感，同时也会影响产品的颜色以及外观等。粒径越小，产品呈现的颜色越浅；粒径太大容易引起产品内部气泡的形成，太小容易造成黏牙的口感。因此把握一个合适的粒径大小是感官得分高低的关键。

(2)蛹虫草全粉添加比例的确定

蛹虫草子实体和其培养基按照1：3的比例混成蛹虫草全粉使用，其他以面粉基质为100g来计。保持其它变量一定的情况下，蛹虫草全粉的添加量对产品感官评定结果影响见图20，由图可知，100g面粉中添加20g蛹虫草全粉制得的产品更受喜爱。分析其原因，蛹虫草全粉添加过少时饼干的香味不足，颜色偏浅；但一旦蛹虫草全粉增加，其中的子实体粉末也会增多，特殊的后苦味也会加重且饼干表面颜色变得更加深，光泽度不佳。最终蛹虫草全粉的添加量定为20g(以100g面粉计)，在此添加量下蛹虫草功能性饼干的接受度更高。

(3)木糖醇添加量的确定

尽管当前还没有确切的证据能够说明糖尿病与amd病变之间的相关性，但是为照顾一部分患有糖尿病的人群，本产品的配方选择木糖醇来替代一般性绵白糖同时也避免美拉德反应的过度发生。由图21可以看出，当木糖醇的添加量在35g以下时产品感官得分不高，木糖醇的甜味难掩蛹虫草自身独特的风味，后苦味较明显。然而本产品作为一款真菌功能性饼干，专业感官评分员认为稍微保留其独有香味以及微微后苦味十分必要，因此木糖醇添加量过高后感官得分反而降低。

(4)小苏打添加量的确定

本产品定位为酥性饼干，酥脆度是考查其感官品质的一大因素。小苏打的添加使饼干在烘焙过程中能够充分膨胀进而形成气孔，最后让饼干的内部结构更加蓬松，口感更酥脆。其添加量对于感官评分的影响见图22，由图可知，小苏打添加量为1.5g(以100g面粉计)时，饼干感官得分最高。小苏打过少不利于饼干内部气孔的形成，因而成品较干瘪，口感偏硬；而当小苏打用量过多时喜爱度亦不高，烘烤过程中小苏打起作用释放过多的二氧化碳气体，使得饼干内部过度膨胀，形成大量气孔，最终产品口感过酥且外表面有明显气孔。

5.3.2正交试验结果

根据单因素试验结果选取蛹虫草全粉添加比例、木糖醇的添加量以及小苏打的添加量三个因素进行正交试验，按照表17中设计的正交试验因素水平方案开展，结果见表19。由该表可知，影响蛹虫草功能性饼干感官得分的主次因素顺序为：b(木糖醇添加量)>c(小苏打添加量)>a(蛹虫草全粉添加比例)，即木糖醇的添加量对产品的感官品质影响最大，其次是小苏打的用量，最后是蛹虫草全粉的添加比例。产品最佳工艺组合为a1b3c3，分别为：蛹虫草全粉添加比例1:10、木糖醇40g、小苏打2g。在此工艺配方下制得的蛹虫草功能性饼干感官品质较好。

表19蛹虫草功能性饼干l9(33)正交试验结果与分析

5.3.3正交试验最优组合验证试验

按照正交试验最优组合a1b3c3进行3次平行试验，即：奶粉10g、鸡蛋全液30g、黄油40g、木糖醇40g、小苏打2g、蛹虫草全粉10g，最终蛹虫草功能饼干的感官评分为88分；在此配方下产品口感酥脆、不粘牙，具有适宜蛹虫草独有香味，表面光滑，内部结构完整，色泽均匀、无明显裂痕。实际的产品展示见图23。

5.3.4蛹虫草功能性饼干质量标准控制

(1)产品质构特性检测结果

选取最优配方下烘焙的蛹虫草功能饼干作为研究对象，测定其产品质构特性，选取硬度、内聚性以及咀嚼性三者为考察指标。硬度是酥性饼干类产品考察的必不可少的指标，它表示着用质构仪测定时第一次压缩时的最大峰值；内聚力代表维持食品形态内部所需要的力，是评价产品酥脆的一大重要指标，内聚性越小标志着产品越酥脆；咀嚼性直接与消费者的感官评分相关，反映食物在口腔中从固体状态到可吞咽状态咀嚼所做功的大小，测定结果如表20。

表20蛹虫草功能饼干质构特性分析结果

(2)理化指标测定结果

由表21可知，蛹虫草功能饼干的系列理化指标检测均符合国标规定。其中各项重金属含量结果均在国家标准允许范围内，即表明蛹虫草真菌全粉的添加量适宜，并不会造成重金属超标等不良影响。

表21理化指标检测结果

(3)主要营养成分测定结果

鉴于该产品的受众是处于工作年龄阶段的人群，因此该产品首先贯彻了高蛋白质、低脂肪的宗旨。产品配方按总重量100g计算，能量按每100g产品中碳水化合物，脂肪，蛋白质和膳食纤维各自含量乘以相应的能量系数计算。其中碳水化合物和蛋白质的能量系数为17kj/g，脂肪37kj/g，膳食纤维按照碳水化合物能量系数的50％来计。从表22产品主要营养检测结果来看，碳水化合物、蛋白质、脂肪三大营养素的供能比分别为42.5％、18％和35.4％，基本符合中国肠内肠外营养学会(cspen)的指南要求。此外，本产品的蛋白质含量为1.06g/100kj，符合特医食品的蛋白质标准(≧0.7g/100kj)。该产品含有蛹虫草真菌，根据2009年卫生部《关于蛹虫草作为新资源食品获得批准的公告》，成人每天食用蛹虫草应不超过2g。本产品经配方设计成型后，每片饼干的质量约3g，即每片饼干约含蛹虫草全粉0.3g。此外，who认为成年人每天应摄取10mg的类胡萝卜素，这样才能起到预防眼部视力损伤的作用。因此，本发明建议相关人群每天单独或配合食用本品5片，本品对婴幼儿和食用菌过敏者禁用。

表22主要营养成分检测结果

(4)微生物指标检测结果

本试验按照国标方法对蛹虫草功能性饼干进行了微生物检测，结果见表23。由表可知，该产品的微生物检测结果均符合国家标准，其具备良好的食用安全性。

表23蛹虫草功能性饼干微生物检测结果

5.4本发明主要以蛹虫草子实体以及其培养基为原料设计开发一款功能性产品，旨在充分发挥蛹虫草真菌的生物活性。本产品的适用人群定为上班一族，考虑到上班一族的工作性质，最终选取烘焙饼干这一产品形式。以感官评分为指标，通过单因素以及三因素三水平正交试验进行产品基础配方设计。试验结果如下：

(1)蛹虫草功能饼干的最优基础配方为：蛹虫草全粉子实体与培养基比例1:10、木糖醇40g、小苏打2g、低筋面粉100g、奶粉10g、鸡蛋全液30g、黄油40g、蛹虫草全粉粒径为80～100目。在此配方下烤制的蛹虫草小麦饼干感官得分最高，饼干大小厚薄均匀，颜色鲜艳且保留有蛹虫草独特的香味，口感酥脆不黏牙；在考察的三个影响因素中，对产品感官得分影响的大小顺序为b(木糖醇添加量)>c(小苏打添加量)>a(蛹虫草全粉添加比例)；

(2)经质构特性分析最优配方下得到的蛹虫草功能饼干，硬度达1377.5±30.57g，内聚性0.226±0.018，咀嚼性为2.246±15.95g，符合酥性饼干的感官要求。另外，其理化及微生物检测结果均符合国标要求。主要营养成分分析结果显示每100g饼干中含有脂肪22.4g、蛋白质24.8g、碳水化合物58.5g、膳食纤维11.4g，总能量达2341.8kj/100g。三大营养素的供能比也符合中国肠内肠外营养学会(cspen)指南要求。本产品中未额外添加类胡萝卜素强化剂，成品中总类胡萝卜素含量达67.9mg/100g。

6、通过实验探究发现生物酶辅助提取法对于蛹虫草子实体类胡萝卜素从胞内溶解出来具有更高的效率和适用性。因色素物质性质特殊，故辄突出提取溶剂筛选这一步骤的重要性。当然，原材料来源的不同也是影响得率的重要因素。

通过对本试验中所提取的色素进行结构鉴定，综合分析后确定其为类胡萝卜素类物质。其中该色素组分中被鉴定出5种主要物质，经一、二级碎片离子比对确定第4组分为已报道的cordtxanthin-iii且该组分含量最高，因此可以大胆猜测该组分可能就是导致蛹虫草色素水溶性较强的原因。另外，其它4组分中均发现了类似的二级碎片离子，但是在图谱库中尚未找到与之匹配的物质。鉴定部分存在的不足之处是没有对色素物质中5种主成分进行分离、分析，要将其完全分离并鉴别出来，还需进一步研究。

本发明从理论研究和实际应用两个方面对蛹虫草类胡萝卜素进行了研究，研制出了富含类胡萝卜素蛹虫草饼干。本产品的研制旨在充分利用蛹虫草的生物活性价值。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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